2. cvičení Biochemický ústav LF MU
1
ODMĚŘOVÁNÍ MALÝCH OBJEMŮ KAPALIN
Pipetory
Podle způsobu ovládání rozlišujeme pipetory manuální a elektronické. U manuálních pipetorů je pohyb
pístu zprostředkován prostřednictvím ovládacího tlačítka palcem ruky. Správnost a přesnost pipetování
je silně ovlivněna zkušenostmi a zručností pracovníka. Elektronické pipetory mají pohyb pístu zprostředkován
prostřednictvím elektromotorku. Oproti manuálním pipetorům nabízí navíc naprogramování
způsobu pipetování. Podle povahy kapaliny lze zvolit i různou rychlost pístu při nasávání a vytlačování
kapaliny.
Pipetory lze podle principu jejich účinku rozdělit na dva základní typy:
a) „Air displacement“ pipetory b) „Positive displacement“ pipetory
a) „Air displacement“ pipetory využívají principu tzv. vzduchového polštáře. Mezi pístem a kapalinou
zůstává vždy určitý objem vzduchu. Objem kapaliny nasátý pipetorem do špičky je však nepatrně menší
než objem vzduchu, který byl vytlačen pístem z válce, který je uvnitř pipetoru. Kromě toho, správnost
pipetování je ovlivněno atmosférickým tlakem, hustotou a viskozitou odměřované kapaliny. Proto je
nutná pravidelná kalibrace pipetoru a případně její seřízení.
Pipetory tohoto typu rozlišujeme dle provedení jako jednokanálové (určené pro pipetování jednoho
objemu dané kapaliny v čase) nebo jako multikanálové (8-, resp. 12-kanálové) určené pro současné
pipetování stejného objemu dané kapaliny do více jamek např. v mikrotitrační destičce (což je převážně
96 mikrozkumavek, vylisovaných většinou v polystyrenu ve formátu 8  12 jamek). Každý kanál u multikanálových
pipetorů má svůj vlastní píst, proto není nutné využít všech kanálů v daném okamžiku (je
možné připojit méně než 8, resp. 12 špiček).
píst
spodní díl pipety
vyměnitelná špička
vzduchový polštář
odměřovaná
kapalina
vyměnitelný píst
spodní díl pipety
těsnící píst
odměřovaná
kapalina
vyměnitelná špička
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
2
Mikropipetory jsou konstruovány buď pro jeden fixní objem, nebo jsou nastavitelné na více objemů.
Změna nastavení objemu může být diskrétní (provádí se výměnou zásuvných modulů) nebo kontinuální
v určitém rozmezí (např. 10–100 l) pomocí nastavovacího šroubu nebo knoflíku. Mikropipetory
mají na spodním konci odnímatelnou špičku a na horním konci dvoupolohové tlačítko, pomocí kterého
se ovládá píst, který se zasouvá do válce uvnitř pipetoru.
Ukázka a popis jednokanálové nastavitelné pipety:
b) „Positive displacement“ pipetory nasávají kapalinu do špičky přímo bez vytvoření vzduchového
polštáře, tj. píst je v přímém kontaktu s odměřovanou kapalinou. Kapalina nasátá do špičky (bez vzduchové
bubliny) se vypustí ven najednou (typ stříkačky) nebo po krocích ve stejném objemu (u elektronický
pipetorů i v různých objemech).
Tento typ pipetorů je výhodné používat pro vysoce viskózní nebo těkavé kapaliny anebo pro opakující
se pipetování (viz dále).
Ukázka krokového dávkovače a špičky s pístem:
1. Ukazatel pozice kotouče volby objemu
2. Kotouč volby objemu
3. Displej
4. Pipetovací páčka
5. Plnicí páčka
Špička do krokového pipetoru
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
3
Hlavní faktory ovlivňující správnost pipetování s „air displacement“ pipetory
Teplota
Největší vliv teploty na přesnost pipetování se projeví při různé teplotě pipetoru a odměřované kapaliny
(vzduchová mezera mezi pístem a povrchem kapaliny mění svůj objem v závislosti na teplotě).
Hustota roztoku
Pipetory jsou kalibrovány na destilovanou vodu. Při nasávání kapalin s nižší hustotou než voda je do
špičky nasát větší objem než odpovídá nastavené hodnotě a naopak, u kapalin s vyšší hustotou nasajeme
menší objem než je nastavený.
Atmosférický tlak
Atmosférický tlak klesá s nadmořskou výškou, čímž klesá rovněž konverzní faktor Z (viz úkol kalibrace
pipet). Naproti tomu s rostoucí nadmořskou výškou se zvyšuje tenze par kapaliny, čímž zvyšuje
jejich těkavost.
Poloha pipety při nasávání kapaliny
Největší správnosti při pipetování je dosaženo při kolmém držení pipetoru při nasávání. Rovněž hloubka
ponoření špičky pod hladinu odměřované kapaliny velmi ovlivňuje přesnost a správnost pipetování. Jak
moc ponořit špičku do kapaliny závisí na odměřovaném objemu:
Objem pipety (µl) Hloubka ponoru špičky (mm)
0,1–1 1
1–100 2–3
101–1 000 2–4
1001–10 000 3–6
ZPŮSOBY POUŽITÍ PIPETORŮ
a) Přímé pipetování
Při přímém pipetování je do špičky nejdříve přesně nasán objem kapaliny nastavený na dávkovači a
v dalším kroku je ze špičky kompletně vytlačen do zvolené nádoby. Po pipetování nesmí zůstat ve špičce
žádná kapalina.
Doporučeno pro pipetování vodných roztoků, pufrů, zředěných kyselin a zásad.
Schéma pipetování:
Výchozí poloha
Stisk do 2. polohy
Stisk do 1. polohy
1 2 3 4
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
4
Postup:
1. Nasaďte na dávkovač špičku. Stiskněte tlačítko ovladače do první polohy (nutno překonat
malý odpor při stisku tlačítka).
2. Ponořte špičku dávkovače asi 2–3 mm pod hladinu roztoku. Pomalu povolujte stisknuté tlačítko
ovladače za současného nasátí vzorku do špičky.
Pomalým nasátím kapaliny do špičky se omezí možný vznik turbulence, která může vyvolat vznik
aerosolu a bublinek plynu, vycházejících z kapaliny. Optimální rychlost nasávání závisí na vlastnostech
kapaliny (na její hustotě, tenzi par a viskozitě).
 Vždy sledujte, zda do špičky nevnikly bublinky vzduchu (např. při prudším povolení
pístu ovladače nebo špatně nasazené špičce).
 Vyšší přesnosti při pipetování dosáhnete, když úplně sundáte palec z tlačítka
ovladače, jakmile dosáhne výchozí polohy.
 Pomalu vytáhněte špičku z kapaliny. Při rychlém vytažení se může ztratit část obsahu
špičky. Před vytažením špičky z kapaliny počkejte, hlavně u větších pipetorů 500–5000 l,
asi 1–3 vteřiny.
 Je-li potřeba, buničinou lehce z boku pohybem shora dolu otřete kapky, které ulpěly na
vnější stěně špičky. Nikdy se nedotýkejte špičky zezdola, abyste neodsáli z obsahu špičky.
3. Při vytlačování daného objemu kapaliny držte špičku v mírném úhlu proti stěně nádoby
(10–45º), těsně nad roztok již přítomný a plynule stiskněte tlačítko ovladače palcem do první
polohy. Vyčkejte asi 1 vteřinu a pokračujte v rychlém stisku tlačítka ovladače až do druhé
polohy (pocítíte větší odpor při stisku). Dbejte na to, aby nezůstaly kapičky kapaliny ve špičce
nebo nebyly rozstříknuté na stěnách nádoby.
4. Podržte tlačítko ovladače zmáčknuté a vytáhněte špičku podél stěny nádobky ven. Nyní povolte
tlačítko ovladače.
Výchozí poloha
1. poloha
2. poloha
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
5
b) Reverzní pipetování
Při reverzním pipetování do špičky nasajeme větší objem kapaliny, než který chceme odměřit, a v dalším
kroku vytlačíme ze špičky objem nastavený na dávkovači. Tento způsob pipetování poskytuje lepší výsledky
při odměřování viskózních nebo vysoce těkavých kapalin, kapalin silně smáčivých, biologických
a pěnících kapalin, nebo velmi malých objemů. Po pipetování zůstane ve špičce vždy zbytek kapaliny,
kterou lze vytlačit do původního roztoku nebo do odpadu před vlastním odstraněním špičky.
Schéma pipetování:
Postup:
1. Stiskněte tlačítko až do druhé polohy (pocítíte nejdříve slabý a poté velký odpor pístu při
stisku tlačítka ovladače).
2. Ponořte špičku dávkovače asi 2–5 mm pod hladinu roztoku. Pomalu povolujte píst za současného
nasátí vzorku do špičky. Pomalu vytáhněte špičku z kapaliny a odstraňte kapky ulpěné
na vnější stěně špičky dotekem špičky proti okraji nádoby.
3. Při vytlačování daného objemu kapaliny držte špičku v mírném úhlu proti stěně nádoby těsně
nad roztokem již přítomným a pomalu plynule stiskněte palcem tlačítko ovladače do první
polohy. Držte tlačítko ovladače zmáčknuté v této poloze a vytáhněte špičku z nádoby ven.
4. Část kapaliny, která zůstane ve špičce, vytlačte stiskem tlačítka ovladače do druhé polohy
zpět do původní nádoby nebo do odpadu.
5. Podržte tlačítko ovladače zmáčknuté a vytáhněte špičku z kapaliny ven a pak povolte tlačítko
ovladače.
c) Opakující se pipetování
Tento způsob pipetování je určen pro opakované pipetování stejného objemu, např. pro přidávání činidla
do série zkumavek nebo do jamek v mikrotitrační destičce. Jedná se vlastně o opakující se reverzní
pipetování. Po nasátí kapaliny do špičky se opakují kroky 3 a 4.
Schéma pipetování:
Výchozí poloha
Stisk do 2. polohy
Stisk do 1. polohy
1 2 3 4 5
Výchozí poloha
Stisk do 2. polohy
Stisk do 1. polohy
1 2 3 4
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
6
d) Pipetování heterogenních vzorků
Tento způsob je vhodné použít při pipetování heterogenních vzorků jako je krev, kdy není snadný proplach
špičky před pipetováním.
Schéma pipetování:
Postup:
1. Stiskněte tlačítko do první polohy a ponořte špičku dávkovače asi 2–5 mm pod hladinu roz-
toku.
2. Pomalu povolujte píst za současného nasátí vzorku do špičky. Pomalu vytáhněte špičku z kapaliny
a odstraňte kapky roztoku ulpěné na vnější stěně špičky vytažením špičky podél stěny
nádoby. Ponořte špičku dávkovače do cílového roztoku.
3.+ 4. Stiskněte ovládací tlačítko do první polohy a pak ho pomalu povolte do původní polohy.
Tím dojde k nasátí roztoku do špičky. Špičku nevyndávejte z roztoku a opakujte tento krok,
dokud vnitřní stěna špičky není čistá.
5. Vyprázdněte špičku stiskem tlačítka ovladače do druhé polohy.
6. Podržte tlačítko ovladače zmáčknuté a vytáhněte špičku z kapaliny podél stěny nádoby ven a pak
povolte tlačítko ovladače.
f) Zřeďování
Současné odměřování dvou různých kapalin v různých objemech. Nejdříve je do špičky nasáta jedna kapalina, potom vzduch
a nakonec druhá kapalina. Vzduch vytváří mezeru mezi oběma kapalinami. Obě dvě kapaliny jsou vytlačeny ze špičky najednou
v jednom kroku.
g) Sekvenční pipetování
Elektronické pipetory umožňují v tzv. režimu „stepper“ nebo „dispensing“ v závislosti na typu pipetoru vytlačovat kapalinu ze
špičky v definovaných menších, ale stejných objemových alikvotních částech. Některé modely elektronických pipetorů umožňují
kapalinu vytlačovat v naprogramované posloupnosti v různých objemech (tzv. sequential dispensing). Sekvenčním pipetováním
se snižuje riziko kontaminace, urychluje sériové pipetování, snižuje spotřeba špiček a v neposlední řadě též riziko
vzniku syndromu karpálního tunelu.
h) Míchání
Při ředění kapalin se často používá míchání. Lze použít manuální i elektronické pipetory.
Výchozí poloha
Stisk do 2. polohy
Stisk do 1. polohy
1 2 (3 + 4) 5 6
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
7
ZÁSADY PŘI PIPETOVÁNÍ
a) objemů větších než 10 l
Po vypuzení kapaliny ze špičky ulpí na vnitřní stěně špičky tenký film kapaliny, který není prostým
okem viditelný. Pro dosažení vysoké správnosti pipetování se doporučuje zvlhčit vnitřní stěny špičky
odměřovanou kapalinou (na povrchu ulpí slabý film kapaliny) tak, že 2–3krát kapalinu nasajeme a vy-
pustíme.
Propláchnutí špičky je nutné pokaždé, kdy pipetujeme kapaliny s vysokou tenzí par nebo vysokou viskozitou
anebo hydrofobní kapaliny. Smáčivé kapaliny (sérum, detergent) vytvoří na stěně špičky tenký
film, který se následně již nepodaří vypustit. Bez předchozího smočení špičky by odměřovaný objem
byl menší než požadovaný.
b) objemů menších než 10 l
Pipetory pro objemy menší než 10 l bývají zpravidla kalibrovány bez předchozího proplachu špičky,
tzn., počítá se s tím, že na vnitřní stěně špičky ulpí část odměřované kapaliny. Špičky se proto nemusí
proplachovat, ale musí se vyměňovat mezi jednotlivými vzorky.
c) infekčního materiálu
Při pipetování infekčního materiálu (např. krev, sérum, moč)
musí být použity pipetory s odhazovačem špiček. Použité pipetory
je nutné sterilizovat pomocí autoklávování (121 C,
100 kPa, 20 min). Některé typy pipetorů lze autoklávovat celé,
jiné lze rozebrat a autoklávovat pouze spodní díl. Po každém
autoklávování je třeba provést kontrolní kalibraci.
d) za sterilních podmínek
Pro sterilní pipetování se používají pipetory rovněž s vyhazovačem
špiček, sterilní špičky s integrovaným filtrem (zabránění
kontaminace z pipetoru), které jsou již naskládané v boxech
(aby se na ně nemuselo sahat).
e) kyselin a zásad
Abychom zabránili případné korozi uvnitř pipety, použijeme
špičky s filtrem, který zabrání vzniku aerosolu, který vniká do
vnitra pipetoru.
f) multikanálovými pipetory
Při používání multikanálových pipetorů je velmi důležité
správné nasazení všech špiček. Pro tento účel jsou špičky dodávány
narovnané přímo ve skladovacích uzavíratelných krabičkách
pro 96 špiček (8 x 12 pozic). Pro snadné nasazení
prostředních špiček u multikanálového pipetoru bývá vlastní
držák špiček v krabičce prohnut do oblouku ∩. Špičky se pak
nasadí snadno kývavým pohybem ze strany na stranu.
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
8
Doporučené pipetování vybraných roztoků
Roztok/kapalina Příklad Technika pipetování Poznámka
Vodné roztoky Pufry, zředěné roztoky solí Přímé
Viskózní roztoky
Roztoky proteinů, nukleových
kyselin, glycerol
„Positive displacement“
nebo reverzní
Pipetovat pomalu (jinak
tvorba bublin)
Těkavé kapaliny Methanol, hexan
Reverzní nebo
„positive displacement“
Pipetovat rychle (odpařování),
použít špičky s uhlíkovým
filtrem
Tělesné tekutiny Plná krev, sérum
Viz pipetování heterogenních
roztoků
Nutno odstranit kapičky
z vnějšího povrchu špičky
otřením o okraj nádoby.
Zředěné kyseliny /
zásady
HNO3, HCl, NaOH Přímé Špičky s filtrem
Roztoky s hustotou
větší než je hustota
vody
H2SO4, H3PO4, NaOH Reverzní Pipetovat pomalu
Toxické látky Přímé/reverzní Špičky s filtrem
Shrnutí zásad správného postupu při pipetování „air displacement“ mikropipetami
 Používat špičky specifikované výrobcem dávkovače.
 Špičky jsou určeny pro jedno použití.
 Vytemperovat odměřovanou kapalinu na stejnou teplotu, jako je teplota mikropipetoru.
 Při manipulaci vždy držet mikropipetu s naplněnou špičkou ve svislé poloze.
 Propláchnout vždy špičky (2–5krát) odměřovanou kapalinou před vlastním pipetováním.
 Při nasávání kapaliny ponořit špičku 2–5 mm pod hladinu odměřované kapaliny.
 Vytemperovat mikropipetu na stejnou teplotu, jako byla teplota kalibrace (většinou pokojová).
 Při výměně špiček používat odhazovač špiček.
 Měnit špičku vždy, když na konci nebo uvnitř špičky zůstává vzorek po předchozím pipetování.
 Skladovat mikropipetu vždy ve svislé poloze.
 Při používání manuálních mikropipet ovládat píst pomalu a plynule palcem.
 Při používání elektronických mikropipet zvolit správnou rychlost pipetování dle typu kapaliny.
 U nastavitelných pipet nejprve nastavit poněkud vyšší objem a pak jej snížit na požadovaný nižší.
 Používat stejný postup nastavení objemu, rychlost pipetování, typ špiček v dané sérii pipetování.
 Pravidelně kalibrovat mikropipetu.
 Po každém prudším nárazu nebo povolení jednotlivých dílů mikropipetoru překalibrovat.
 Po pipetování kyselin nebo jiných korozivních kapalin, které uvolňují páry, rozeberte držák špiček
a omyjte píst a O-kroužek destilovanou vodou.
 Nepipetujte kapaliny, které mají teplotu nad 70°C a pod 4°C.
Podle zásad správné laboratorní praxe odměrný materiál, včetně mikropipet, musí být pravidelně
udržován, testován a kalibrován.
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
9
VYJÁDŘENÍ SPRÁVNOSTI A PŘESNOSTI
Každé měření určité fyzikální vlastnosti (např. odměřování objemu, vážení) či obecně laboratorní vyšetření
je ovlivněno třemi druhy chyb – hrubou (výsledek značně odchýlený od průměrné hodnoty),
systematickou (výsledek je odchýlený vždy jedním směrem od skutečné hodnoty) a náhodnou (rozptyl
získaných hodnot kolem průměrné hodnoty).
Výsledky zatížené hrubými chybami se projeví jako odlehlé hodnoty z daného souboru výsledků a lze
je identifikovat a vyloučit statistickými testy pro odlehlé výsledky. Výsledky zatížené systematickými
chybami lze prokázat jejich porovnáním s výsledky nezatíženými systematickou chybou nebo jejich
porovnáním se známou skutečnou hodnotou pomocí testů shodnosti. Výsledky zatížené náhodnými chybami
vedou k jejich určitému rozdělení. Pod pojmem rozdělení výsledků rozumíme závislost pravděpodobnosti
výskytu daného výsledku na jeho hodnotě. Převážná část souborů analytických výsledků má
jednovrcholové rozdělení, které se blíží normálnímu neboli Gaussovu rozdělení.
Přesnost metody je právě charakterizována tímto jednovrcholovým rozdělením získaných výsledků.
Každé jednovrcholové rozdělení hodnot lze popsat dvěma na sobě nezávislými parametry. První z nich
se nazývá parametr centrální tendence, který charakterizuje správnost výsledků, a vyjadřujeme jej
střední hodnotou souboru analytických výsledků, např. aritmetickým průměrem. Druhým z nich je parametr
variability, jenž charakterizuje shodnost analytických výsledků, a vyjadřujeme jej rozptylem,
popřípadě druhou odmocninou rozptylu nazývanou směrodatná odchylka.
Paralelní výsledky, které jsou zatíženy pouze malými náhodnými chybami, tedy shodné, a které nejsou
zároveň zatíženy systematickou chybou, tedy správné, označujeme jako přesné výsledky.
Při validaci pipetorů se používají pojmy přesnost a správnost, resp. nepřesnost a nesprávnost. Správnost
a přesnost lze snadno vysvětlit pomocí schématu terčů při střelbě:
SPRÁVNĚ NESPRÁVNĚ
PŘESNĚ
NEPŘESNĚ
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
10
Průměrnou hodnotu měřené veličiny (zjištěnou z n měření) lze vyjádřit aritmetickým průměrem:
Nesprávnost lze vyjádřit pomocí systematické chyby (špatně nakalibrovaný přístroj/pipetor):
absolutní systematická chyba es (např. v l): nominální
__
s xxe 
relativní systematická chyba es ():
Nepřesnost vyjadřuje náhodná chyba, kterou charakterizuje směrodatná odchylka nebo variační koe-
ficient:
směrodatná odchylka s (např. v l):
variační koeficient VK (%):
Pozn.: směrodatná odchylka nebo její násobek vyjadřuje pouze hranici, kterou může výsledek s určitou pravděpodobností
překročit, nikoliv hodnotu náhodné chyby.
100
nominální
nominální
__
s 


x
xx
e
n
xxxx
x n1n21
__
... 
 
100__

x
s
VK
1
)()(...)()( 2
__
n
2
__
1n
2
__
2
2
__
1


 
n
xxxxxxxx
s
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
11
PRAKTICKÁ ČÁST
Úkol 2.1 Způsoby použití pipetorů a zásady správného postupu
Materiál: Nastavitelné pipetory, špičky, mikrozkumavky, erlenka s detilovanou vodou, lékovka s glycerolem, roztok proteinů,
lékovka s acetonem.
Provedení:
 Nastavte na pipetoru 50 % jeho nominálního objemu.
 Dle pokynů vyučujícího procvičte různé způsoby pipetování pomocí pipetorů (přímé a reverzní
pipetování, pipetování heterogenních roztoků, míchání).
 1. Pokuste se na základě uvedených fyzikálních vlastností kapalin a roztoků zvolit správný
způsob pipetování a svoji volbu zdůvodněte zakroužkováním limitující fyzikální veličiny.
Fyzikální vlastnosti vybraných kapalin/roztoků při 20 °C
Kapalina/Roztok Hustota
(kg dm-3
)
Tenze par*
(kPa)
Viskozita*
(mPa s)
Doplňte způsob pi-
petování+
Voda 1,00 2,3 1,0 (1,3)
Krevní plazma 1,03 - 1,5–2
Plná krev (37 °C) 1,06 - 3–4
Glycerol 1,26 1470
Methanol (100 %) 0,79 12,8 1,2
Hydroxid sodný (30 %) 1,33
Kyselina fosforečná (85 %) 1,69
*s klesající teplotou klesá tenze par, ale roste viskozita kapaliny; +Způsob pipetování: a) použít upravený pipetor
na odlišnou hustotu než voda; b) přímé pipetování; c) reverzní pipetování; d) několikrát propláchnout špičku roztokem
před vlastním pipetováním; e) nelze použít pipetor využívající principu „vzduchového polštáře“.
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
12
Úkol 2.2 Gravimetrická kalibrace mikropipetoru
Kalibrací je míněno srovnání aktuálně odměřovaného objemu s objemem, který je nastavený na pipetoru
(tzv. nominální objem). Objem aktuálně odměřovaný pipetorem se zjišťuje buď gravimetricky (vážením)
nebo fotometricky. U nastavitelných pipetorů se testuje správnost pipetování při 10 %, 50 %
a 100 % jeho nominálního objemu (min. 10krát pro každý objem; podrobně je popsáno v normě EN ISO
8655). Při kalibraci pipetoru je nutno použít typ špiček, který se bude dále používat při pipetování v pro-
vozu!
Kalibrace by se měla provádět minimálně jednou za 3 měsíce, pokud se pipetor používá denně, a vždy
po výměně jednotlivých komponent, po každém vnitřním čištění pipetoru a vždy zjistí-li se při pravidelné
vizuální kontrole jakéhokoliv poškrábání, poškození spodního dílu, uvolnění spojení jednotlivých
dílů nebo při mechanickém nárazu pipetoru (např. spadnutí na zem).
Vyhodnocení a posouzení kalibrace se provádí zjištěním nesprávnosti (relativní systematické chyby)
a nepřesnosti pro daný objem (náhodné chyby – variačního koeficientu).
Pokud nesprávnost pipetování překračuje deklarovanou hodnotu, je možné pipetor seřídit pomocí seřizovacího
šroubu. Seřízení (nastavení) pipetoru spočívá v několika kalibracích (nejméně jedné před
a jedné po seřízení) a otáčení kalibračního šroubu, pomocí kterého se mění nominální objem. Seřízením
pipetoru lze ovlivnit pouze správnost pipetování.
Seřízení pipetoru se používá též pro adaptaci pipetoru na pravidelně odměřovanou kapalinu, která se
výrazně odlišuje hustotou od hustoty vody (např. koncentrované roztoky solí).
Naproti tomu pokud bude příliš vysoká nepřesnost pipetování, tak je potřeba pipetor nejdříve opravit
a pak provést novou kalibraci a případné i seřízení pipetoru.
V praktickém cvičení budete z časových důvodů provádět pouze orientační kalibraci nastavitelného pipetoru
pro maximální nominální objem.
Materiál: Nastavitelné pipetory 100–1000 l, špičky, analytické váhy s přesností na desetiny mg, odplyněná destilovaná
voda, kádinky 50 ml, plastové váženky, teploměr, statistický program nebo tabulkový procesor, fén, tampóny
buničiny, nádoba na odpad.
Provedení:
 Nastavte pipetor na maximální nominální objem (Vset = 1000 l).
 Proveďte test těsnosti. Do špičky nasajte odplyněnou destilovanou vodu. Pipetor držte ve
svislé poloze a špičkou se dotkněte hladiny vody (nebo ji ponořte nepatrně cca 1 mm pod
hladinu). Po dobu minimálně 1 min by ze špičky neměla ubývat voda.
 Změřte a zaznamenejte teplotu vzduchu a teplotu destilované vody.
 Vytárujte váženku na analytických vahách (návod k použití vah bude přiložen).
 Pipetujte nastavený objem 1000 l destilované vody do vytárované váženky.
 Změřte s přesností na desetiny miligramů hmotnost odměřené vody (m1).
 Obsah váženky vylijte do odpadu a váženku osušte pomocí tampónů a krátkým ofukem z fénu.
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
13
 Opakujte předchozí 4 kroky ještě 4krát s použitím vždy suché váženky (získáte hodnoty m2,
m3, m4, m5).
 Vypočtěte aritmetický průměr hmotnosti (mg) z pěti měření (n = 5):
 V tabulce (bude přiložena) nalezněte podle změřené teploty vody konverzní faktor Z (jedná
se o převrácenou hodnotu hustoty vody) a převeďte průměrnou hmotnost na objem (l):
 Vypočtěte nesprávnost pipetování, tj. relativní systematickou chybu měření (%):
 Vypočtěte nepřesnost pipetování, tj. náhodnou chybu měření jako variační koeficient (%):
 2. Všechny naměřené a získané údaje zaznamenejte do tabulky:
Hmotnost m1 m2 m3 m4 m5
Naměřené hodnoty (mg)
(mg)
Teplota vody (°C) Z (l/mg)
(l) VK (%)
es (l) es (%)
Max. es (%)
dle ISO 8655
Max. VK (%)
dle ISO 8655
 3. Srovnejte vypočtenou nesprávnost a nepřesnost pipetování s maximálními přípustnými hodnotami
dle ISO 8655 (viz příloha v praktickém cvičení). Pokud vypočtené hodnoty budou přesahovat
toleranční limit, zhodnoťte, zda analytické váhy opravdu správně váží a zda jsou podmínky
v místnosti dostatečné pro vážení (průvan, přímé sluneční světlo na váhy).
n
mmmmm
m 54321
__ 

ZmV 
____
100
set
set
__
s 


V
VV
e
100
1
)()()()()(
set
2
__
5
2
__
4
2
__
3
2
__
2
2
__
1





V
Z
n
mmmmmmmmmm
VK
__
m
__
V
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
14
Úkol 2.3 Ověření přesnosti opakovaného pipetování
Při vyloučení hrubých chyb dochází při opakovaném aditivním procesu (např. odměření objemu 200 l
získaného dvojím pipetováním 100 l) k šíření chyb jak systematických (absolutní hodnoty systematických
chyb jednotlivých kroků se sčítají), tak i náhodných (sčítají se hodnoty rozptylů s2
, resp. VK2
jednotlivých
kroků).
Materiál: Nastavitelné pipetory 100–1000 l, špičky, analytické váhy s přesností na desetiny mg, odplyněná destilovaná
voda, kádinky 50 ml, plastové váženky, teploměr, statistický program nebo tabulkový procesor, fén, tampóny
buničiny.
Provedení:
 4. Změřte hmotnost 1 ml destilované vody (m') odměřeného pomocí stejného pipetoru jako v předchozím
úkolu, nastaveného však na objem 100 l (do váženky pipetujte 10krát objem 100 l).
 5. Srovnejte získanou hmotnost m' s aritmetickým průměrem
__
m z předchozího úkolu.
 6. Zvažte, jaký postup při odměřování daného objemu je přesnější, zda pipetovat přímo l ml nebo
opakovaně 10krát 100 l. Kterým postupem odměříme správněji požadovaný objem kapaliny?
Úkol 2.4 Fotometrické ověření přesnosti ředění
Při průchodu elektromagnetického záření z oblasti ultrafialové nebo viditelné části spektra měřeným
roztokem dochází k jeho absorpci. Velikost absorpce závisí na vlnové délce záření, na koncentraci absorbující
látky v roztoku a na tloušťce měřené vrstvy. Při dané vlnové délce záření existuje mezi koncentrací
absorbující látky a veličinou nazývanou absorbance A přímá úměra. Tuto závislost vyjadřuje
Lambertův-Beerův zákon:
A = c l
kdeje molární absorpční koeficient (jeho hodnota odpovídá absorbanci látky o koncentraci 1 mol/l a tloušťce měřené vrstvy
1 cm), c je látková koncentrace (mol/l) a l tloušťka měřené vrstvy (cm).
Daný vztah platí pouze pro monochromatické záření a pro zředěné homogenní roztoky.
Pro měření absorbance se zpravidla volí vlnová délka odpovídající absorpčnímu maximu stanovované
látky. Absorbance jsou měřeny proti slepému vzorku (činidlo/rozpouštědlo bez měřené látky).
Materiál: Nastavitelné pipetory 100–1000 µl, špičky, 10ml zkumavky se zátkami. Zásobní roztok modré skalice
(0,5 mol/l). Spektrofotometr, 2 kyvety, střička, nádoba na odpad, vatové tampóny, lihový popisovač.
Provedení:
 Odměřte do označených zkumavek dle tabulky pomocí nastavitelného pipetoru nejdříve deionizovanou
vodu.
 Potom přidejte dle tabulky požadovaný objem zásobního roztoku CuSO4.5H2O.
 Zkumavky uzavřete zátkou a obsah promíchejte.
 Přesnost postupu ředění roztoku modré skalice ověřte změřením absorbance roztoku při vlnové
délce 620 nm proti demi-vodě.
2. cvičení Biochemický ústav LF MU
15
Zjednodušený návod na obsluhu spektrofotometru Spekol 11
 Na spektrofotometru nastavte otočným knoflíkem vlnovou délku 620 nm.
 Nastavte mód měření na absorbanci stisknutím tlačítka E (zelená dioda svítí nad tlačítkem).
 Vložte kyvetu naplněnou do cca ½ objemu demi-vodou do držáku a zasuňte do přístroje.
 Nastavte absorbanci na nulu stisknutím tlačítka R (čekejte, dokud se neobjeví na displeji nuly).
 Postupně vložte kyvety naplněné do cca ½ objemu měřeným roztokem do druhé pozice v držáku
a opatrně zasuňte do měřící části přístroje.
 Odečtěte hodnotu absorbance roztoku na displeji – doplňte do tabulky níže.
 Po skončení měření vypláchněte kyvety demi-vodou a uveďte pracovní místo do pořádku.
 7. Doplňte tabulku a vyneste na milimetrový papír hodnoty absorbance proti koncentraci pentahydrátu
síranu měďnatého. Získanými body proložte přímku. Odklon jednotlivých bodů od
přímky značí nepřesnost v pipetování anebo měření absorbance. Vyhodnoťte vaše výsledky.
Zkumavka
Koncentrace
CuSO4.5H2O
(mmol/l)
Zředění*
Zásobní roztok
CuSO4.5H2O
(µl)
Deionizovaná
voda (µl)
Absorbance A620
1 500 1 2  1000 0
2 250 2 600 600
3 300 600
4 300 900
5 250 1000
6 200 1000
7 160 960
8 140 980
9 120 960
10 110 990
* číslo zředění = Vcelkový/Vzás. roztoku modré skalice
Nastavení vlnové délky
Tlačítko R
Hlavní vypínač
Držák kyvet
DisplejTlačítko E
Měřící část přístroje
Přepínač clony