Počítání krevních buňek
Bourková L., OKH FN Brno


Hematologické analyzátory
•každý má svá jedinečná specifika
•dva základní principy měření:
–optický
–impedanční
•z měření získáváme informace o:
–počtu buněk (kvantitativní analýza)
–velikosti, tvaru a složení buňky (kvalitativní analýza)
•principy měření mohou být na jednotlivých analyzátorech různě kombinovány
•různé kombinace pak umožňují různě přesnou kvantitativní i kvalitativní analýzu všech prošlých
buněčných elementů

Principy měření
•absorbční spektrofotometrie
•impedanční analýza
•optická analýza
•
•Poznámka: dle typu analyzátoru lze počítat i více jak 10.000 buněk a získávat více jak 40.000
informací

Používaná diagnostika
•analýza nesrážlivé periferní krve
–odběr do solí EDTA (K, Na)
•ředící roztoky
–impedanční analýza
vodivý roztok + nevodivá buňka
–optická analýza
opticky inaktivní roztok + opticky aktivní buňka
•lyzační roztoky
hemolýza erytrocytů a dle typu analyzátoru může být
i destrukce jiných krevních elementů
•barvící roztoky
barvení obsahu buňky (granula/enzymy, DNA, RNA)
•čistící roztoky
čištění měříciho systému

Absorbční spektrofotometrie
•Metoda slouží ke stanovování množství hemoglobinu ve vzorku.
V dnešní době se již jedná většinou o bezkyanidové metody.

Impedanční analýza - I
•mezi elektrodami je v apertuře standardní vodivost (standardní vodivost diluentu)
•při průchodu buňky aperturou se vodivost naruší/změní ® impedanční impulz (odpor)
•četnost impulzu ® počet buněk
velikost impulzu ® velikost buňky

Impedanční analýza - II
•využívá se hydrodynamická fokusace:
unášení jednotlivých buněk proudem kapaliny

•měření může být doplněno například
vysokofrekvenční analýzou:
na stejnosměrné elektrické pole → superponováno vysokofrekvenční elektrické pole → pronikne
cytoplazmou → pak se změří vysokofrekvenční vodivost buňky → ta odpovídá její fyzikálněchemické
struktuře
(kvalitativní analýza buňky)

Optická analýza
•využívá se průtoková cytometrie:
(spolu s hydrodynamickou fokusací)
–každá buňka je ozářena monochromatickým laserovým paprskem
–po interakci buňky s paprskem se provádí analýza
–analyzuje se samostatně každá buňka v suspenzi
•detekuje se světlo:
–prošlé
–odražené
–depolarizované
–fluorescence

Analýza prošlého světla
•Detekce paprsku ve směru 0° udává hodnoty:
–počet prošlých buněk
–velikosti jednotlivých buněk

Analýza odraženého a depolarizovaného světla
•Detekce paprsků v různých úhlech (dle typu analyzátoru).
•Analýza může být doplněna cytochemickým barvením buněk.
–Roztok se substrátem (např. 4-chlor-1-naftol) barví v leukocytech enzym peroxidázu.
•Reakcí enzymu se substrátem vznikají v buňce barevné intracelulární sraženiny, které ovlivňují
úbytek světla a rozptyl paprsku.
•Měření slouží k detekci tvaru a velikosti buňky, jádra a granularity cytoplazmy

Analýza fluorescence
•Obarvení buňky speciálními barvami → ozáření buňky laserovým paprskem.
•Absorbce světla buňkou → emise světla o vyšší vlnové délce → detekce emitovaného světla
•Detekce:  DNA, RNA nebo povrchové antigeny (CD znaky).

Analýza fluorescence