KONCEPCE GENOMU „READ AND
WRITE“ A DŮSLEDKY JEJÍ
APLIKACE V ONKOLOGII
TZKM 20. 9. 2017
Teoretické základy klinické medicíny
VLTU0451c – Teoretické základy klinické medicíny II – interakční seminář
5. semestr
1-2 hod týdně, Aula A22
3/5 Kancerogeneze
Garant tématu: prof. A. Vašků
20. 9. 2017 Aula A22
15:20-17:10
Koncepce genomu „Read and Write“ a důsledky její aplikace v onkologii
(prof. A.Vašků, 2 hod)
27. 9. 2017 Aula A22
15:20-17:10
Význam cytogenetiky u hematologických malignit (prof. Jarošová, 2 hod)
4. 10. 2017 Aula A22
15:20-16:35
Patogeneze mnohočetného myelomu (doc. Ševčíková, 1.5 hod)
11. 10.2017 Aula A22
15:20-16:35
Význam epigenetiky v onkologii (doc. Slabý; 1.5 hr)
18. 10. 2017 Aula A22
15:20-17:10
Patogeneze leukémií (prof. Mayer, 0,5 hod)
Next generation sequencing v onkologii (doc. Mráz, 1.5 hod)
25. 10. 2017 Aula A22
15:20 – 16:10
Patogeneze solidních tumorů (doc. Křen, 1 hod)
1. 11.2017 Aula A22
15:20 - 17:10
Dysregulace krevního tlaku u hypertenze, hypertenze v dětském
věku, metodologie měření krevního tlaku –dysinterperetace
hodnot (2 hod- dr. Z. Nováková)
8.11.2017 Aula A22
15:20 – 16:10
Dysregulace krevního tlaku u hypertenze, hypertenze v dětském
věku, metodologie měření krevního tlaku –dysinterperetace
hodnot (1 hod- dr. Z. Nováková)
15.11.2017 Aula A22
15:20 - 17:10
Klinické a farmakologické aspekty hypertenze I (2 hodiny, prof.
Souček)
22.11.2017 Aula A22
15:20 – 17:10
Klinické a farmakologické aspekty hypertenze II (2 hod, prof.
Souček)
29.11.2017 Aula A22
15:20 – 17:10
Cévní mozkové příhody I (2 hod, prof. Smrčka)
6.12. 2017 AulaA22
15:20 - 16:10
Cévní mozkové příhody II (1 hod, prof. Smrčka)
4/5 Hypertenze
Garant tématu: Prof. Souček
KONCEPCE „READ AND WRITE GENOME“
 Genomy jsou databáze DNA, které obsahují
kódující a formátující sekvence, které umožňují
dědičné předání schopnosti syntetizovat biologicky
adaptivní molekuly RNA a proteinů. V průběhu
evoluce se kódující sekvence i formátující signály
mění, což umožňuje stále nové adaptace pomocé
restrukturalizace genomu (Shapiro, 2011 a Shapiro,
2013).
 Dynamický read–write (RW) genome střídá tradiční
představu „read only memory“ (ROM) genomu.
KONCEPCE „READ AND WRITE (RW) GENOME“
 Základní ideou této koncepce je myšlenka, že
buňky používají DNA jako modifikovatelný
prostředek skladující data („data storage
medium“), který kóduje RNA a proteinové
molekuly: tyto molekuly si musejí poradit s
měnícím se prostředím.
 Změna je pro žijící organismy kontinuálním
dějem. Ke změnám dochází během průchodu
buněk cyklem buněčného dělení, s měnícími
se vlastnostmi vnějšího prostředí, se zkušeností
buněk s poškozením, s vývojem multicelulární
morfogenezy a s interakcí buněk s jinými
buňkami a organismy.
KONCEPCE „READ AND WRITE (RW) GENOME“
 Ke zvládnutí krátkodobých změn buňky primárně
nasazují přechodně vznikající nukleoproteinové
komplexy, které jsou schopny regulaci exprese
genomických dat a umožňují tak růst a replikaci buněk.
 Pro dlouhodobější změny, jako je buněčná diferenciace
a multicelulární morfogeneze, vstupují do hry dědičné
epigenetické modifikace genomu.
 Pro nejdlouhodobější změny, které vytvářejí nové
biologické funkce během evoluce, buňky nasazují
schopnost „natural genetic engineeringu“, které
umožňují přebírat a alterovat sekvence DNA a
rekonfigurovat organizaci genomu. Někdy tyto funkce
mění strukturu DNA také v zájmu krátkodobých cílů
(např. rychlá nastolená diverzita mezi receptory
adaptivního imunitního systému).
STÁRNUTÍ BUNĚK
 s postupujícím věkem se objevují funkční i morfologické změny
skoro ve všech orgánech a tkáních. Tyto změny mají svůj podklad
též ve stárnutí buněk.
 V mitochondriích se postupně snižuje kapacita oxidační
fosforylace
 mění se syntéza strukturálních proteinů i enzymů pro alterace
v DNA a RNA vznikající s narůstajícím věkem.
 stárnoucí buňky mají sníženou schopnost opravovat poškozené
chromosomy; snižuje se jejich potřeba množství živin.
 Změny v morfologii buňky: Jádro se stává abnormálně laločnaté
a nepravidelné, dochází k pleomorfní vakuolizaci mitochondrií,
ubývá endoplasmatického retikula a Golgiho aparát se zkrucuje.
V buňkách se hromadí lipofuscin jako produkt lipidové
peroxidace.
TEORIE STÁRNUTÍ BUNĚK
Příčiny stárnutí buněk jsou pravděpodobně
multifaktoriální:
 endogenní molekulární program stárnutí
 vliv exogenních škodlivých faktorů, který ovlivňuje
životaschopnost buněk
 Dlouhověkost je patrně specificky regulována na
genové úrovni a řídí takové aktivity, jako je
opravné mechanismusmy pro DNA nebo
antioxidační obrana).
 Kandidátní geny dlouhověkosti mohou též souviset s
genetickým polymorfismem protektivních alel
lipidového metabolismu, jako je např. e2 alela u
apolipoproteinu E2. U dlouhověkých zjištěna též
prevalence genetického polymorfismu genu
paraoxonasy na kodónu 192.
STÁRNUTÍ BUŇKY
 Dochází k progresivnímu poškozování buněk
reaktivními formami kyslíku a dusíku. Děje se tak
nepříznivými vlivy z okolí, jako je ionizující záření a
stále se snižující kapacita antioxidačních
mechanismů.
 Peroxidace poškozuje nukleové kyseliny. Reaktivní
formy kyslíku (ROS) způsobují denně alteraci 10 000
bazí DNA v jedné buňce, což převýší možnosti
opravného mechanismu, jehož kapacita se
s narůstajícím věkem snižuje. Mutace se hromadí
nejen v DNA v jádře, ale též v mitochondriální DNA.
Tento jev dramaticky roste s věkem.
 Volné kyslíkové radikály katalyzují oxidační
modifikaci proteinů, včetně enzymů, což vede
k jejich degradaci cytosolovými proteázami.
Znamená to další omezení funkce buněk.
STÁRNUTÍ BUŇKY
 U stoletých lidí byla prokázána vyšší poly(ADPribosyl)ační
aktivita. Poly(ADP-ribosyl)ace
nukleárních proteinů katalysovaná poly(ADPribosa)-polymerasou
(PARP-1) (s NAD+ jako
substrátem) je posttranslační děj ovlivňující DNAšroubovici,
což má vliv na instabilitu
genomu způsobovanou endogenními i exogenními
genotoxiny.
 S věkem stoupají post-translační modifikace
intracelulárních a extracelulárních proteinů, což
vede k funkčním i morfologickým změnám. Jednou
z nich je neenzymová glykace proteinů a vznik
konečných produktů pokročilé glykace (AGE-
products).
 změny v indukci proteinů tepelného šoku (heat
shock proteins), zvláště Hsp70. Tyto proteiny jsou
velmi důležitým obranným mechanismem vůči
různým formám nadměrné zátěže.
STÁRNUTÍ BUŇKY - TELOMERY
 Telomery jsou klíčovým stabilizačním faktorem
terminální části chromosomu. Skládají se ze složky
DNA (repetitivní sekvence 5'-TTAGGG-3‚) a z 6 proteinů.
 Délka telomer se zmenšuje po mnohonásobných
pasážích (cekem se předpokládá 50-80 buněčných
dělení / život).
 Nejdelší jsou u spermií; u buněk fetálních jsou delší
než u buněk z dospělých jedinců.
 Jejich obnovování je katalyzováno telomerázou;
délka telomer koreluje s obsahem telomeráz. Z toho
důvodu se předpokládá, že úbytek DNA od konce
chromosomů zkracováním telomer vede k deleci
nezbytných genů, což má za následek omezení
života buněk.
STÁRNUTÍ BUŇKY - TELOMERY
 Telomery jsou koncové části chromosomů. Při buněčném
dělení se telomery zkracují kvůli neschopnosti syntetizovat
konce lineárních nukleových kyselin.
 Původní délka se obnovuje obvykle během tvorby pohlavních
buněk činností telomerázy, což je neobvyklá RNA
dependentní DNA polymeráza nesoucí si vlastní molekulu RNA
jako templát pro tvorbu DNA. Kromě pohlavních buněk jsou
své telomery schopné znovu prodlužovat i kmenové buňky
díky přítomnosti vlastní telomerázy.
 Většina rakovinných buněk také obnovuje své telomery
pomocí telomerázy, což umožňuje potlačit růst řady
rakovinných buněk blokací telomerázy,[část rakovinných
buněk ale opravuje své telomery alternativním systémem
využívajícím rekombinaci.
 Postupné zkracování délky telomer vede ke stárnutí buňky
(senescence).
MALIGNÍ TRANSFORMACE BUŇKY
 Dělení buněk je velmi pečlivě řízeno tak, aby odpovídalo
potřebám celého organismu.
 V časných fázích života jedince kapacita dělení buněk
převažuje nad jejich zanikáním, v dospělosti je
v dynamické rovnováze, ve stáří začíná převažovat
involuce.
 Některé buňky se však vyhnou kontrole replikace
(neodpovídají na vnější signály, kontrolující jejich
dělení, jsou autonomní), a mění se tak na buňky
nádorové.
 Ty, které si alespoň přibližně zachovávají vzhled i funkci
buněk normálních a především zůstávají stále na místě,
kde vznikly, jsou buňky benigní a jejich proliferace dá
vzniknout benigním tumorům. Buňky, které ztratily většinu
vlastností buněk, od kterých jsou odvozeny a mají snahu
pronikat do svého okolí (invazivita) i na vzdálená místa
(metastázy), jsou buňky maligní a tvoří maligní tumory.
NÁDOROVÉ BUŇKY
 Nádorové buňky proliferují neomezeně –
jsou „nesmrtelné“. Úplné vysvětlení tohoto
replikačního stárnutí není zatím jasné. Bylo
navrženo několik možných mechanismů:
 (a) aktivace genů pro stárnutí na
chromosomu 1 a 4,
 b) alterace nebo ztráta genů pro regulaci
buněčného růstu (c-fos nebo Rb-gen),
 (c) indukce inhibitorů buněčného růstu,
 (d) další příčiny, např. zkracování telomer.
NÁDOROVÝ FENOTYP
 se vyznačují především pokračujícím dělením.
 Snižují se u nich požadavky na přítomnost hormonů a
růstových faktorů.
 Některé transformované buňky produkují vlastní specifické
růstové faktory (autokrinní stimulace).
 Dochází ke ztrátě schopnosti zastavit růst. U normálních
buněk totiž snížení hladiny isoleucinu, fosfátu,
epidermálního růstového faktoru a dalších látek, které
regulují růst, pod určitou prahovou koncentraci, navodí
přesun do klidového stavu (G0-fáze). Normální buňky
začínají růst (dělit se) pouze, když jejich nutriční požadavky
jsou řádně zajištěny. Nádorovým buňkám tato schopnost
zastavit růst jako reakce na nedostatek živin a růstových
faktorů schází; dokonce pokračují v proliferaci, i když
přitom mohou zahynout.
NÁDOROVÝ FENOTYP
 Transformované buňky vykazují zvýšené vychytávání glukosy pro vyšší afinitu
glukózového transportéru v membráně, podobně jako je tomu normálně pouze u
erytrocytů nebo buněk v mozku. Koreluje to s vysokou glykolytickou aktivitou.
 Chybí u nich dále povrchový fibronektin, který mají klidové buňky a který udržuje
jejich tvar.
 Změny cytoskeletových elementů (aktinová mikrofilamenta nejsou difuzně
rozptýlena, ale koncentrují se blíže povrchu) jsou příčinou zvýšené mobility
povrchových proteinů.
 Nepřiměřená sekrece transformujícího růstového faktoru  a  a dalších
růstových faktorů, které řídí normálně vývoj embryonálních buněk.
 Produkují též plasminogenový aktivator, což je proteáza přeměňující
plasminogen na plasmin. Vysoká tvorba plasminu nádorovou buňkou pomáhá
penetraci skrz lamina basalis.
 Mikroprostředí nebo stroma, v kterém se nádorové buňky nalézají, mají rovněž
vliv na progresi („teorie semene a půdy"). Bylo prokázáno, že metaloproteinasy
stromální proteinové matrix (MMP 9) hrají významnou úlohu v časných stádiích
vývoje tumoru a při angiogenezi.
U metastáz karcinomu prostaty do kostí se předpokládá jakýsi „osteomimetický"
účinek (chemoatrakce a podpora adherence ke kostnímu endotelu)
a ovlivňování vlastností a chování osteoblastů a osteoklastů.
NÁDOROVÝ FENOTYP
 Nádorový fenotyp je charakterizován maligní
transformací buňky, která se projevuje:
- ztrátou kontroly buněčného dělení (alterace buněčného
cyklu, antiapoptóza – „nesmrtelnost“ nádorové buňky,
alterace v transdukci signálů),
- ztrátou kontaktu buňka-buňka,
invazivitou,
- změnami v metabolismu (podpora enzymů anaerobní
glykolýzy a potlačení enzymů oxidace cestou Krebsova
cyklu, „uchvacování“ dusíku nádorovými buňkami,
zvýšená lipolýza, tvorba nádorových antigenů),
- podporou angiogeneze.
 Maligně transformované buňky jsou pravděpodobně
odolné vůči stresovým faktorům okolí jako je hypoxie,
kyselé pH, nedostatek glukosy a živin, odloučení od
bazální membrány, které normální buňky ničí.
METASTATICKÝ FENOTYP

Dalším rysem maligně transformované buňky je
ztráta závislosti adherovat k podkladu (substrátům).
V buněčné kultuře normální buňky, plovoucí volně
v živném roztoku (gelu), mohou sice metabolizovat
(žít), ale nikoliv se dělit; nádorové buňky ano.
 Ztráta inhibice motility kontaktem se sousedními
buňkami je další charakteristika nádorových buněk.
Znamená to, že mohou růst jedna přes druhou,
mohou být na sobě i pod sebou a jen zřídka
vytvářejí mezerové spoje (gap junction).
 Změny na buněčné membráně jako je modifikace
glykolipidů a glykoproteinů (snížení množství sialové
kyseliny vázané na proteiny, redukce gangliosidů).
To sice nemění strukturu transformované buňky, ale
zvyšuje laterální mobilitu povrchových lipidů,
respektive vazbu membránových proteinů na
cytoskelet.
METASTATICKÝ FENOTYP
 Maligní buňky mají zvýšenou motilitu a schopnost
pronikat do okolí (invazivitu) a po průniku do krevní
cirkulace usadit se a množit na jiném místě (tvořit
metastázy).
 K tomu jsou vybaveny schopností produkovat
receptory, aby se mohly zachytit na proteinech
bazální membrány (tvorba adhezních molekul),
dále tvorbou hydrolytických enzymů, které
pomohou rozrušit kolageny, proteoglykany a
glykosaminoglykany bazální laminy a umožnit tak
pronikání do okolí, natrávit stěnu cév, zachytit se
v cirkulaci na shlucích trombocytů a vytvořit tak
nádorové emboly, odolávat účinkům
protinádorového imunitního mechanismu, zachytit
se na stěně cév vzdáleného místa, proniknout do
intersticia tkáně, založit metastázu, proliferovat,
podporovat angiogenezi a případně vytvářet
metastázy metastáz.
 To je tzv. metastázový fenotyp.
VZNIK METASTÁZ
 Při vzniku metastáz hrají důležitou úlohu chemokiny.
 Úloha chemokinů u nádorového bujení je složitá:
 podporují vrozenou nebo specifickou protinádorovou
imunitu,
 mohou podporovat nádorový růst a tvorbu metastáz
tím, že posilují proliferaci nádorových buněk, migraci a
neovaskularizaci.
 Chemokiny tvořené nádorovými buňkami mohou
působit inhibici protinádorové imunitní odpovědi,
stejně jako autokrinním mechanismem působí jako
růstové faktory.
HERITABILITA NÁDORŮ
 Familiární- více členů téže rodiny
má nádor
 Sporadické – jen jeden člen rodiny
má nádor
 Různé mechanismy
HERITABILITA NÁDORŮ
 Ačkoli některé formy nádorů jsou dědičné, většina vzniká na
podkladě remodelace somatických buněk a je způsobena
endogenními chybami v replikaci DNA, které jsou vyvolány
genetickými (mutace v DNA, chromosomální aberace) i
epigenetickými změnami.
 Vliv kancerogenů
 UV-záření příslušné vlnové délky může být absorbováno
bazemi DNA, která je tak poškozena za vzniku dimerů dvou
sousedících pyrimidinů. Tato změna překáží normální
transkripci i replikaci DNA.
 Účinek ionizujícího záření je odlišný: dochází k rozštěpení
(přerušení) DNA-řetězce; vznikají tak volné řetězce DNA, které
musí být beze zbytku opět navázány opravným
mechanismem. Nestane-li se tak (buňka netoreluje volné
konce DNA), může dojít k translokaci určitých úseků
chromosomů, což bývá příčinou aktivace proto-onkogenů.
HERITABILITA NÁDORŮ
Jedna genetická změna však nestačí navodit maligní
transformaci buňky; ta obvykle vzniká až po několika
(5ti až 10ti) genových mutacích v průběhu řady let.
 Genová alterace navodí vznik nádorového
fenotypu, např.:
 proliferace epitelové buňky hyperplazie
adenom dysplazie karcinom „in situ"
karcinom invazivní.
 Přeměna normální tkáně organismu do stavu
invazivní nádorové choroby trvá v průměru 5 – 10
let. Ovlivňují to hereditární genetické faktory a
somatické faktory genetické i epigenetické.
GERMINATIVNÍ VS. SOMATICKÉ MUTACE
 Germinativní mutace přítomny ve všech
buňkách. V průběhu života se nemění
(genetická predispozice)
 Somatické mutace vznikají v
somatických buňkách v průběhu života
(maligní transformace).
VZÁCNÉ ALELY A POLYMORFISMY
 Vzácné alely jsou „špatné“ (loss of function, gain of
function)
 Jsou často pod tlakem selekce
 Polymorfismy (> 1% frekvence v populaci)
 Význam:
 Zdroj vrozené variability genomu
 Faktor přežití vzhledem k patogenům?
 Jak vzácné mutace, tak polymorfismy jsou způsobeny
genovými mutacemi.
 Genom současníků je výrazně modifikován evolucí
(dlouhodoběji-paleolit) a historií pandemií
(krátkodoběji-mor, syfilis, černé neštovice v Evropě)
VZNIK GENOVÉ MUTACE
 Pravděpodobnost chyby při replikaci DNA
během buněčného dělení je vysoká. Proto je
nad stavem DNA ustaven přísný dohled,
který zajišťuje stabilitu genomu (supresorové
geny, např. P53).
 Porucha supresorových genů (zejména
obou alel) zakládá přirozeně větší riziko
vzniku mutací.
MR Stratton et al. Nature 458, 719-724 (2009)
Mutace somatických buněk: kolorektální karcinom
MR Stratton et al. Nature 458, 719-724 (2009)
Mutace somatických buněk: příklad
Sporadický kolorektální karcinom
PRŮBĚH KANCEROGENEZE
 Tři stádia:
 (1) Iniciační stádium, které představuje prvotní genetickou událost, tj. mutaci
určitého kritického genu. Jde o období časově krátké, ale nevratné; iniciovaným
buňkám přináší růstovou selekční výhodu. Buňka tak získává potenciál maligní
transformace; v tomto stádiu se může proces zastavit.
(2) Promoční stádium, které trvá léta, až desetiletí; postižené buňky (klon) jsou
stimulovány ještě k intenzivnější proliferaci. Promoční faktory samy o sobě nejsou
však schopny vyvolat maligní nádorovou transformaci, jen ji podpořit. Intenzita
promočních mechanismů musí dosáhnout určitého stupně, aby byl iniciovaný klon
stimulován, a naopak odstranění podpůrných faktorů může proces
kancerogeneze zpomalit nebo i zastavit.
 (3) Stádium progrese je charakterizováno dalším postupným nahromaděním
genetických změn jako je
 (a) nekontrolovaný růst pro trvalou aktivaci signální transdukce růstového stimulu,
 (b) alterace kritických bodů buněčného cyklu,
 (c) deregulace DNA- transkripčních faktorů.
 Nádor zůstává nejprve v místě svého vzniku, ale aktivací dalších faktorů se začne
šířit do nejbližšího okolí (invaze) a cestou krevního oběhu na místa vzdálená
(metastázy). Velmi důležitou podmínkou pro růst nádoru je dostatečný přísun živin
a kyslíku, který musí být zajištěn vytvořením cévního zásobení (nádorová
neoangiogeneze).
Schéma vývoje tumorigeneze
GEN Alterace genu TUMOR
Retinoblastoma gen (Rb) Delece
Bodová mutace
Retinoblastomy, osteosarkomy
sarkomy měkkých tkání,
Malobuněčné karcinomy
plic, karcinomy
močového
měchýře a prsu
Cyklin D Translokace chromosomů,
Genová amplifikace
Adenom parathyreoidey,
Některé
lymfomy,Karcinomy
mléčné žlázy,
hlavy a krku, jater
(primární),
jícnu
cdk4 Amplifikace,
Bodová mutace
Glioblastom, sarkom,
melanoblastom
p16INK4a (p15INK4b) Delece, bodová mutace,
metylace
Karcinomy pankreatu,
ezofagu, plic
(malobuněčné),
Glioblastomy, sarkomy,
familiární melanomy
a karcinomy pankreatu
Regulátory buněčného cyklu u maligních nádorů
BUNĚČNÝ CYKLUS A NÁDOROVÉ BUJENÍ
 U nádorového bujení je postižena především regulace přechodu
G1-fáze do S-fáze. Tři komplexy cyklindependentních kinas, cyklin
D/cdk4, cyklin D/cdk6 a cyklin E/cdk2 fosforylují produkt
retinoblastomového genu – Rb, a to na 10ti různých místech a
mění tak schopnost Rb asociovat s buněčnými proteiny. Jeden
takový protein - E2F – je transkripční faktor, který tvoří
heterodimer s jiným transkripčním faktorem DP1, čímž se aktivuje
několik genů nutných pro rozvoj S-fáze. Znamená to indukci
aktivace dihydrofolátreduktasy, thymidinkinasy, DNApolymerasy
a, c-myc, c-myb a cdc2. Kromě této podpory
růstových faktorů podporuje Rb také diferenciaci prostřednictvím
jeho asociace s transkripčními faktory jako je MyoD a aktivovaný
transkripční faktor, kterým jsou komplexy (ATF)/cAMP-response
element binding proteiny (CREB). Rb je také místem zásahu pro
transformující viry jako SV40 large T-antigen, adenovirový E1A a
antigen E7 lidského papillomaviru (human papilloma virus E7).
Front. Pharmacol., 23 March 2015
27.9.2017
35
ABCs, ATP-binding cassette transporters; AMP, adenosine monophosphate; ATIC, adenosine ribonucleotide
transformylase; DHFR, dihydrofolate reductase; FPGS, folylpolyglutamate synthase; GGH, gammaglutamyl
hydrolase; IMP, inosine monophosphate; ITP: inosine triphosphate; ITPA, inosine triphosphatepyrophosphatase;
SLC19A1, solute carrier family 19 member 1; TYMS, thymidylate
synthetase.
Dihydrofolát
reduktáza
Tymidilát
syntetáza
Adenosin
ribonukleotid
transformáza
BUNĚČNÝ CYKLUS A NÁDOROVÉ BUJENÍ
 Je-li poškození DNA příliš rozsáhlé a tedy
neopravitelné, buňka se stává nenormální a
je eliminována apoptózou.
 Nedojde-li však k apoptóze, vzniklá mutace
přetrvává a může být při dělení takto
mutované buňky přenesena na buňky
dceřiné. Vzniká tak fenomén genové
nestability, který podporuje maligní
transformaci. Stává se to častěji kupř. u
nosičů genu HNPCC (hereditární
nepolypózní kolorektální karcinom). Je zde
defekt v „opravném čtení“, takže chyba
v replikaci DNA není zjištěna a opravný
mechanismus není nastartován.
P
P
P
P
Ub
Rb
P
P
P
PP
P
P
P
P
P
P
P
P
Rb
P
P
P P
P
ATR
P P
P
Rb
Rb
P
UbUb
Ubiquitination
Ubiquitination
Cyclin-H
CDC25A
E2F
Rb
CDC25A
P
MYT1
p21
Rb
PP2A
Raf1
p21
P
p21
TGF
p19(INK4D)
MYT1
Cyclin-
D/D1
Cyclin-E
p18(INK4C)
p16(INK4A)
p15(INK4B)
Cell Cycle
Progression
Nucleus
S-Phase Genes
[Cyclin-A, E,E2F, CDC2]
Replicative
Scenescece
M
G2
Replicative
Senescence
Off
On
G1
CYCLINS AND CELL CYCLE REGULATION
CDK4/6
ATM
CDK7
Cyclin-H
CDK2CDK2
CDK2 p27(KIP1)
Degradation
SCF
HDACs
p53
2009
ProteinLounge.com
C
NÁDOROVÝ GENOTYP
 Současná koncepce modelu
vícestupňového vývoje maligního nádoru
předpokládá, jak bylo řečeno, nejprve
postupné hromadění genetických změn. Ty
se odehrávají v určitých skupinách genů
jako jsou:
 proto-onkogeny
 tumor-supresorové geny
 geny udržující stabilitu genomu
 modifikující geny.
PROTO-ONKOGENY A ONKOGENY
 Proto-onkogeny tvoří normální vybavení
genomu;
 kódují proteiny, které řídí
proliferaci, diferenciaci a přežívání buněk.
 100 různých lidských proto-onkogenů
v každé somatické buňce.
 Jsou cílem extra- a intracelulárních cest
transdukce signálů (zejména mitogenních),
kterými se reguluje jejich exprese.
PROTO-ONKOGENY A ONKOGENY
 Dojde-li k mutaci proto-onkogenů, mění se
na onkogeny a jejich aktivita získává
tumorigenní charakter.
 K přeměně proto-onkogenu na onkogen
stačí alterace pouze jedné alely genu – tzv.
dominantní mutace a gen má charakter
dominantního onkogenu.
 Mechanismy aktivace mají různé cesty:
 (a) virová transdukce (kupř. onkogen src)
 (b) genová amplifikace (myc, abl),
 (c) virová inzerce (myc)
 (d) chromosomální přestavba (myc, abl)
 (e) mutace (ras)
PROTO-ONKOGENY A ONKOGENY
 Onkogen může vzniknout mutací genů
kódujících proteiny signálních drah, které
realizují přenos růstového stimulu (růstového
faktoru), dojde-li k jeho abnormální aktivitě. To
může být způsobeno tím, že se tvoří v buňce,
kde se normálně netvoří nebo se tvoří
v nadměrném množství anebo v tak
pozměněné formě, která se vymyká normální
regulaci.
 Takovéto mutované geny jsou tumorigenní,
protože umožňují buňce proliferovat i
v nepřítomnosti extracelulárního signálu.
ZTRÁTA KONTROLY BUŇKY
NAD SYNTÉZOU DNA U MALIGNÍCH TUMORŮ
 Buněčný cyklus je u zdravého jedince
regulován tak, že každý buněčný typ v daném
orgánu „ví“, kdy přestat s růstem.
 U dospělého jedince jsou téměř všechny tkáně
kontinuálně regenerovány a buňky opět
„vědí“, kdy přestat s dělením.
 U rakoviny buňka selhává ve schopnosti
přijmout nebo interpretovat signály prostředí.
MALIGNÍ TRANSFORMACE BUŇKY
Navození transkripce onkogenů, kódujících syntézu onkoproteinů,
transkripčními faktory zahajuje maligní transformaci
buňky. Onkoproteiny jsou velmi podobné (někdy i shodné)
s proteiny kódované proto-onkogeny normálních buněk, jejichž
úkolem je řídit a kontrolovat růst, proliferaci, diferenciaci a zánik
buněk. Klasifikují se do pěti tříd:
 (1) růstové faktory
 (2) receptory růstových faktorů
 (3) intracelulární transducery signálu
 (4) nukleární transkripční faktory
 (5) proteiny kontrolující buněčný cyklus.
Základní skupiny proteinů regulujících buněčný růst
TUMOR-SUPRESOROVÉ GENY (ANTIONKOGENY TAKÉ
RECESIVNÍ ONKOGENY)
 Kromě mutací v proto-onkogenech mohou vznikat mutační
změny v anti-onkogenech (tumor-supresorové geny).
 Na rozdíl od onkogenů jimi kódované proteiny mají
antiproliferační účinek, podporují diferenciaci a apoptózu.
V každé somatické buňce je asi 40 tumor-supresorových genů.
Aby se staly tumorigenními, musí být mutovány obě jejich alely
– proto název recesivní onkogeny. S tím souvisí tzv.
dvouzásahová teorie, kterou po prvé formuloval Knudson,
když vysvětloval vznik vzácného hereditárního retinoblastomu.
Na rozdíl od mnohem častějšího sporadického retinoblastomu,
kde se jedná o náhodné mutace jedné a posléze druhé alely
v buňce sítnice, je u hereditární formy jedna mutovaná alela
zděděna, příslušný jedinec je heterozygot, u něhož se
zděděná nádorová predispozice zatím neprojevuje. Dojde-li
však k mutaci/eliminaci druhé alely, iniciuje se rozvoj
nádorového klonu buněk sítnice. Tomuto procesu se říká ztráta
heterozygozity (LOH=loss of heterozygozity). Prvně objevený
tumor-supresorový gen byl nazván retinoblastomový gen = Rbgen
a jeho produkt RB-protein. Vyskytuje se v každé buňce,
kde reguluje buněčný cyklus dělení.
Vliv apoptózy na přežití
nádorových buněk
(pro- a antiapoptózové
faktory)
Zvýšená exprese Bcl-2
inhibuje zánik buněk
apoptózou.
Je to způsobeno vazbou
Bcl-2 proteinu na BAXprotein,
což zabrání
jeho homodimerizaci,
která podporuje
apoptózu.
TUMOR-SUPRESOROVÝ PROTEIN P53 (TP53)
 je jeden z nukleárních proteinů, který má klíčovou
úlohu v regulaci cyklu buněčného dělení při
přechodu z G0 do G1-fáze. Obsahuje domény pro
vazbu na specifický úsek DNA, dále
oligomerizující a transkripci aktivující domény. Váže
se jako tetramer na vazebné místo na určitém
úseku DNA a tím aktivuje expresi genů, kódujících
faktory inhibující proliferaci a podporující invazivitu
buněk.
 Mutanty genu p53 jsou nalézána u řady maligních
tumorů. Pozměněný TP53 ztrácí schopnost vazby na
příslušný lokus DNA, což vede k nedostatečné
produkci faktorů potlačujících nádorový růst.
Alterace genu p53 se objevuje nejen jako
somatická mutace, ale též jako mutace
v zárodečných buňkách u některých nádorových
onemocnění s familiárním výskytem (syndrom Li-
Fraumeni
TUMOR-SUPRESOROVÝ GEN P53
 je klíčovým regulačním faktorem, který monitoruje poškození DNA.
I
 inaktivace p53 bývá jedním z prvních kroků, který vede k maligní
transformaci při vývoji řady nádorových onemocnění.
 Pacienti s Li-Fraumeniho syndromem mají obvykle jednu mutantní
alelu v zárodečných buňkách a tím i riziko vzniku sarkomů,
leukemie a karcinomu mléčné žlázy. Vzácně pacienti s LiFraumeniho
syndromem nemají v zárodečných buňkách tuto
mutaci, ale mutaci genu CHK 2, kódující proteinkinasu, která
fosforyluje protein p53, čímž dochází k jeho aktivaci. Tito pacienti
však mívají alteraci v jiných genech – MDM 2 a p14ARF, které
regulují expresi p53.
Onkogeny a antionkogeny, jejich produkty
Přehled některých recesivních onkogenů
podmiňujících nádorová onemocnění
Symbol Název Nádorové onemocnění
APC Gen adematózní polypózy tlustého
střeva
Kolorektální karcinom
Karcinom pankreatu
Desmoidy
Hepatoblastom
BRCA1 Gen 1 pro familiární
karcinom prsu/vaječníku
Hereditární karcinom prsu/
ovaria
BRCA2 Gen 2 pro familiární
karcinom prsu/vaječníku
Hereditární karcinom prsu/
ovaria
CDH1 Gen pro kadherin 1 Familiární karcinom žaludku
Lobulární karcinom prsu
CDNK2A Gen inhibitoru cyklin-dependentní
kinasy 2A (p16)
Maligní melanom kůže
CYLD Gen familiární cylindromatózy Cylindromy
EP300 Gen vazebného proteinu
300 kD-E1A
Karcinomy kolorektální,
pankreatu, prsu
GENY UDRŽUJÍCÍ STABILITU GENOMU
 Označují se někdy jako mutatorní geny a
bývají i řazeny k tumor-supresorovým
genům. Produkty těchto genů se uplatňují
v opravných mechanismech poškozené
DNA.
 Jejich mutace vede ke zvýšené frekvenci
mutovaných onkogenů a tumorsupresorových
genů, někdy až 1000krát.
GENY UDRŽUJÍCÍ STABILITU GENOMU
 Patří sem geny, jejichž produkty zajišťují
vystřižení poškozeného úseku DNA a
umožňují excizní opravný proces.
Jejich recesivní mutace způsobuje
onemocnění zvané xeroderma
pigmentosum a Cockayenův syndrom,
což jsou prekancerózy se zvýšenou
náchylností ke karcinomům kůže
navozeným expozicí na UV-záření.
GENY UDRŽUJÍCÍ STABILITU GENOMU

Další skupinou mutatorních genů jsou „mismatch“
opravné geny; kódované proteiny opravují chybné
zařazení baze při replikaci DNA (nikoliv však
komplementární). Projevem mutací těchto genů je
instabilita na nukleotidové úrovni – mikrosatelitová
instabilita. Zárodečné mutace zejména MSH2 a
MLH1 genů jsou podkladem hereditárního
nepolypózního kolorektálního karcinomu (HNPCC) .
 Mutace genů, jejichž produkty zajišťují „opravné
čtení“, jehož úkolem je identifikace chybných úseků
DNA při replikaci, byly prokázány u karcinomu
žaludku a tlustého střeva. Jedná se především o
mutaci genu pro polymerasu d.
GENY UDRŽUJÍCÍ STABILITU GENOMU

Rozpoznání poškozené DNA a aktivace p53
vyžaduje přítomnost ATK. Tento gen kóduje
kinasu, která aktivuje jak CHK2 tak p53 při
poškození DNA. Děti trpící ataxiíteleangiektazií
mají inaktivující mutaci obou
alel.
 V klinickém obraze je pak imunodeficience,
mozečkové příznaky a zvýšené riziko vzniku
maligního nádorového onemocnění,
především lymfomů. Buňky těchto pacientů
nemohou aktivovat p53 jako odpověď na
poškození DNA.
GENY UDRŽUJÍCÍ STABILITU GENOMU

Jiný syndrom označovaný jako NBS (Nijmegen breakage
syndrom) je způsoben homozygotní inaktivací genu NBS, který
se podílí přímo na opravách poškozené DNA. Do tohoto
mechanismu rozpoznávajícího a opravujícího poškozenou
DNA vstupuje též gen BRCA1. Mutace v jedné alele
zárodečných buněk nesoucích tento gen je odpovědná asi
za polovinu případů karcinomu mléčné žlázy s familiárním
výskytem. Při účinku proteinu BRCA1 hraje důležitou funkci jak
ATM tak CHK2, které umožňují jeho fosforylaci, když dojde k
poškození DNA. ATM také fosforyluje kofaktor BRCA1 - CtIP,
který reguluje transkripci genu BRCA1. Defekty DNAopravného
mechanismu přispívají k akumulaci genetických
defektů (viz genová nestabilita navozená genem HNPCC =
gen pro hereditární nepolypózní kolorektální karcinom)
podporují progresi maligně transformovaných buněk.
Homologous
Recombination
BASC
Complex
Chromatin
Remodeling
G2/M
Phase
DNA Repair
S-Phase and
G2 Arrest
Check Point
Regulation
G1/S-Phase
Transition
Transcriptional
Response to
DNA Damage
Expression of IFNg
Target Genes
DNA
Damage
Checkpoint
Arrest FANCL
M
S
H
2
M
S
H
6
BRCA1 PATHWAY
FANCA
FANCE
FANCD2
FANCD2
NBS1
Rad50
BARD1
BLM
HDACs
p21
ATM
ATR
Chk1
Chk2
PLK1
p53
ATF1
BRCA1
STAT1
Swi/SNF
ctIP
E2F1
OCT1
Rb
BRCA1
BACH1
P
Ub
P
P
P
Ionizing Radiation
FANCD2
2009
ProteinLounge.com
C
MODIFIKUJÍCÍ GENY
 Jde o geny, jejichž mutace může ovlivnit vznik
a rozvoj nádorového procesu.
 Jejich produkty mohou pozitivně nebo
negativně působit na průběh kancerogeneze,
a to s interindividuální nebo interfamiliární
variabilitou.
 Na jejich prozkoumání se teprve čeká; bude
umožněno nejnovějšími technikami molekulové
biologie v oblasti genomiky a proteomiky.
APOPTÓZA A TUMORIGENEZE
 Růst nádorových buněk je podmíněn nejen
nekontrolovaným buněčným dělením, ale také
snížením jejich opotřebovatelnosti a naopak
zvýšenou schopností přežít.
 Většina nádorových buněk, ne-li všechny, získala
rezistenci vůči mechanismům vedoucím k jejich
programovanému zániku – apoptóze. Existují
experimentální důkazy, že narušení signalizace
apoptózy je obecným předpokladem existence
a rozvoje nádorových buněk. Velmi důležitou
úlohu přitom má pravděpodobně onkogenní
potenciál faktoru rodiny Bcl2.
APOPTÓZA A TUMORIGENEZE
 Bcl2 (B-cell lymphoma 2) gen byl původně objeven jako gen
napojený na imunoglobulinový lokus v průběhu chromosomové
translokace u folikulárního lymfomu. Přitom se též zjistilo, že jeho
nadměrná exprese má spíše než na proliferaci vliv na apoptózu,
respektive na její narušení. Znamená to, že nascentní neoplastické
buňky získávají touto inhibicí programovaného zániku selekční
výhodu. Mohou setrvávat zahnízděny jako ložiska v hostitelské tkáni,
zejména v místech, kam se nedostanou cytokiny a kyslík. Tento únik
před apoptózou je pak podpořen dalšími onkogenními
sebezáchovnými mechanismy, které vedou ke vzniku agresivnějších
klonů; defektní apoptóza též usnadňuje metastázování, protože
buňky mohou ignorovat restrikční signály přicházející z okolí a přežívat
odděleně od extracelulární matrix. Mutace, které favorizují rozvoj
nádoru, odvracejí odpověď na cytotoxickou terapii a vznikají tak
refrakterní klony. Úloha Bcl2 (a jeho homologů – Bcl-xL a Bcl-w)
v mechanismu inhibice apoptózy spočívá pravděpodobně
v ochranném účinku na integritu mitochondrií tím, že brání výstupu
cytochromu c do cytoplasmy, což znemožní aktivaci kaspasové
kaskády.
NÁDORY A „NESMRTELNOST“ BUNĚK
 Nádorová buňka se stává „nesmrtelnou“. Je to
způsobeno zvýšenou aktivitou enzymu telomerasy.
Opakované dělení buněk je omezeno zkracováním
telomer.
 Telomery jsou klíčovým stabilizačním faktorem
terminální části chromosomu a ukotvují je
k nukleární matrix. Telomery mají opakující se
sekvenci nukleotidů TTAGGG. Délka telomer se
zmenšuje po mnohonásobných pasážích (1
buněčný cyklus = zkrácení o 1 telomeru) a dále
v buněčných kulturách od pacientů v pokročilém
věku. Jejich obnovování je katalyzováno
telomerasou; délka telomer koreluje s obsahem
telomeras. Z toho důvodu se předpokládá, že
úbytek DNA od konce chromosomů zkracováním
telomer vede k deleci nezbytných genů, což má za
následek omezení života buněk.
NÁDORY A „NESMRTELNOST“ BUNĚK
Počet telomer slouží jako generační hodiny, které
odpočítávají jednotlivé cykly buněčného dělení a
určují tak životnost buněk a replikační potenciál.
Nádorové buňky mají replikační potenciál vysoký;
umožňují jim to nejméně dva mechanismy, kterými
si udržují dostatečný počet telomer, respektive jejich
obnovování. Nejběžnější (aktivita prokázána u 85-
90% nádorových buněk) je
mechanismus TERT, což je proteinová komponenta
telomerasy; jen malá část nádorových buněk
využívá další mechanismus
tzv. alternativní prodlužování telomer (ALT), které
umožňuje udržování počtu telomer bez účinku
telomerasy.
VÝZNAM ANGIOGENEZE V ROZVOJI
NÁDOROVÉHO ONEMOCNĚNÍ
 Angiogeneze má klíčový význam pro
růst nádoru. Rostoucí nádorové ložisko
může bez cévního zásobení dosáhnout
velikosti pouze 1 – 2 mm3, kdy přívod
kyslíku a živin je možný ještě difuzí
z okolní tkáně. Nádor pro další růst
potřebuje vlastní cévní zásobení.
Popud je tomu dán vzniklou hypoxií
nádorových buněk. Ta navodí
genetickou nestálost, dochází ke
vzniku mutací; mutace genu p53, který
je ochráncem genomu, neumožní
opravu chyby v záměně bazí.
VÝZNAM ANGIOGENEZE V ROZVOJI
NÁDOROVÉHO ONEMOCNĚNÍ
 Dochází dále k nerovnováze mezi
antiangiogenními a proangiogenními
faktory. Tato změna, kterou se zahájí
proces nádorové angiogeneze, se
nazývá „angiogenní switch“. Objevuje
se nový fenotyp nádorových buněk,
vyznačující se potlačením
antiangiogenních faktorů –
thrombospondinu – a zvýšenou
tvorbou angiogenních působků. Buňky
nádoru a sousední endoteliální buňky
se v tomto směru vzájemně ovlivňují
parakrinní, ale i autokrinní sekrecí
angiogenetických faktorů.
Vzájemné ovlivnění nádorových buněk a endotélií při angiogenezi
VEDF=vaskulární endotelový růstový faktor; EGF=epidermální růstový faktor;
PDGF=růstový faktor odvozený z destiček; bFGF= fibroblastový růstový faktor
bazický; HGF=hepatální růstový faktor; MMP=matrixové metaloproteinasy; IL-
6=interleukin 6; IL-8=interleukin 8
TUMOROVÁ NEOVASKULARIZACE
 Novotvorbu cév v nádorovém ložisku předchází
 Vazodilace cév v nejbližším okolí navozená především zvýšenou
aktivitou NO-syntasy a tím produkcí NO-radikálů. To také
potencuje mitogenní účinek VEGF.
 Produkce metaloproteináz rozrušuje bazální membránu, čímž se
usnadňuje nejen migrace endotelových buněk po fibrinových
vláknech tvořených stimulací fibroblastů, ale i migrace
tumorových buněk.
 Migrující endotelie jsou zdrojem integrinů zajišťujících jejich
životnost.
 Kapilární morfogenezi podporují ještě další působky – (např. Eselektin).
Vaskularizace nádorového ložiska umožní jeho prokrvení
(perfuzi), a tím jeho další růst.
 Tyto procesy jsou alespoň částečně koordinovány HIF
TUMOROVÁ NEOVASKULARIZACE
 Čím je angiogeneze intenzivnější, tím je prognóza
nádorového onemocnění nepříznivější; zvyšuje se
riziko metastáz.
 Stupeň angiogeneze může sloužit jako prognostický
faktor.
 Nejintenzivnější angiogeneze bývá na okraji
nádorového ložiska, kde lze její intenzitu posoudit
histologicky. Používá se také zviditelnění tzv. horkých
ložisek (hot spots) pomocí monoklonálních
protilátek proti cévním endoteliím nebo proti
adhezivním molekulám (CD31, CD34), event. proti
von Willebrandovu faktoru.
 Citlivým ukazatelem hustoty kapilárního řečiště je
stanovení akvaporinu-1 (AqP-1); jde o faktor
působící synergicky s VEGF a významně zvyšující
cévní propustnost.
Copyright ©2005 American Association for Cancer Research
Nyberg, P. et al. Cancer Res 2005;65:3967-3979
Figure 1. The pathologic and physiologic angiogenic balance
Fig. 1 Outline of the two major mitochondrial signaling pathways. (A) Anterograde signaling is transmitted by activated nuclear
transcription factors and cytoplasmic proteins essential for mitochondrial biogenesis. (B) Retrograde signaling originates in dy...
Manti Guha , Narayan G. Avadhani
Mitochondrial retrograde signaling at the crossroads of tumor bioenergetics, genetics and epigenetics
Mitochondrion Volume 13, Issue 6 2013 577 - 591
http://dx.doi.org/10.1016/j.mito.2013.08.007
Fig. 2 Schematic outline of the reduced mtDNA copy number mediated mitochondrial retrograde signaling in C2C12 myocytes.
Reduction of mtDNA content below 70% disrupts Δψm which results in elevated cytosolic Ca 2<ce:hsp sp="0.10"/> + and activation
of Calc...
Manti Guha , Narayan G. Avadhani
Mitochondrial retrograde signaling at the crossroads of tumor bioenergetics, genetics and epigenetics
Mitochondrion Volume 13, Issue 6 2013 577 - 591
http://dx.doi.org/10.1016/j.mito.2013.08.007
DĚKUJI ZA POZORNOST