Biochemický ústav LF MU 1 ROZTOKY PUFRŮ Pufry (tlumivé roztoky, ústoje) jsou roztoky látek, které nedovolují, aby došlo k podstatnějším změnám hodnoty pH po přídavku kyseliny nebo zásady anebo po jejich zředění. Jedná o roztoky slabých kyselin a jejich solí (tj. konjugovaných bází) nebo o roztoky slabých zásad a jejich solí (tj. konjugovaných kyselin) nebo o roztoky solí vícesytných kyselin (které spolu tvoří konjugovaný pár). Název jednoduchých pufrů vždy pochází ze jména konjugované báze nebo akronymu kyseliny, např. hydrogenuhličitanový nebo HEPES pufr. Koncentrace pufru je definována jako součet koncentrací kyselé a bazické složku pufru - typické koncentrace jsou 20–100 mmol/l. Hodnotu pH daného pufru lze vypočítat pomocí Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice: ]HB[ ]B[ logpH A  pK kde [HB], [B] jsou látkové koncentrace základních složek (tj. kyseliny HB a její konjugované báze B) ve výsledném roztoku pufru, pKA je záporný dekadický logaritmus disociační konstanty kyseliny HB. Poměr látkových koncentrací složek ve výsledném pufru lze nahradit poměrem látkových množství daných složek, platí tedy: HB B A logpH n n pK  Poněvadž látkové množství n se rovná součinu c ∙ V, lze látkové množství v rovnici nahradit součinem výchozích koncentrací cHB, cB a objemů VHB, VB základních složek před jejich smícháním: HBHB BB A logpH Vc Vc pK  Z uvedeného vztahu vyplývá, že je-li výchozí koncentrace základních složek stejná (cHB = cB), lze do rovnice pro výpočet pH pufru dosadit pouze poměr výchozích objemů VB/VHB. Podobně byl-li pufr připraven smícháním stejných objemů základních složek (VHB = VB), lze do Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice dosadit pouze poměr výchozích koncentrací cB/cHB. Ze vztahu je patrné, že pH pufru závisí na použité kyselině (hodnota pKA), na teplotě (hodnota pKA) a na logaritmu poměru látkových koncentrací/látkových množství složek. V případě rovnosti koncentrací ([HB] = [B]), resp. látkových množství bazické a kyselé složky pufru (nHB = nB) se pH pufru rovná disociační konstantě pKA dané kyseliny HB. Schopnost pufru tlumit změny pH vyjadřuje veličina pufrační kapacita, která je definována jako látkové množství H+ nebo OHvyvolávající změnu pH v 1 litru pufru o jednotku: ΔpH Δ OH,H V n β   Poněvadž při pH = ±1 je vždy aspoň v jednom směru překračována oblast dobré účinnosti pufru (pKA ± 1), v praxi se hodnotí jako látkové množství H+ či OH− , které v 1 litru pufru vyvolá změnu pH =  0,1. Biochemický ústav LF MU 2 Grafickým vyjádřením Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice jsou titrační křivky slabých kyselin nebo zásad (jejich horizontální část). Při postupném přidávání zředěných roztoků silné kyseliny nebo zásady (tzn. při titraci pufru) se pH zpočátku mění jen pozvolna, po překročení hodnoty pH = pKA ± 1 jsou změny již značné. Z průběhu titrační křivky pufru dané koncentrace (cHB + cB) lze určit pufrační kapacitu pro kteroukoliv hodnotu pH. Pufrační kapacita pufru je maximální při pH = pKA. Jednoduchý pufr je použitelný přibližně v rozmezí hodnot pH od (pKA – 1) do (pKA + 1), což odpovídá poměru [B]/[HB], resp. nB/nHB od 0,1 do 10. Ředěním pufru klesá jeho kapacita, přičemž hodnota pH se nemění. Kapacita dobrých pufrů dosahuje prakticky až hodnoty 0,2 mol/l. Příprava pufrů Při přípravě pufru je třeba dopředu zvážit, jaký objem pufru je třeba připravit, jaké bude mít pH a koncentraci, jaká slabá kyselina/konjugovaná báze bude použita a jaká bude jeho iontová síla, resp. osmolarita. Z hlediska pufrační kapacity je nejlepší takový pufr, jehož kyselá složka má pKA v rozsahu požadovaného pH  1. Při výběru složení pufru je důležitá jeho potenciální toxicita, příp. interakce složek pufračního systému se studovaným chemickým/biologickým systémem. Rovněž ekonomika ovlivňuje výběr základních složek pufru, čím levnější, tím lepší. Iontová síla pufru je velmi důležitá např. z hlediska stability biomolekul. Bílkoviny jsou nejstabilnější při iontové síle, která odpovídá prostředí uvnitř buněk, tj. kolem 150 mmol/l. Při iontové síle vyšší než 500 mmol/l dochází k rozvinutí bílkovin (porušení sekundární, terciární a příp. kvartérní struktury) a tedy k jejich denaturaci. Je-li třeba, iontovou sílu nebo osmolaritu pufrů lze zvýšit přídavkem neutrální soli. Je-li pufr tvořen slabou kyselinou/bází a konjugovanou složkou, je pufrační rozsah poměrně úzký pKA ± 1. V některých případech je potřeba pufrovat širší rozsah pH. Pro tyto účely se připravují různé vícesložkové pufry (pufrační směsi). Pokud pufrační složky vícesložkové směsi mají hodnotu pKA lišící se maximálně o 2 pH jednotky, pufrační kapacity jednotlivých pufračních systémů jsou aditivní. [HB] = [B] pKA odpovídá pH roztoku dané soli B Titrační křivka jednosytné slabé kyseliny Závislost kapacit vybraných pufrů na pH Biochemický ústav LF MU 3 Při přípravě pufrů se vychází buď z roztoků slabých kyselin, resp. zásad a jejich solí, nebo z pevných solí vícesytných kyselin nebo jejich roztoků, anebo se částečně neutralizuje slabá kyselina, resp. zásada silnou zásadou, resp. kyselinou. Nejběžnější postupy při přípravě pufru: 1. Navážení kyselé i bazické složky pufru. S použitím Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice a rovnice definující koncentraci pufru (= [HB] + [B]) (tj. dvou rovnic o dvou neznámých) se vypočtou požadované látkové koncentrace kyselé a bazické složky pufru, které se pak převedou na látková množství, která jsou potřebná pro přípravu požadovaného objemu pufru. Pomocí molekulové hmotnosti se látková množství složek pufru převedou na jejich hmotnosti, která se rozpustí v požadovaném objemu vody. 2. Částečná neutralizace jedné složky pufru. Nejdříve se vypočte, jaká hmotnost (objem roztoku) slabé kyseliny/zásady je třeba pro přípravu požadovaného objemu pufru dané koncentrace. Vypočtené množství slabého elektrolytu se rozpustí/naředí ve vodě přibližně na 90 % požadovaného konečného objemu. Za stálého míchání a měření pH skleněnou elektrodou se přidává po kapkách silný hydroxid, resp. kyselina (např. 6M-NaOH, resp. 6M-HCl) dokud hodnota pH pufru nedosáhne požadované hodnoty. Poté se pufr doplní na požadovaný konečný objem deionizovanou vodou. V případě, že kyselou součástí pufru je protonizovaná báze (např. HTris+ ), navažuje se přednostně slabá báze, která se pak částečně neutralizuje silnou kyselinou. Tato metoda může být poměrně zdlouhavá, protože po přídavku silné zásady/kyseliny dochází k zahřívání neutralizovaného roztoku a pro správné odečtení hodnoty pH (závisí na teplotě) je třeba čekat, dokud se roztok nevytemperuje zpět na svoji původní teplotu. 3. Metoda dvou roztoků. Pufr se připraví smísením odpovídajících objemů roztoků kyselé a bazické složky, které mají stejnou koncentraci (a iontovou sílu, je-li požadována) jakou má mít výsledný pufr, a to v takovém poměru (zjištěném z Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice), aby se dosáhlo požadované hodnoty pH. 4. Tabulková metoda. V tabulkách se nalezne odpovídající množství kyselé a bazické složky požadovaného pufru, které se rozpustí ve vodě na cca 90 % konečného objemu pufru, ověří se jeho pH a případně se upraví na požadovanou hodnotu přídavkem silné kyseliny/hydroxidu, a nakonec se doplní deionizovanou vodou na konečný objem. Zabránění mikrobiální kontaminace pufrů. Mikroorganismy mohou snadno znehodnotit pufr již během krátké doby i přesto, že je pufr uchováván při teplotě kolem 4 ºC (např. fosfátový pufr lze uchovávat maximálně týden v lednici). Existuje několik možností jak zabránit mikrobiální kontaminaci. Nejjednodušší způsob je skladování pufru při teplotě blízké nule nebo připravit si zásobní roztok o vysoké koncentraci, který se před použitím naředí. Zde je nutno počítat s tím, že některé pufrové systémy mění své pH při ředění. Jinou možností je roztok pufru sterilizovat buď filtrací (přes filtry 0,2 nebo 0,45 µm) nebo autoklávováním, anebo se přidá azid sodný v koncentraci 0,02 % (3 mmol/l). Větší množství pufru lze uchovávat ve zmraženém stavu. Před použitím je nutno rozmrazit celé množství pufru a roztok zamíchat. Po odebrání potřebného objemu je možné zbytek opět zmrazit. Biochemický ústav LF MU 4 Zvláštní pozornost při přípravě a případné sterilizaci zasluhují pufry, obsahující hydrogenuhličitan. Při přípravě se roztok míchá jenom krátce a ne moc intenzivně. Pufr se musí uchovávat v uzavřených nádobách, sterilizovat jej lze pouze filtrací (nelze jej autoklávovat, při teplotě nad 20 ºC se HCO3 − začíná rozkládat na CO2 a CO3 2−). Některé pufry označujeme jako těkavé, tvořené složkami, jež mohou být snadno a úplně odstraněny z roztoku (mravenčí nebo octová kyselina, amoniak, uhličitan amonný, pyridin, triethanolamin). Biologické pufry. Některé pufrační směsi byly vyvinuty speciálně pro využití v biochemii. Označujeme je jako biologické pufry (v angl. literatuře nebo též po svém objeviteli jako Good’s buffer). Jedná se o pufry tvořené většinou N-substituovaným taurinem nebo glycinem, splňující určitá kriteria, velmi důležitá pro zajištění průběhu biochemických reakcích, např.: musí být dobře rozpustné ve vodě a současně nepropustné buněčnou membránou; pro zajištění maximální pufrační kapacity hodnota pKA kyselé složky musí být v blízkosti fyziologického pH (tj. pH 6–8); musí být chemicky stabilní a odolné vůči enzymové nebo neenzymové degradaci; neinterferují s běžně užívanými spektrofotometrickými metodami (neabsorbují záření nad 230 nm). Většinou se označují písmennými zkratkami, vzniklých z chemických názvů bazických složek, např. MES (2-morpholinoethanesulfonate), ADA (N-(2-acetamido)iminodiacetate), PIPES (piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonate), ACES (N-(2-acetamido)-2-aminoethane-sulfonate), BES (N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonate), TES (N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfo-nate), HEPES (N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N'-2-ethanesulfonate). PRAKTICKÁ ČÁST Úkol 8.1 Příprava hydrogenfosfátových pufrů s rozdílnými hodnotami pH Materiál: Roztoky hydrogenfosforečnanu sodného a dihydrogenfosforečnanu sodného (oba roztoky o stejné koncentraci 0,05 mol/l). 2 dělené pipety 10 ml, pipetovací nástavce, zkumavky, popisovač, pH-metr. Provedení:  Připravte 6 zkumavek a podle tabulky pipetujte do každé roztok báze (Na2HPO4) a roztok konjugované kyseliny (NaH2PO4). Celkový objem pufru je 10 ml.  Změřte pH připravených pufrů pomocí pH elektrody.  1. Vypočtěte a doplňte do tabulky koncentrace obou složek ve výsledném pufru (o objemu 10 ml) a hodnoty pH jednotlivých fosfátových pufrů (při dané iontové síle je pKA(H2PO4 ) ≈ 6,80).  2. Porovnejte hodnoty pH vypočtené a naměřené. Zkumavka 1 2 3 4 5 6 HPO4 2(ml) 2,0 4,0 5,0 6,0 8,0 9,0 [B] (mmol/l) H2PO4 (ml) 8,0 6,0 5,0 4,0 2,0 1,0 [HB] (mmol/l) pH vypočtené změřené Biochemický ústav LF MU 5  3. Na kterých dalších faktorech, kromě teploty, závisí výsledná hodnota pH pufrů?  4. Jaká je koncentrace připraveného hydrogenfosfátového pufru v jednotlivých zkumavkách?  5. Rozepište přesný návod pro přípravu 0,5 litru hydrogenfosfátového pufru o stejné koncentraci a hodnotě pH jako má pufr ve zkumavce č. 3 pomocí částečné neutralizace kyseliny fosforečné hydroxidem sodným (kon. H3PO4 je 85 % o hustotě 1,70 g/ml, Mr(H3PO4) = 98,00, Mr(NaOH) = 40,0).  6. Vyznačte do titrační křivky kyseliny fosforečné možné pufrační oblasti pH.  7. Vypočtěte pH fosfátového pufru, který obsahuje 138 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 7,8 mM Na2HPO4.12H2O a 1,4 mM KH2PO4 (pKA1 = 2,1; pKA2 = 7,2; pKA3 = 12,3). Úkol 8.2 Titrace pufru. Zjištění pufrační kapacity Materiál: Roztoky octové kyseliny a octanu sodného (oba roztoky 0,1 mol/l), odměrné roztoky HCl a NaOH (0,1 mol/l, přesná koncentrace zjištěná v předchozím praktickém cvičení). Plastové kádinky, nastavitelné dávkovače 10 ml, pH-metr, 2 byrety dělené po 0,1 ml s nálevkou na odměrné roztoky, magnetická míchačka, buničitá vata. Provedení: Příprava koncentrovaného pufru (20 ml)  Do plastové kádinky odměřte dávkovačem 10 ml roztoku octové kyseliny a 10 ml roztoku octanu sodného a pufr promíchejte. Příprava dvakrát zředěného pufru (20 ml)  Do plastové kádinky odměřte dávkovačem 5 ml roztoku octové kyseliny, 5 ml roztoku octanu sodného a 10 ml deionizované vody. Biochemický ústav LF MU 6 Titrace pufru kyselinou (postup stejný pro koncentrovaný i zředěný pufr)  Změřte pH-metrem výchozí hodnotu pH pufru s přesností na desetiny.  Roztok pufru titrujte 0,5 ml přídavky odměrného roztoku HCl. Po každém přídavku odměrného činidla promíchejte a odečtěte hodnotu pH. Titraci ukončete při dosažení hodnoty pH < 3. Titrace pufru zásadou (postup stejný pro koncentrovaný i zředěný pufr)  Změřte pH-metrem výchozí hodnotu pH pufru s přesností na desetiny.  Roztok pufru titrujte 0,5 ml přídavky odměrného roztoku NaOH. Po každém přídavku odměrného činidla promíchejte a odečtěte hodnotu pH. Titraci ukončete při dosažení hodnoty pH < 12.  Naměřené údaje zaznamenejte ve formě tabulky do protokolu:  8. Jaká je koncentrace připraveného koncentrovaného octanového pufru?  9. Porovnejte naměřené výchozí hodnoty pH koncentrovaného a zředěného pufru a srovnejte je s teoretickou (vypočtenou) hodnotou.  10. Z naměřených údajů sestrojte na milimetrový papír do jednoho grafu titrační křivky obou pufrů. Titrační křivka octanového pufru a postup při určení jeho pufrační kapacity (pro ∆pH = 0,5) VHCl (ml) pHkonc. pufr pHzřeď. pufr VNaOH (ml) pHkonc. pufr pHzřeď. pufr 0 … … 0 … … V ( HCl) V ( NaOH) VOH-VH+ pH = 0,5 výchozí pH pH = 0,5 0 pH pKA nOH- = cNaOH VOH-nH+ = cHCl VH+ ½ ½ ΔpHpufru OH OH- V n   ΔpHpufru H H V n     Biochemický ústav LF MU 7  11. Z titračních křivek koncentrovaného a zředěného pufru odečtěte jaké látkové množství HCl (nH+) a látkové množství NaOH (nOH-) vyvolá v připravených pufrech pH = ±0,5.  12. Vypočtěte a porovnejte pufrační kapacity βH+ a βOH− koncentrovaného a zředěného octanového pufru. Jak zředění pufru ovlivní jeho pufrační kapacitu?  13. Srovnejte koncentraci koncentrovaného pufru se zjištěnou hodnotou pufrační kapacity.  14. Podle sestrojeného grafu rozhodněte, zda octanový pufr vykazuje stejnou pufrační schopnost do kyselé i alkalické oblasti?  15. S použitím titrační křivky vypočtěte pufrační kapacitu βH+ a βOH− (pro pH = 0,5) koncentrovaného pufru, jehož složení odpovídá na křivce bodu s hodnotou pH = 5,7 (výchozí bod).  16. Na základě výsledků zdůvodněte, zda kapacita pufru závisí a) na celkové koncentraci pufru (tzn. hodnotě [B] + [HB]); b) na poměru složek [B]/[HB].  17. Jaký vliv má ředění na hodnotu pH pufru?  18. Pro jakou oblast pH lze použít octanový pufr?  19. Doplňte do tabulky vybraných jednoduchých pufrů bazickou a kyselou pufrační složky: Efektivní rozsah pH pKA (25 °C) Název pufru Pufrační báze Pufrační kyselina 1,7-2,9 5,8-8,0 - 2,15 7,20 12,33 (hydrogen)fosfátový … … … … … … 2,2-3,6 8,8-10,6 2,35 9,78 glycinový … … … … 2,2-6,5 3,0-6,2 5.5-7.2 3,13 4,76 6.40 citrátový … … … … … … 3,6-5,6 4.76 octanový (acetátový) … … 6,0-8,0 9,5-11,1 6,35 10,33 hydrogenuhličitanový (bikarbonátový) uhličitanový … … … … 6,8-8,2 7,48 HEPES* … … 7,5-9,0 8,06 Trizma (tris)+ … … 8,5-10,2 - - 9,23 12,74 13,80 borátový Na2B4O7 … 1,8-12,0 - univerzální Brittonův-Robinsonův H3PO4 CH3COOH H3BO3 +tris(hydroxymethyl)aminomethan; * 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinthansulfonová kyselina NN CH2CH2SO3 - HOCH2CH2 H + CH2N CH2OH CH2OH CH2OH