IMUNOFLUORESCENCE
Mgr. Petr Bejdák
Ústav klinické imunologie a alergologie
Fakultní nemocnice u sv. Anny a Lékařská fakulta MU
IMUNOFLUORESCENCE
Luminiscence
jev, při kterém látka emituje záření po absorpci excitačního záření
(fotoluminiscence) nebo při chemické reakci (chemiluminiscence)
fluorescence
emise záření krátce po excitaci (10-8 až 10-5 s)
Fotoluminiscence
fosforescence
emise záření trvá delší dobu (10-2 s až dny)
IMUNOFLUORESCENCE
Fluorescence
látka po absorpci excitačního záření uvolňuje emisní záření o delší
vlnové délce (nižší energii)
excitovaný stav
základní stav
Emise
Absorpce
Vnitřní
konverze
IMUNOFLUORESCENCE
Schéma fluorescenčního mikroskopu
IMUNOFLUORESCENCE
Fluorescenční mikroskop
Zdroj světla – rtuťová výbojka, LED dioda
Excitační filtr - propouští pouze část spektra potřebnou pro excitaci
fluorescence a zabraňuje průchodu záření v oblasti emisní vlnové
délky, které by vytvářelo pozadí
Emisní (bariérový) filtr - propouští pouze emisní část spektra a
zabraňuje průchodu excitačního záření
IMUNOFLUORESCENCE
přímá
Imunofluorescence (IF)
nepřímá
Přímá IF
detekce antigenu, vazba konjugátu přímo na antigen
Nepřímá IF
detekce protilátek, probíhá ve 2 krocích:
1. protilátky z testovaného séra se navážou na antigenní substrát
2. na tyto protilátky se potom váže konjugát (specifický k lidským
imunoglobulinům - IgG/IgM/IgA)
IMUNOFLUORESCENCE
PŘÍMÁ NEPŘÍMÁ
IMUNOFLUORESCENCE
Konjugát
- protilátka s navázaných fluorescenčním
barvivem (fluorochromem)
- nejčastěji používaný flourochrom je FITC
(fluoresceinizothiokyanát) excitační/emisní
vlnová délka 495/520 nm
(emituje zelené světlo)
- u nepřímé IF – konjugát specifický k
lidským imunoglobulinům ve třídách IgG /
IgM / IgA
- pro některá autoimunitní onemocnění
má klinický význam výskyt autoprotilátek
v určité izotypové třídě (př. celiakie - IgA)
IMUNOFLUORESCENCE
Využití přímé IF
- průkaz antigenu v tkáňových řezech nebo dalších biologických
vzorcích
-rychlý průkaz patogenů ve sputu nebo bronchoalveolární laváži
Využití nepřímé IF
-průkaz specifických protilátek, nejčastěji autoprotilátek
IMUNOFLUORESCENCE
Autoprotilátky detekované nepřímou IF
1. orgánově nespecifické
- antinukleární (ANA)
- antimitochondriální (AMA)
- antiendomysiální (EMA)
- proti cytoplazmě neutrofilů (ANCA)
- proti retikulinu (RET)
- proti hladkému svalu (ASMA)
2. orgánově specifické
- proti parietálním buňkám žaludku (GPC)
- proti bazální membráně glomerulů (GBM)
atd.
IMUNOFLUORESCENCE
Antigenní substráty používané při nepřímé IF
HEp2 (Human Epithelial)
- jádro (ANA), cytoplazma (AMA, cytoskelet...)
- odvozeny od linie HeLa (karcinom děložního čípku)
- rychle se dělící buňky, v mitóze pozorovatelná chromatinová
destička - důležitý znak pro odlišení jednotlivých typů ANA
Neutrofilní granulocyty – ANCA
Crithidia luciliae – prvok,
detekce protilátek proti dsDNA
LKS (liver, kidney, stomach)
– kombinace 3 potkaních tkání
k detekci AMA, ASMA, GPC, RET...
Řez opičího jícnu – EMA
IMUNOFLUORESCENCE
ANA (autoprotilátky proti jaderným antigenům) - HEp2 buňky
typy fluorescence (antigen):
-homogenní (dsDNA, histony, nukleozómy a jiné DNA-vazebné
proteiny)
- nukleární membrána (laminy, proteiny jaderných pórů)
- granulární=zrnitý=skvrnitý (SS-A, SS-B, Sm/RNP...)
- jadérkový=nukleolární (Scl-70 = DNA-topoizomeráza I)
- centromerový (centromera)
- ojedinělé tečky (coilin p-80)
- četné tečky (glykoprotein Sp 100)
- PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen = Cyclin I)
Antigeny v cytoplazmě HEp2 – mitochondrie, cytoskelet (aktin,
vimentin...), Jo-1 (hystidyl-tRNA syntetáza), lysozómy, peroxizómy,
Golgiho komplex, endoplazmatické retikulum, mitotický aparát
IMUNOFLUORESCENCE
ANCA (autoprotilátky proti cytoplazmě neutrofilů), typy:
-perinukleární (pANCA), antigenem je MPO (myeloperoxidáza)
-cytoplazmatická (cANCA), antigenem je PR3 (proteináza 3)
-atypická ANCA, různé antigeny (elastáza, lysozym, katepsin...)
LKS (kombinace 3 poktaních tkání – liver, kidney, stomach)
typy:
- AMA (antimitochondriální) – různé typy (častý je AMA M2 –
antigen pyruvát dehydrogenáza)
- ASMA (proti hladkému svalu) – antigen aktin
- GPC, RET aj.
EMA – autoprotilátky proti endomysiu (kde se nachází cílový
autoantigen TTG – tkáňová transglutamináza) ve třídě IgA
IMUNOFLUORESCENCE
HEp2 - ANA - typ homogenní
IMUNOFLUORESCENCE
HEp2 - ANA - typ granulární
IMUNOFLUORESCENCE
HEp2 - ANA - typ nukleolární
IMUNOFLUORESCENCE
HEp2 - ANA - typ centromerový
IMUNOFLUORESCENCE
HEp2 - ANA - typ nukleární membrána
IMUNOFLUORESCENCE
HEp2 - cytoplazma – typ AMA
IMUNOFLUORESCENCE
Neutrofilní granulocyty - pANCA
IMUNOFLUORESCENCE
Neutrofilní granulocyty - cANCA
IMUNOFLUORESCENCE
Prvok Crithidia luciliae - dsDNA
IMUNOFLUORESCENCE
Opičí jícen – EMA
IMUNOFLUORESCENCE
Potkaní žaludek – GPC
IMUNOFLUORESCENCE
Potkaní žaludek – ASMA
IMUNOFLUORESCENCE
AMA – potkaní žaludek, ledviny, játra
IMUNOFLUORESCENCE
RET – potkaní žaludek, ledviny, játra