CYTOGENETIKA
A
MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKA
HEMATOLOGICKÝCH MALIGNIT
Marie Jarošová
Centrum molekulární biologie a genové terapie
Interní hematoonkologická klinika FN a LF MU Brno
 Nádor je genetické onemocnění, které vzniká
jako důsledek kumulace řady genetických změn
 Každý 3. člověk onemocní nádorovým onemocněním
 V ČR je diagnostikováno ročně více jak 70 tis. nových nádorů
 Charakteristickou vlastností nádorových buněk jsou
chromosomové změny : početní změny chromosomů
strukturní změny chromosomů
Genetika nádorů
Genetické změny
u hematologických malignit
90-95% nemocných s CML
60-80% nemocných s AML
60% nemocných s MDS
50-80% nemocných s CLL
60-90% nemocných s NHL
70-90% nemocných s MM
70-90% nemocných s ALL
Cytogenetika
Vrozené chromosomové změny (Germline alterations)
 Postižené jsou všechny buňky
 Změny jsou stabilní
 Nádorová cytogenetika
Získané chromosomové změny (Acquired alterations)
 Postižena jen část buněk- buňky nádoru
 Klonální vývoj nebo regrese
 Významná role citlivosti použité metody
 Klinická cytogenetika
 Zkoumá získané chromosomové změny
nádorových buněk
 Hodnotí početní a strukturní změny
chromosomů
 Základní metoda – (G)
-pruhovací technika
(rozlišení kolem 3-5Mb)
 V jednom vyšetření analyzuje celý genom
Nádorová cytogenetika
(onkocytogenetika)
Cytogenetika FISH
arrayCGH/SNP array
Cytogenetické metody
Profase Prometafase Metafase
Anafase Telofase
1-2ml
Kultivace
2/24/72 hod
+
colcemide
COLCEMIDE BLOKUJE MITÓZY V METAFÁZI
 kostní dřeň
 periferní krev
 uzlina
ZPRACOVÁNÍ BUNĚČNÉ KULTURY
HYPOTONIZACE
0,075M KCl
FIXACE ROZTOKEM
KYS.OCTOVÉ A METANOLU
1:3
PŘÍPRAVA PREPARÁTŮ
KAPÁNÍM BB SUSPENZE
NA SKLO
BARVENÍ A HODNOCENÍ
V MIKROSKOPU
Klasická cytogenetika
G-banding; rozlišení 5-10Mb, např. chr 8 : 146Mb; ~500
genů,cMYC ~600kb,
Molekulární cytogenetika
•Metody založené na fluorescenční
in situ hybridizaci (FISH) vytváří
spojení mezi metodami molekulární
genetiky a klasické cytogenetiky
•Metody využívající základní vlastnosti
jednořetězcové DNA vzájemně se
vázat na základě komplementarity
bazí
Denaturace
Hybridizace
centromerické
celochromosomové
genové
Typy sond
Mnohobarevná fluorescenční in situ hybridizace
(M-FISH)
Mnohobarevná fluorescenční in situ hybridizace (M-FISH) je
molekulárně cytogenetická metoda založená na hybridizaci 24
fluorescenčně značených celochromosomových sond, které dovolují
současně obarvení všech chromosomových párů odlišnými barvami.
• Kombinuje paintingové
proby specifické pro danou
oblast chromosomu
• Sondy připravené
mikrodisekcí
chromosomových oblastí
• Pruhování pokrývá celý
chromosom
Mband FISH
Převzato I.Chudoba
Nádorová DNA je
hybridizována společně s
kontrolní DNA k
hybridizačnímu sklu, na
kterém jsou fragmenty
genomické DNA/
oligonukleotidy
arrayCGH –
komparativní genomová hybridizace
Array CGH
Gains: 2p25.3q11.2
Losses: 4p16.2p14
8p23.2p11.21
13q14.3q21.32
17p13.2p11.2
1.Diagnosa
2.Prognosa
3.Léčebné rozhodování
Cytogenetika v hematologii
Filadelfský chromosom (Ph)
První specifická chromosomová změna u nádoru člověka
CYTOGENETIKA CML
90-95% Ph1 výsledek translokace
t(9;22)(q34;q21)
Cytogenetika CML
Přídatné chromosomové změny
Diagnosa CHF: ~12%
Akcelerovaná fáze: ~30%
Blastická zvrat : ~70%
Diagnóza
Prognóza
Glivec
Type of Response Definition
CHR Complete Hematologic Response Normal differential, WBC & platelets ≤ ULN
MCyR Major cytogenetic Response 0–35% Ph+marrow metaphases
CCyR Complete Cytogenetic Response 0% Ph+marrow metaphases
MMR Major Molecular Response BCR-ABL/ABL ≤ 0.1% (International Scale)
MR4.0 BCR-ABL/ABL ≤ 0.001% (IS) “4-log reduction”
MR4.5 BCR-ABL/ABL ≤ 0.003% (IS) “4.5-log reduction”
CMR Complete Molecular Response
Undetectable BCR-ABL (test of sensitivity ≥4.5
logs)
ELN sledování MRN CML cytogenetika
WHO Classification 2008
WHO Classification
 Od roku 2008 je cytogenetika součástí diagnostiky a
klasifikace řady hematologických malignit
 Cytogenetika je součástí WHO klasifikace AML
 Společně s cytomorfologií stratifikuje nemocné s MDS a
MPN
 Klasifikace lymfomů- histologie, cytogenetika a FISH
potvrzují klasifikační zařazení
 Je součástí prognostické stratifikace u MM
WHO klasifikace AML
WHO prognostická stratifikace AML
Grimwade D et al. Blood 2010;116:354-365
Stratifikace podle cytogenetických nálezů
APL t(15;17)(q22;q12) / PML-RARA
CBFB-Rearrangement
t(15;17)(q22;q12)
PML-RARA
Janet D Rowley et al. Lancet 1977
Cílená léčba nemocných s APL
Schéma z práce
ALL – heterogenní onemocnění s monoklonální proliferací a
expanzí nezralých lymfoidních buněk v KD, PK
a dalších orgánech
Cytogenetika má prognostický význam
Diagnostický význam - imunofenotyp
AKUTNÍ LYMFOBLASTICKÁ LEUKEMIE (ALL)
Distribution of cytogenetic abnormalities from data collected from UK childhood ALL treatment trials.
Christine J. Harrison Hematology 2013;2013:118-125
©2013 by American Society of Hematology
Dětské ALL Tvoří 30% všech dětských nádorů
Frequency of cytogenetic subtypes of pediatric ALL.
Charles G. Mullighan Hematology 2012;2012:389-396
©2012 by American Society of Hematology
46,XY,dic(2;12)(?;p?12)t(2;16)(?;q?),der(10)t(2;10)(q?12;q?12),t(12;21)(p13;q22),+21
Chlapec, nar. 1998, dg. BCP-ALL 2003, Léčen protokolem ALL BFM95, KR
 de novo MDS 40-60%
 t-MDS nebo sekundární MDS 90%
 SNPs+arrayCGH 70%
Chromosomové změny u MDS
Klinická heterogenita MDS je odrazem heterogenity
získaných somatických genetických změn
Myelodysplastický syndrom (MDS)
Refractory cytopenia with unilineage dysplasia (RCUD)
Refractory anemia with ringed sideroblasts (RARS)
Refractory cytopenia with multilineage dysplasia (RCMD)
Refractory anemia with excess blasts-1 (RAEB-1)
Refractory anemia with excess blasts-2 (RAEB-2)
Myelodysplastic syndrome, unclassified (MDS-U)
Myelodysplastic syndrome associated with isolated del(5q)
WHO klasifikace
MDS
Prognostická stratifikace MDS
46,XX,del(5)(q31)
5q- SYNDROM
 10 % nemocných
 dobrá prognóza
(5-16 % progrese do AML)
 intersticiální delece, 5q31,
5q32-5q33
 Cílená léčba: lenalidomid
azacytidin
Lenalidomid - imunimodulační
látka
Azacytidin (vidaza)- hypometylace
DNA
Prognostický význam chromosomových změn u CLL
Döhner H, Stilgenbauer S, Benner A, Leupolt E, Krober A,
Bullinger L, Dohner K, Bentz M, Lichter P: Genomic
aberrations and survival in chronic lymphocytic
leukemia.
N Engl J Med 2000; 343:1910-1916.
CYTOGENETIKA CLL
CLL and genetic abnormalities:
Probability of survival
Döhner et al. N Engl J Med 2000
Months
Patientssurviving
(%)
100
80
60
40
20
0
0 24 48 72 96 120 144 168
13q deletion
17p (p53)
deletion
11q deletion
12q trisomy
Normal
N=26
(4.0%)
NOTCH1 M
SF3B1 M
BIRC3 M
del13q14
+12
TP53 M
del11q22-q23
MYD88 M
BIRC3 del
del17p13 *
* **
Rossi et al. Blood 2013
0 2 4 6 8 10 12 14
0.00.20.40.60.81.0
Years from diagnosis
CumulativeprobabilityofOS(%)
del13q14
Normal/+12
NOTCH1 M/SF3B1 M/
del11q22-q23
TP53 DIS/BIRC3 DIS
Matched general popul.
Mutační a cytogenetický model
Chronická lymfocytární leukemie (CLL)
Puiggros et al, BMRI 2014
CLL – prognostická a léčebná stratifikace
Nehodgkinské lymfomy - NHL
 Maligní lymfomy jsou heterogenní skupina nádorů lymfatické tkáně
 Vznikají na základě genetických změn v původně normálních buňkách
 Klasifikace lymfomů- histopatologie - WHO klasifikace lymfomů 2008
 Cytogenetika a FISH potvrzují klasifikační zařazení
Folikulární lymfom (FL)
indolentní B buněčný lymfom
~20 % všech lymfomů
heterogenní klinický průběh , os několik roků až 20 let
90% nemocných má translokaci t(14;18)(q32;q21)
Fúze IGH/BCL2
MCL (mantle cell lymphoma)
lymfom plášťových buněk
 Agresivní onemocnění (OS 3-5 let)
 ∼ 6 % všech NHL
 Diagnostika:
 Morfologie
 Imunohistochemie
 Imunofenotypizace
 Genetika:
 cytogenetika
 FISH
 molekulární genetika - PCR
• FISH
dual color dual fusion probes
IgH/CCND1 DC
DF Kreatech
• Konvenční cytogenetika
t(11;14)
MCL (mantle cell lymphoma)
lymfom plášťových buněk
Muž, 1938, dg. 11/2009
• Leukemizovaný lymfom
• Mol.biol:
– negativní pro IgH/CCND1 v MTC
– Potvrzena hyperexprese cyklinu D1
• Cytogenetika a FISH: Komplexní karyotyp
– pozitivní t(11;14) – zmnožení signálů
– Amplifikace genu MYC (8q24)
– Delece ATM (11q22)
• chemoterapie: R-CAOD a 5xR-CHOP, PR
• 10/2010 relaps onemocnění, komorbidní
• 1/2011 další komplikace. Úmrtí 1/2011
IgH/CCND1
DC DF Abbott
Nehodgkinské lymfomy (NHL) u dětí
Převzato: Hochberg et al, BJH 2008
 4-7% nádorů u dětí a mladistvých
 incidence vzrůstá s věkem
 zvýšené riziko děti s imunodeficitem (např. AT)
 WHO klasifikace 2008
 Frekvence histologických subtypů odlišná od dospělých
48,X,-Y,del(1)(p13pter),+der(1)del(1)(q?24q?ter)t(1;4)(q23;?q?),
+ider(1)(q11)del(1)(q?24q?ter)t(1;4)(q23;?q?),del(6)(q?15),+7,t(8;14)(q24;q32)(1.klon-56%)
11/2011
BURKITŮV LYMFOM (BL)
MNOHOČETNÝ MYELOM
MM je B-buněčné nádorové onemocnění, charakterizované
nekontrolovatelnou proliferací abnormálních plasmatických buněk v
kostní dřeni.
Walker B, Wardell CP, Melchor L et al., Submitted
MNOHOČETNÝ MYELOM
2015
ZÁVĚR
Cytogenetika je nedílnou součástí diagnostických a prognostických
stratifikací hematologických malignit
V jednom vyšetření analyzuje celý genom
Dovoluje potvrdit klinickou diagnosu nálezem specifických
chromosomových změn
Nenáhodné rekurentní změny určují prognosu onemocnění
Určení změny dovoluje monitorovat účinnost léčby