Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Cytogenetické vyšetřovací metody Cytogenetické vyšetřovací metody Hanáková M. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CYTOGENETIKACYTOGENETIKA • Metody klasické cytogenetiky • Metody molekulární cytogenetiky Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKYMETODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY • odběr materiálu • kultivace • zpracování suspenze • pruhování / barvení chromosomů - metody 1. volby v indikovaných případech - relativně levné metody (ve srovnání s metodami molekulární cytogenetiky) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKYMETODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY • Postnatální stanovení karyotypu a získaných chromosomových abnormalit • Prenatální stanovení karyotypu • Stanovení karyotypu maligních klonů z kostní dřeně a solidních nádorů u onkologických pacientů Postupy se v detailech liší pro jednotlivé typy vstupních materiálů. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu Odběr materiálu pro účely cytogenetického vyšetření, vždy za sterilních podmínek!!! • do heparinu (nesrážlivá krev)– periferní krev, krev plodu (obv. 3 ml) • do heparinu a transportního média – kostní dřeň (obv. 1-2 ml) • do transportního média – solidní tumory, kůže (obv. 1x1 cm), choriové klky (obv. 20 mg) • bez přídavku média a dalších látek – plodová voda (obv. 20 ml) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu Odběr materiálu pro cytogenetickou analýzu a typy buněk, které jsou v konkrétním materiálu vhodné pro získání metafázních chromosomů : • periferní krev – ze žíly – T-lymfocyty • fetální krev – z pupečníku pod kontrolou UZ – nezralé T-lymfocyty • plodová voda – z amniového vaku pod kontrolou UZ - kožní fibroblasty • choriové klky – z chorionu nebo placenty - buňky choriových klků nebo placenty • kůže – z potracených plodů, kožní biopsie pacientů – kožní fibroblasty • kostní dřeň – z prsní kosti, kyčlí – prekurzory krevních buněk • solidní tumory – z nádoru – maligní buňky Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu solidní nádorperiferní krev kostní dřeň Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu choriové klky odběr plodové vody pod kontrolou ultrazvuku kůže (potracený plod, placenta) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení do kultivačního média METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení do kultivačního média Sterilní práce v laminárním boxu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava vstupního materiálu (promíchání periferní krve) METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava vstupního materiálu (promíchání periferní krve) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava vstupního materiálu (centrifugace plodové vody a odstranění supernatantu) METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava vstupního materiálu (centrifugace plodové vody a odstranění supernatantu) sediment (buňky plodu – většinou kožní fibroblasty) – nasadíme supernatant - vzorek na analýzu AFP v radiologické laboratoři, zbytek odstraníme rozplňování plodové vody do centrifugačních zkumavek plodová voda po centrifugaci – odstraňování supernatantu sediment Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava vstupního materiálu (centrifugace kostní dřeně a odstranění supernatantu) METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava vstupního materiálu (centrifugace kostní dřeně a odstranění supernatantu) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava materiálu na nasazení do média (promytí a rozstříhání kůže potracených plodů) METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava materiálu na nasazení do média (promytí a rozstříhání kůže potracených plodů) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava materiálu na nasazení do média (homogenizace solidního nádoru) METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava materiálu na nasazení do média (homogenizace solidního nádoru) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava vstupního materiálu (promytí, případně rozstříhání choriových klků) METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Příprava vstupního materiálu (promytí, případně rozstříhání choriových klků) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu periferní krev METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu periferní krev pipetování krve do kultivačního média Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu plodová voda METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu plodová voda promíchání média se sedimentem nasazení do kultivačních nádobek kultivační nádobky připravené k inkubaci v termostatu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu kostní dřeň METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu kostní dřeň pipetování kultivačního média pipetování dřeně do média Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu kůže METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu kůže Následná inkubace v termostatu. Médium se přidává až po vycestování buněk kožních fibroblastů (kontrola binokulární mikroskop). odsátí přebytečného média (jen ovlhčené dno)Přenesení kůže do kultivační nádobky Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu solidní nádory METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu solidní nádory Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu choriové klky METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení materiálu choriové klky Inkubace v termostatu přes noc v Petriho misce (v indikovaných případech dlouhodobá kultivace s nasazením analogickým jako u solidních nádorů) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu • délka kultivace - periferní krev – 72 hodin (stanovení karyotypu) - 48 hodin (stanovení ZCA) kratší doba kultivace - podmínkou je zachytit 1. buněčné dělení, později dochází k reparaci chromozomů nebo k zániku buněk s aberací - krev plodu 72 hodin (stanovení karyotypu) - plodová voda – průměrně 10 dní (stanovení karyotypu) - choriové klky – přes noc (stanovení karyotypu) - kostní dřeň – přímé zpracování buněk ihned po odběru - 24 hodin (48 hodin spec. případy) (stanovení karyotypu maligních klonů v KD) - kůže – variabilní doba růstu (průměrně 2 týdny) - solidní nádory – 1 – 2 týdny (stanovení karyotypu maligních klonů v nádorových buňkách) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu • kultivace buněk v suspenzi (periferní krev, fetální krev) • kultivace buněk přichycených na dně kultivační nádobky (plodová voda, solidní tumory, kůže) - po kultivaci pomocí roztoku trypsinu odloupneme ode dna, dále zpracováváme jako suspenzi buněk kultivace plodové vody kultivace periferní krve Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace v termostatu 37°C METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace v termostatu 37°C termostat s CO2 atmosférou speciální uzávěr kultivačních nádobek s bakteriálním filtrem – propouští CO2 kultivace plodové vody, kůže, solidních nádorů klasický termostat kultivace periferní krve, fetální krve Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace v termostatu 37°C METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace v termostatu 37°C prohlížení nárůstu v průběhu kultivace plodové vody, solidních nádorů a kůže v inverzním mikroskopu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace T-lymfocytů z periferní krve METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace T-lymfocytů z periferní krve • kultivace periferní krve v médiu s přídavkem phytohemaglutininu (PHA) = látka izolovaná z fazolu obecného (Phaseolus vulgaris) - T-lymfocyty = zralé diferencované buňky s malou spontánní mitotickou aktivitou - vlivem PHA se dediferencují (přeměna na nezralé buňky lymfoblasty, které se dělí (tzn. vstupují do mitózy!) (např. k nezralým buňkám – blastům z kostní dřeně onkologických pacientů není třeba PHA přidávat, dělí se samovolně) - význam kultivace – pomnožení T-lymfocytů - složení kultivačního média – živné látky, antibiotikum, PHA, stabilizátor pH Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY přídavek kolchicinu po kultivaci (platí pro všechny materiály) METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY přídavek kolchicinu po kultivaci (platí pro všechny materiály) • aplikace kolchicinu (alkaloid z ocúnu jesenního Colchicum autumnale) - zastavení dělení buněk v metafázi mitózy - kolchicin je mitotický jed, který specificky inhibuje dělící vřeténko a tím zastavuje dělení buněk v metafázi mitózy, kdy jsou chromosomy spiralizovány a vhodné k analýze přídavek kolchicinu k nakultivované suspenzi příklad – periferní krev inkubace s kolchicinem v termostatu 37°C Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY příprava ke zpracování (plodová voda, solidní nádory, kůže) METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY příprava ke zpracování (plodová voda, solidní nádory, kůže) přídavek trypsinu – odloučení buněk ode dna na dně je vidět nárůst fibroblastů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze periferní krev, kostní dřeň METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze periferní krev, kostní dřeň - centrifugace suspenze T- lymfocytů (periferní krev) nebo blastů (kostní dřeň) po inkubaci s kolchicinem přelití suspenze do centrifugační zkumavky před centrifugací odsátí supernatantu = kultivační médium + kolchicin po centrifugaci sediment krevních buněk připraven k hypotonizaci Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • hypotonizace - KCl (periferní, fetální krev, solidní nádory, kostní dřeň) nebo médium zředěné destilovanou vodou (plodová voda), citrát sodný (choriové klky), inkubace v termostatu, centrifugace = lýza erytrocytů (periferní a fetální krev), zvětšení objemu T-lymfocytů při zachování celistvosti buněk, uvolnění chromosomů od dělícího vřeténka, jejich rozestoupení v buňce přídavek roztoku KCl inkubace hypotonizační směsi v termostatu 37°C centrifugace Příklad – periferní krev, platí analogicky i pro ostatní typy materiálů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze při hypotonizaci a dalším zpracování choriových klků pracujeme v Petriho misce bez centrifugace, odsáváme Pasteurovou pipetou Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • fixace – získání suspenze (všechny materiály) - kyselina octová (1) : metanol (3) - náhlé a trvalé zastavení veškerých životních pochodů buňky, zlepšení barvitelnosti chromosomů, rozpuštění nečistot po centrifugaci suspenze po hypotonizaci sediment T- lymfocytů odsátí supernatantu = KCl + lyzované erytrocyty přidání fixativu (3x), po každém přidání následuje centrifugace a odsátí supernatantu = fixativ Příklad – periferní krev Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • vykapání suspenze na mokrá podložní sklíčka Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • nakapaná sklíčka se po zaschnutí suspenze suší a zapékají v termostatu při 80°C přibližně půl hodiny Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY skladování suspenzí METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY skladování suspenzí v mrazícím boxu ve zkumavkách schováváme všechny suspenze do doby než budou pacienti zhodnoceni v mrazícím boxu v mikrozkumavkách uchováváme dlouhodobě suspenze s patologickým nálezem Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • orientační barvení – zjištění hustoty suspenze pod mikroskopem barvivo Giemsa - Romanowski sušení sklíček na sušící plotýnce při orientačním barvení jsou chromosomy obarveny po celé délce – nejsou napruhovány následně doladíme hustotu suspenze, suspenze je připravena k přípravě preparátu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY vykapání suspenze METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY vykapání suspenze • vykapání suspenze na mokrá podložní sklíčka (u choriových klků suchá a nahřátá, jiný postup při kapání) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů • pruhování chromosomů 1 – inkubace preparátu v roztoku trypsinu (dochází k natrávení chromosomových proteinů) 3 – oplach ve vodě (C) A B C 2 – oplach preparátu v Sörensenově fosfátovém pufru (A), barvení barvivem GiemsaRomanowski (B) 4 – sušení sklíček na sušící plotýnce Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení / pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení / pruhování chromosomů • barvení (analýza ZCA a orientační barvení chromosomů) – Giemsovým barvivem (bez inkubace v roztoku trypsinu, obarvuje chromosomy po celé délce, viz také kapitola „Získané chromosomové aberace”) • pruhování chromosomů (analýza karyotypu, karyotypu maligních klonů) • speciální barvení – „C”, „NOR” - dovyšetření nálezů na chromosomech chromosomy s G - pruhy „C” barvení - vizualizace heterochromatinových oblastí na chromosomech Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení / pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení / pruhování chromosomů • klasická konvenční metoda barvení chromosomů (chromosomy obarveny po celé délce – lze třídit chromosomy podle velikosti a polohy centromery) • pruhovací metody (proužky na chromosomech, které umožňují individuální rozlišení jednotlivých chromosomů a chromosomových změn) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení chromosomů Příprava preparátů na ZCA se liší od přípravy preparátů na stanovení karyotypu: • materiál – periferní krev • kultivace buněk v suspenzi 48 hodin s přidáním PHA • kolchicin, hypotonizace, fixace, vykapání suspenze na sklíčka • BARVENÍ GIEMSOVÝM BARVIVEM bez inkubace v roztoku trypsinu obarvení chromosomů po celé délce Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY morfologie chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY morfologie chromosomů Chromosomové preparáty získané z různých typů vstupních materiálů se mohou vizuálně lišit Periferní krev Kostní dřeň Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY preparáty se složkou pacienta připravené k hodnocení METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY preparáty se složkou pacienta připravené k hodnocení zabalená sklíčka a složka pacienta sklíčka ve stojáncích Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu Chromosomy hodnotíme ve světelném mikroskopu při zvětšení 1000x – 1250x za použití imerzních objektivů. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop Základní části mikroskopu: Mechanické části: stativ, tubus a pracovní stolek s křížovým posunem, makro a mikrošroub, revolverový měnič objektivů Osvětlovací části: zdroj světla, kondenzor, irisová clona Optické části: objektivy, okuláry Objektiv: soustava čoček, která vytváří skutečný, zvětšený a převrácený obraz Okuláry: zvětšují obraz vytvořený objektivem, výsledkem je obraz zdánlivý, zvětšený a přímý Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop Další příslušenství: Filtry: rovnoměrně rozptylují bodové světlo žárovky ke zvýšení kontrastu Kamera, fotoaparát, počítač Údržba mikroskopu: - Ochrana před prachem (kryt) - Čištění od imerze (každý den - éter) - Pravidelné čištění optiky (servis) - Ochrana před otřesy - Ochrana před škodlivými výpary Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop Irisová clona – regulace množství světla, které přichází do mikroskopu Filtr (rozptýlení světla) Makro a mikrošroub Zdroj světla – halogenová žárovka, zapojeno na síť přes samostatný transformátor (osvětlení je zabudováno ve stativu) Objektivy (suchý a imerzní) Křížový posun Okuláry Kondenzor (pod stolkem), soustava čoček, která soustřeďuje paprsky do středu zorného pole Stolek s preparátem, opatřen měřítky k určení souřadnic na preparátu Revolverový měnič objektivů Hlavní vypínač Binokulárový tubus – slouží ke spojení objektivu a okulárů Aperturní clona – regulace množství světla, které prochází preparátem Šrouby k vycentrování zorného pole Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop Suchý objektiv – malé zvětšení (obvykle 10x) Imerzní objektiv – větší zvětšení (100x) Zvětšení objektivu Numerická apertura Mezi čočkou objektivu a sklíčkem je vzduch Mezi čočkou objektivu a sklíčkem je imerzní olej Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY světelný mikroskop Numerická apertura – číslo, které charakterizuje rozlišovací schopnost objektivu (vzdálenost dvou bodů, které mikroskop zobrazí jako 2 samostatné body) Imerzní olej – předejde ztrátám světla, do objektivu dopadne větší množství paprsků, obraz obsahuje více detailů - do imerze lze namáčet pouze imerzní objektiv (nikoli suchý) Zvětšení mikroskopu je násobkem zvětšení objektivu a okuláru (např. 100 (zvětšení objektivu) x 12,5 (zvětšení okuláru) = 1250x zvětšení mikroskopu) Maximální užitečné zvětšení mikroskopu – u každého objektivu lze stupňovat celkové zvětšení mikroskopu použitím silnějších okulárů jen po určitou mez, nad tuto mez již objektiv nezobrazí více detailů (prázdné zvětšení). Užitečné zvětšení se odvozuje od hodnoty numerické apertury. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu zvětšení 100 - 200x vyhledávání mitóz zvětšení přibližně 1000x hodnocení Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu světelný mikroskop s CCD kamerou napojený na počítač ke třídění chromosomů a sestavení karyotypu lze využít počítačového programu Lucia. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu karyotyp setříděný a upravený pomocí počítačového programu Lucia Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení získaných chromosomových aberací METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení získaných chromosomových aberací • počítáme % aberantních buněk ze 100 zhodnocených mitóz při individuálním hodnocení (ZCA, CAPL) nebo 200 -300 mitóz při skupinovém vyšetření (CAPL) • aberantní buňka = buňka, jejíž jádro obsahuje minimálně 1 chromosom s aberací, nezáleží na tom, o kterou aberaci konkrétně se jedná (kromě gapů, které nezapočítáváme do výsledného % aberantních buněk) • hranice patologie při individuálním hodnocení = 5% aberantních buněk při opakovaném nálezu • hranice patologie při skupinovém hodnocení = 2-4% aberantních buněk aberantní buňka Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odmaštění zhodnocených sklíček METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odmaštění zhodnocených sklíček odmaštění sklíček v xylenu – následně ve dvou kyvetách po 10 minutách PRÁCE V DIGESTOŘI kyveta 1 kyveta 2 zhodnocená sklíčka jsou popsána číslem pacienta, značkou pracovníka, který je hodnotil a pořadovým číslem (pokud je pacient zhodnocen více než z 1 skla) sušení odmaštěných sklíček Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY krátkodobé skladování sklíček METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY krátkodobé skladování sklíček v průběhu roku Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY balení a archivace sklíček METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY balení a archivace sklíček minimálně 5 let Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zápis výsledků METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zápis výsledků - do knihy pacientů - do laboratorní elektronické databáze - na papírové kartičky, které se zakládají do kartotéky - do nemocniční databáze pacientů AMIS Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Metody molekulární cytogenetiky, příklady využití v klinické cytogenetice Metody molekulární cytogenetiky, příklady využití v klinické cytogenetice Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY • Vyšetřujeme chromosomy a interfázní jádra ze všech typů vstupních materiálů (periferní krev, plodová voda, kostní dřeň, solidní nádory a další) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY • molekulární cytogenetika aplikuje metody molekulární biologie na cytogenetické úrovni, vizualizuje a lokalizuje genetický materiál v buňkách • pracuje s metafázními chromosomy nebo interfázními jádry • potvrzuje a upřesňuje nálezy klasické cytogenetiky (translokací, delecí, inzercí, duplikací…) • řeší problémy klasické cytogenetiky – záchyt velmi malých chromosomových změn (jsou pod rozlišovací schopností (citlivostí) metod klasické cytogenetiky – např. mikrodelece, translokace velmi malých úseků chromosomů) - analýza složitých chromosomových přestaveb - identifikace nebalancovaného materiálu neznámého původu - analýza buněk v interfázi (chromatin není spiralizován do podoby chromosomů, je rozprostřen v celém objemu buněčného jádra) – zrychluje analýzu (bez kultivace) – výsledek do 24 hodin, řeší problémy klasické cytogenetiky – nedostatečný počet mitóz na sklíčku, špatná kvalita chromosomů • začátek rozvoje – přelom 60.- 70. let 20. století Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY • využití: - analýza chromosomů z periferní krve – pouze VCA, ZCA se při rutinní analýze nevyšetřují molekulárně cytogeneticky! - analýza chromosomů z ostatních materiálů (plodová voda, krev plodu, kostní dřeň, solidní tumory….) • molekulárně cytogenetickými technikami nelze nahradit klasické karyotypování (před použitím metod molekulární cytogenetiky je třeba vědět, co chceme hledat – vysoká cena molekulárně cytogenetických metod, některé změny lze zjistit pouze klasickým karyotypováním) • oblasti uplatnění FISH – klinická cytogenetika (postnatální vyšetření u sterilních párů, postižených dětí a dospělých s podezřením na genetickou příčinu, genetická analýza pro účely umělého oplodnění, prenatální diagnostika karyotypu plodu) - nádorová cytogenetika - výzkum (evoluční studie karyotypu, mapování genomu ...) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – ISH (in situ hybridizace) - FISH (fluorescenční in situ hybridizace) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – ISH (in situ hybridizace) - FISH (fluorescenční in situ hybridizace) • technika, která se využívá k detekci a lokalizaci specifické DNA sekvence na chromosomech (cílová sekvence nukleotidů na metafázních chromosomech nebo interfázních jádrech) • SONDA (PRÓBA) – uměle nasyntetizovaná sekvence, úsek DNA dlouhý několik set bazí, komplementární k cílové sekvenci na chromosomu (v chromatinu) - sonda je značená – radioaktivně - fluorescenčně (fluorochromy) - FISH - enzymem Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) • denaturace sondy a cílové sekvence (působení zvýšené teploty) – získání jednořetězcového vlákna DNA (je schopno vytvořit novou vazbu cílová DNA – DNA sonda, před denaturací vazba na komplementární řetězec DNA) – týká se sondy i cílové DNA • hybridizace sondy na cílovou DNA (chromosomy nebo interfázní jádra na podložním sklíčku) – dochází ke specifické vazbě sondy na cílové místo (chromosom, gen) sonda cílová DNA Jednořetězcová DNA po denaturaci Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) • vyhodnocení a zpracování signálu – FISH - fluorescenční mikroskop napojený na počítač – vizualizace a kvantifikace (signál září v tmavém poli) – modrá barvička (DAPI) obarvuje všechny chromosomy, červený signál = fluorescenčně značená sonda FISH na metafázních chromosomech FISH na interfázních jádrechdetekce genu SRY na chromosomu Y Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) POSTUP METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) POSTUP Viz samostatná prezentace Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – fluorescenční mikroskop METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – fluorescenční mikroskop Světelný zdroj poskytující světlo o vysokém podílu krátkovlnného světla (rtuťová výbojka) Karusel s filtry – selekční filtry (excitační) – selektují ze světla rtuťové výbojky krátkovlnné světlo, které, když dopadá na preparát, na kterém je navázána fluorescenčně značená sonda, vyvolává fluorescenci - ochranné filtry – odstraňují krátkovlnné světlo (excitační) a propouští pouze světlo dlouhovlnné (emisní) - dichroické zrcátko – odráží a propouští světlo procházející mikroskopem (součást optiky mikroskopu) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY princip fluorescence METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY princip fluorescence Jev, při němž záření o kratší vlnové délce vyvolává v látce určitého složení vznik záření o delší vlnové délce, nazýváme luminiscence. Pokud k luminiscenci dochází po osvětlení zářením, hovoříme o fluorescenci nebo fosforescenci. Záření, které luminiscenci vyvolává, se nazývá excitační, záření vysílané látkou se nazývá emisní. Zatímco u fluorescence trvá vyzařování emisního světla krátkou dobu a po zhasnutí excitačního záření téměř okamžitě emise zhasíná (asi za 10-8 sekundy), u fosforescence může k emisi docházet i dlouhou dobu po zhasnutí excitačního záření. Látka schopná fluorescence se nazývá fluorochrom. V molekulární cytogenetice využíváme jevu fluorescence. Fluorescenční značky sond řadíme mezi fluorochromy. Fyzikální podstata fluorescence a fosforescence spočívá ve vlastnostech elektronového obalu atomů v molekulách fluorochromu. Elektrony těchto látek jsou schopny absorbovat foton excitačního světla, čímž se zvýší jejich energie. Část této nově nabyté energie však elektron po chvíli vyzáří jako foton s nižší energií a tedy delší vlnovou délkou. Protože došlo ke ztrátě energie, je vlnová délka emisního světla vždy delší než vlnová délka světla excitačního (Stokesovo pravidlo). Jelikož vlnová délka udává barvu světla, pozorujeme u emitovaného světla posun k červené části spektra. Excitační a bariérový filtr Abychom mohli dobře pozorovat emisní záření jehož intenzita je vždy mnohem nižší než intenzita excitačního záření, používáme dvojici filtrů. Excitační filtr propouští z barevného spektra pouze část potřebnou pro excitaci fluorescence (krátkovlnné záření) a zabraňuje průchodu světla o stejné či podobné vlnové délce jako světlo emisní, které by vytvářelo pozadí. Bariérový filtr propouští pouze emisní část spektra (delší vlnová délka) a zabraňuje průchodu excitačnímu světlu. Excitační světlo se od emisního sice liší barvou, ale je mnohem intenzivnější, takže by v něm emisní světlo nebylo lidským okem dobře vidět. Excitační a bariérový filtr. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY princip fluorescence - Stokesův posuv METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY princip fluorescence - Stokesův posuv Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii Stokesův posuv λ Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) • 1992 • odhaluje nebalancovaný genetický materiál (chybění – nadbytek DNA), rozlišovací schopnost CGH je 5 – 10 Mb • není schopna analyzovat balancované přestavby • princip analýzy – DNA pacienta je izolována, rozštěpena na krátké fragmenty, naznačena zeleným fluorochromem = celogenomová sonda zelená - DNA kontrolní (ověřeno, že se jedná o balancovaný genetický materiál) obdobně zpracována a naznačena červeným fluorochromem = celogenomová sonda červená - hybridizace obou sond na kontrolní metafázní chromosomy na sklíčku (genetický materiál chromosomů na sklíčku je balancovaný) – DNA/DNA hybridizace - systém fluorescenční mikroskop – kamera – počítač, analyzační software měří poměr fluorescence při vlnových délkách odpovídajících červenému a zelenému fluorochromu • - balancovaný karyotyp – smíšená fluorescence (červený a zelený fluorochrom zastoupeny přibližně stejně na daném úseku chromosomu) - zisk DNA (duplikace) u pacienta – převažuje zelená fluorescence na daném úseku chromosomu - ztráta DNA (delece) u pacienta – červená fluorescence na daném úseku chromosomu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) zeleně označeny úseky na chromosomech, které jsou v karyotypu maligního klonu zmnoženy, červeně označeny chybějící úseky chromosomů (obrázky převzaty z internetu) převaha červené fluorescence – křivka vychýlena za hranice intervalu spolehlivosti doleva (delece), převaha zelené fluorescence – křivka vychýlena doprava (nadbytek materiálu) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) • modifikace metody CGH : - HR–CGH (high resolution CGH) – CGH s vysokým rozlišením, odhalí chybění či nadbytek menších úseků DNA než CGH, metodika se od CGH liší počítačovým zpracováním – rozlišovací schopnost metody přibližně 4 Mb - ARRAY-CGH – na microarraye (skleněné mikroskopické destičky) jsou navázány úseky DNA, jejichž delece či amplifikace nás u konkrétního pacienta zajímá (destičky s DNA sekvencemi (mikročipy) lze zakoupit), připravíme celogenomové sondy stejným způsobem jako u CGH, nahybridizujeme na destičku, analyzační software měří intenzity fluorescence v jednotlivých bodech na destičce (v místech vazby konkrétních sekvencí) - význam ARRAY-CGH – mapování s vyšším rozlišením než HR-CGH , rozlišovací schopnost závisí na množství DNA, které se nachází v jednotlivých bodech na destičce (kratší ¨ – delší sekvence) – až 35 kb Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – SKY (spektrální karyotypování), M-FISH (multicolor FISH) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – SKY (spektrální karyotypování), M-FISH (multicolor FISH) • 1996 • umožňuje vizualizaci všech lidských metafázních chromosomů při jednorázové hybridizaci – 5 fluorochromy značená směs chromosomově specifických sond, jedinečná kombinace sond na každém chromosomu, každý chromosomový pár má jinou barvu • SKY a M-FISH se liší jen systémem filtrů, který se používá při vizualizaci chromosomů fluorescenčním mikroskopem (SKY – 1 filtr, M- FISH – 5 filtrů, zvlášť pro každý fluorochrom) – mikroskop je napojen na kameru a počítač – snímání a zpracování obrazu • význam – vyjasnění složitých přestavech (komplexních aberací) - identifikace kryptických (skrytých) přestaveb - identifikace původu markerů a ring chromosomů – obtížně určitelné klasickými metodami i samostatnými sondami • limity – nelze detekovat nebalancovaný materiál (nadbytek-chybění DNA), inverze Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – SKY (spektrální karyotypování), M-FISH (multicolor FISH) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – SKY (spektrální karyotypování), M-FISH (multicolor FISH) SKY – mitóza po hybridizaci se směsí fluorochromů SKY – seřazené chromosomy po úpravě obrazu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – m-BAND (mnohobarevné pruhování) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – m-BAND (mnohobarevné pruhování) • 1999 • mnohobarevná pruhovací technika s vysokým rozlišením, pomocí které lze analyzovat intrachromosomové přestavby (inverze, inzerce, delece) a mapovat místa zlomů na chromosomech obrázek převzat z internetu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CESH (comparative expressed sequence hybridization) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CESH (comparative expressed sequence hybridization) • 2001 • analýza exprese genů ve tkáních (expresní profil) - rozdílná exprese genů v normální a nádorové tkáni – genetické změny spjaté s maligní transformací a vývojem nádoru mohou postihnout expresi a funkci klíčových genů - využití při studiu vývojových anomálií a diferenciačních procesů • produkt exprese genu = RNA, ze které lze molekulárně genetickými metodami získat DNA, kterou fluorescenčně naznačíme a získáme sondu pro hybridizaci s normálními metafázními chromosomy, srovnáváme intenzitu fluorescence sond získaných z RNA kontrolního vzorku a vyšetřovaného pacienta Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CESH (comparative expressed sequence hybridization) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CESH (comparative expressed sequence hybridization) obrázek převzat z internetu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY –MLPA METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY –MLPA • 2002 • rychlá, jednoduchá, relativně levná metoda • dokáže detekovat změny počtu kopií až 46 specifických sekvencí v 1 reakci • 20 ng DNA (MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MLPA METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MLPA • založena na molekulárně – genetické metodě PCR (prolínání metod molekulární cytogenetiky a molekulární genetiky) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MLPA METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MLPA Separace a vyhodnocení pomocí kapilární elektroforézy Pacient Kontrola Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXICHROMOSOMY V PRAXI dvouchromatidový metafázní chromosom schema chromosomu Chromosom s G- pruhy Chromosom obarvený po celé délcetelomerická oblast telomerická oblast Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů podle umístění centromery CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů podle umístění centromery • metacentrické chromosomy centromera téměř nebo úplně uprostřed, tedy krátká a dlouhá raménka jsou (téměř) stejně dlouhá • submetacentrické chromosomy centromera mimo střed chromosomu, p a q raménka jsou jasně délkově odlišena Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů podle umístění centromery CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů podle umístění centromery • akrocentrické chromosomy centromera je umístěna velmi blízko jednomu konci; od krátkých ramének jsou odškrceny satelity (malé výrazné části konstitutivního heterochromatinu; místo odškrcení = sekundární konstrikce (tenké stopky); (sekundární konstrikce obsahuje kopie genů kódujících rRNA = organizátor jadérka) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů do skupin podle velikosti a pozice centromery normální mužský karyotyp 46, XY CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů do skupin podle velikosti a pozice centromery normální mužský karyotyp 46, XY Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení / pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení / pruhování chromosomů • barvení Giemsovým barvivem (bez inkubace v roztoku trypsinu, obarvuje chromosomy po celé délce) - analýza ZCA - viz také kapitola „Získané chromosomové aberace” • pruhování chromosomů (analýza karyotypu, karyotypu maligních klonů) • speciální barvení – „C”, „NOR” - dovyšetření nálezů na chromosomech chromosomy s G - pruhy „C” barvení - vizualizace heterochromatinových oblastí na chromosomech Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení chromosomů Příprava preparátů na ZCA (získané chromosomové abnormality) se liší od přípravy preparátů na stanovení karyotypu (VCA – vrozené chromosomové abnormality): • materiál – periferní krev • kultivace buněk v suspenzi 48 hodin s přidáním PHA • kolchicin, hypotonizace, fixace, vykapání suspenze na sklíčka • BARVENÍ GIEMSOVÝM BARVIVEM bez inkubace v roztoku trypsinu – OBARVENÍ CHROMOSOMŮ PO CELÉ DÉLCE (bez pruhů) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů G – pruhování METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů G – pruhování • nejčastěji rutinně užívaná metoda • chromosomy jsou vystaveny účinkům trypsinu (proteolytický enzym), který natráví chromosomové proteiny • chromosomy obarvíme Giemsovým barvivem (směs barviv) • výsledek – každý chromosom se specificky obarví (střídavé tmavé a světlé proužky různé tloušťky, tmavé proužky jsou bohaté na adenin a thymin, světlé na cytozin a guanin) • získané pruhy jsou specifické pro každý chromosomový pár • lze snadno rozpoznat strukturní a numerické abnormality • 1 pruh na chromosomu obsahuje 50 i více genů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G – pruhování chromosomů normální mužský karyotyp 46,XY METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G – pruhování chromosomů normální mužský karyotyp 46,XY Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY C – barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY C – barvení chromosomů Vizualizace heterochromatinu (heterochromatin v oblasti centromer a na dlouhých raméncích některých chromosomů – 1q, 9q, 16q,Yq) - metoda založena na denaturaci DNA působením různých agens (HCl, Ba(OH)2) a následné reasociaci v teplém pufru Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů • navázání zrn stříbra na aktivní oblast organizátoru jadérka (sekundární konstrikce akrocentrických chromosomů) • stříbro se vyloučí z AgNO3 za vyšší teploty a v kyselém prostředí • zjišťujeme, jestli jsou satelity schopny aktivity (jestli na nich není navázán euchromatin, který by aktivitě bránil a mohl by být nebalancovaným materiálem v karyotypu) • každý akrocentrický chromosom nemusí být aktivní ve všech buňkách Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno JADÉRKOJADÉRKO • difuzní struktura v jádře, která není ohraničena membránou • dochází v ní k syntéze podjednotek ribosomů (ribosomy – bílkovinné struktury, které se účastní syntézy bílkovin v cytoplazmě) – geny pro syntézu lokalizovány v oblasti sekundární konstrikce akrocentrických chromosomů • je přítomno v interfázním jádře, mizí v mitóze jaderná membrána jadérko Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno JADÉRKOJADÉRKO přítomnost jadérka v interfázním jádře a jeho nepřítomnost v mitóze souvisí se spiralizací a despiralizací akrocentrických chromosomů jadérko 10 dekondenzovaných akrocentrických chromosomů v interfázi, jejich chromatinové smyčky, které obsahují geny pro rRNA (sekundární konstrikce) se shlukují a tvoří základ jadérka jaderná membrána interfázní jádro mitóza spiralizované akrocentrické chromosomy, každý má spiralizovanou svou chromatinovou smyčku, která tvoří sekundární konstrikci Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) vyšetření z periferní krve ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) vyšetření z periferní krve • rychlejší stárnutí organismu • vznik degenerativních onemocnění • možné maligní zvrhnutí Přítomnost aberací v somatických buňkách Přítomnost aberací v gametách • zvýšené riziko narození postiženého dítěte Konvenční barvení chromosomů Stanovení % aberantních buněk – buněk s poškozeným chromosomem Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno • vyšetření provádíme na chromosomech obarvených po celé délce • délka kultivace buněk kratší (48 hodin), nutné zachytit 1. buněčné dělení, později dochází k reparaci vyšetřovaných aberací • hraniční patologie – opakovaný nález 5% aberantních buněk při individuálním hodnocení nebo 2 - 4% aberantních buněk při skupinovém vyšetření (v různých buňkách nacházíme různé aberace, není podstatné jakou chromosomovou abnormalitu v mitóze nalezneme – aberace přítomna (alespoň 1) / aberace nepřítomna) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) příčiny vzniku ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) příčiny vzniku působení - fyzikálních faktorů (ionizující záření) - chemických látek (cytostatika, imunosupresiva, oxidační, alkylační činidla ad. látky používané v průmyslu) - biologických faktorů (virové infekce – pravé neštovice, spalničky, zarděnky ad.) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht • jednochromatidové gapy (mezery) (G´nebo chtg – chromatid gap)- příčně slabě se barvící část chromatidy achromatické léze), také úplné přerušení chromatidy nepřesahující její šířku Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht • jednochromatidové zlomy (Z´nebo chtb – chromatid brake), oddělení samostatného fragmentu (F) – úplné přerušení chromatidy, pravděpodobně koncová delece (fragmenty mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromosomem nebo nemusí) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht • výměny (V nebo chte – chromatid exchange)- výměny části chromatid v rámci jednoho nebo více chromosomů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace - výměny ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace - výměny Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr • chromosomové zlomy (Z´´nebo chrb – chromosome break), oddělení párových fragmentů (DF)- úplné přerušení obou chromatid, pravděpodobně koncová delece (fragment obvykle leží paralelně, mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromosomem nebo nemusí) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr • chromosomové gapy (mezery) (G´´nebo chrg – chromosome gap)- příčně slabě se barvící část chromosomu (achromatické léze), také úplné přerušení chromosomu nepřesahující šířku chromatidy Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr • acentrické ringy, kruhové chromosomyuzavřené struktury, vznik dvou zlomů na jednom chromosomu, dojde ke spojení – acentrické ringy jsou bez centromery, kruhové chromosomy zahrnují centromeru Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr • chromosomy zahrnující více než 1 centromerudicentrické, tricentrické chromosomy… Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno