11. cvičení Biochemický ústav LF MU 2018
1
SPEKTROFOTOMETRIE
Metody kvantitativní analýzy se často zakládají na určení absorpce elektromagnetického záření z oblasti
ultrafialové (vlnová délka λ < 380 nm) nebo viditelné části spektra (λ = 380–780 nm) stanovovanou
látkou. Molekuly absorbují elektromagnetické záření pouze takové energie (kvantum energie), která je
přivede do vyššího (excitovaného) energetického stavu. Tuto energii lze vyjádřit pomocí vztahu:
ΔE = h ν = h c / λ
kde h je Planckova konstanta, ν frekvence absorbovaného záření, c rychlost světla ve vakuu, λ vlnová délka absorbovaného záření.
Vlnová délka (λ) absorbovaného elektromagnetického záření, je tedy určena vzdáleností dvou sousedních
energetických hladin (ΔE) molekul dané látky, mezi kterými molekuly přechází.
Pokud monochromatické záření (záření o dané vlnové délce) o zářivém toku P0 prochází vrstvou
absorbující látky b, dochází k pohlcení (absorpci) části záření, takže vycházející elektromagnetické záření
má zářivý tok P nižší, než záření dopadající.
Množství absorbovaného záření může být vyjádřeno dvojím způsobem:
- jako transmitance (propustnost): T = P / P0
- často se udává jako procento prošlého záření T = 100 P / P0 %
- jako absorbance: A = log(P0 / P) = log(1 / T) = −logT
- zastaralé pojmy pro absorbanci jsou optická hustota (OD, z angl. optical density)
nebo extinkce (E) se nedoporučují používat
Vztah mezi transmitancí a absorbancí vyjadřuje následující schéma:
Pokud nedochází k absorpci záření při jeho průchodu látkou, tak transmitance je rovna 100 %
a absorbance je nulová. Pokud je veškeré záření pohlceno roztokem, tak je transmitance nulová
a absorbance je rovna nekonečnu.
Velikost absorpce elektromagnetického záření závisí na třech faktorech, na vlnové délce záření,
koncentraci absorbující látky v roztoku a na tloušťce měřené vrstvy.
Při dané vlnové délce záření existuje mezi koncentrací absorbující látky a absorbancí přímá úměra. Tuto
závislost vyjadřuje Lambertův-Beerův zákon (někdy označovaný pouze jako Beerův zákon):
A = bc
kdeje molární absorpční koeficient (neboli molární absorptivita, jeho hodnota odpovídá absorbanci látky o koncentraci
1 mol/l a tloušťce měřené vrstvy 1 cm), c je látková koncentrace (mol/l) a b tloušťka měřené vrstvy (cm).
Někdy je absorbující látka charakterizována pomocí absorpčního koeficientu a (absorptivity, extinčního koeficientu k), který
odpovídá absorbanci látky o koncentraci 1 g/l a b = 1 cm nebo procentuálního absorpčního koeficientu 1%, který odpovídá
absorbanci látky o koncentraci 1 % (např. 10 mg/ml) a b = 1 cm (pro přepočet mezi koeficienty platí: a = /M = 0,1 1%).
PP0
b
%Transmitance
Absorbance
Biochemický ústav LF MU 2018 11. cvičení
2
Absorbance je aditivní veličina, tj. pokud je v roztoku přítomno více látek, které absorbují při dané vlnové
délce, tak celková absorbance roztoku je dána vztahem:
Acelková A1 A2 + ... 1 b c1 2 b c2 + ...
Lambertův-Beerův zákon platí pouze pro:
 monochromatické záření
 zředěné roztoky (< 10−2
mol l−1
)
 homogenní roztoky (nedochází k rozptylu záření na částicích vzorku)
 vzorky, které nefluoreskují ani nefosforeskují při dané vlnové délce
 monomerní látky, které v roztoku neasociují
Závislost absorbance na vlnové délce nazýváme absorpční spektrum (absorpční křivka). Absorpční
spektrum je charakteristické pro danou sloučeninu. Praktický význam mají absorpční maxima křivky
a jim příslušející vlnové délky. Ke stanovení koncentrací absorbujících látek se volí zpravidla vlnové
délky těchto maxim, poněvadž stanovení je nejpřesnější (viz obrázek) a současně i nejcitlivější
(viz Lambertův-Beerův zákon).
Z absorpční křivky lze též vypočítat hodnoty molárních absorpčních koeficientů, známe-li koncentraci
absorbující látky, pro kterou byla absorpční křivka sestrojena:
max
=  Amax / bc
Protože hodnota molárního absorpčního koeficientu závisí na konkrétních experimentálních podmínkách,
tak se v podstatě vždy při spektrofotometrických stanoveních koncentrace vychází z kalibračního grafu.
K jeho zhotovení se připraví z nejčistšího preparátu stanovované látky (standardu) standardní roztok
a jeho ředěním řada kalibračních roztoků. Každý kalibrační roztok se zpracuje stejným postupem jako
vzorky s neznámou koncentrací. Poté se změří jejich absorbance proti rozpouštědlu nebo činidlu bez
měřené látky (slepému vzorku/pokusu, angl. blank). Naměřené hodnoty se vynesou do grafu jako
závislost absorbance kalibračních roztoků na jejich koncentraci. Závislost je lineární pro rozsah
koncentrací, ve kterém platí Lambertův-Beerův zákon. Odchylky od přímky jsou běžné u vysokých
koncentrací. Body ležícími v lineární části grafu se proloží přímka (jejíž obecná rovnice je y = k x + q).
a
b
Absorbance
Koncentrace
A
λmax
Amax
a
b
11. cvičení Biochemický ústav LF MU 2018
3
Pokud se měří absorbance proti slepému vzorku, tak kalibrační přímka prochází počátkem souřadnic:
A = k c
k je směrnice přímky (tj. tangenta úhlu, který svírá přímka s osou x):
k = c
Převrácená hodnota směrnice přímky 1/k se nazývá kalibrační faktor
(F):
F = k = c/A
Pro výpočet koncentrace analytu v neznámém vzorku potom platí:
cx = Ax F
Poněvadž standard i analyzovaná látka mají za daných experimentálních podmínek stejnou hodnotu
molárního absorpčního koeficientu tj. εstd = εx, získáme po dosazení z Lambertova-Beerova vztahu za
ε rovnici Astd/(b cstd) = Ax/(b cx), z které pro koncentraci analytu v neznámém vzorku vyplývá:
cx = cstd Ax / Astd
Koncentraci analyzované látky cx lze vypočítat ze změřených absorbancí analyzovaného vzorku Ax
a kalibračního roztoku Astd o koncentraci cstd, která je blízká koncentraci analytu v neznámém vzorku cx.
Absorbance jsou měřeny proti slepému vzorku.
Látky barevné (tj. látky výrazně absorbující viditelné záření) lze spektrofotometricky stanovit přímo.
Látky bez výrazného absorpčního maxima ve VIS/UV oblasti je třeba nejprve reakcí s vhodným činidlem
(derivatizací) převést na zbarvený produkt. Podmínkou je, aby množství barevného produktu bylo
úměrné koncentraci stanovované látky. Intenzita zabarvení roztoku tímto barevným produktem je pak
přímo úměrná koncentraci analytu v původním analyzovaném roztoku a lze ji změřit spektrofotometrem.
Při spektrofotometrickém stanovení koncentrace je nutné dodržovat určité zásady:
 kyvety plňte do ¾ jejich objemu
 vnější stěny kyvety udržujte čisté a suché
 nedotýkejte se prsty stěn kyvety, kterými prochází světlo
 kyvetu držte pouze za boční stěny, které bývají matované nebo vroubkované
 roztok v kyvetě musí být bez bublin, příp. odstraňte sklepnutím nebo promícháním tyčinkou
 kyvetu vkládejte do držáku vždy stejnou stranou ke zdroji světla, např. ocejchovanou stranou
 měření absorbance v rozmezí 0,2–0,7 poskytuje nejpřesnější výsledky při stanovení koncentrace
Přístroje, které se používají k měření zářivého toku v ultrafialové nebo viditelné oblasti spektra se nazývají fotometry nebo
spektrofotometry. Fotometry jsou jednodušší a používají k vymezení úzkého pásma vlnových délek filtry. Spektrofotometry
používají většinou mřížkový monochromátor, který dovoluje kontinuálně měnit vlnovou délku měření v širokém intervalu.
Spektrofotometr mívá zpravidla citlivější detektor než fotometr a obvykle dva zdroje světla (zvlášť pro UV a zvlášť pro VIS
oblast).
Všechny fotometry a spektrofotometry sestávají ze tří základních částí:
 zdroje zářivé energie
 filtru nebo mřížky pro izolaci úzkého pásma zářivé energie
 detektoru měřicího zářivou energii propuštěnou vzorkem.
∆c
A
∆A
c
°
°
Ax
cx

°
°
°
Biochemický ústav LF MU 2018 11. cvičení
4
Zjednodušené schéma jednopaprskového spetrofotometru SPEKOL 11
Ve viditelné oblasti je nejčastěji používaným zdrojem světla žárovka s wolframovým vláknem. Její spektrální charakteristiku lze
významně zlepšit halogenovou atmosférou. Kromě toho jsou rozšířené různé typy zdrojů elektrického výboje. V UV oblasti to
jsou deuteriové výbojky (190 až 375 nm), pro UV + VIS spektra xenonové a rtuťové výbojky. Excitace výbojky je vyvolána
průchodem elektronů plynem.
Pro selektivitu, správnost a citlivost všech měření je nutné vybrat úzké pásmo vlnových délek, vyzařovaných ze
širokospektrálního zdroje. K tomu účelu se obvykle používají interferenční filtry nebo reflexní mřížky (nemají ztrátu světla
absorpcí). Mřížka je vedle vstupní štěrbiny, vymezující svazek heterochromatického záření, a výstupní štěrbiny, propouštějící
pásmo světla blízké nominální vlnové délce, nejdůležitější částí optického zařízení k získání monochromatického světla, tzv.
monochromátoru.
Detektory používané ve VIS a UV oblasti převádějí zářivou energii na elektrickou energii. Používají se fotonky, fotonásobiče a
diodová pole. Ve fotonkách se elektrony uvolněné z fotokatody po dopadu fotonů pohybují k anodě účinkem napětí. Je-li
fotonka plněná plynem, elektrony cestou ionizují jeho molekuly, takže na anodu dopadne větší počet elektronů, než byl uvolněn z
katody. Fotonásobiče jsou uspořádány tak, že elektrony dopadnou po ozáření fotokatody na první zesilovací elektrodu, tzv.
dynodu, kde je počet fotoelektronů násoben sekundární emisí. Takových dynod je ve fotonásobiči 10 i více a výsledný efekt
zesílení může být i několik milionů. V detektoru diodového pole je světlo rozptylováno mřížkou na pole mnoha (např. 200)
světlocitlivých diod a vzniká napětí, které je převedeno na digitální signál. Tyto detektory umožňují měřit současně celé
spektrum, např. v rozsahu 200 až 700 nm.
Pro fotometrická měření se používají kyvety skleněné a plastové (pro viditelnou oblast spektra) nebo křemenné pro měření
v ultrafialové oblasti. Tloušťka kyvety bývá obvykle 1 cm (při manuálním měření, analyzátory s fotometrickou detekcí používají
kyvety menších rozměrů), běžné je i používání průtokových kyvet a průtokových cel. Kyveta s roztokem měřeného vzorku se
vkládá mezi filtr, resp. mřížku a detektor.
PRAKTICKÁ ČÁST
Úkol 11.1 Spektrofotometrické stanovení salicylové kyseliny
Acetylsalicylová kyselina (ASA, z angl. acetylsalicylic acid, pKA = 4,57) bývá jednou z účinných látek
antipyretik (látek snižujících horečku). V organismu je ASA při průchodu játry hydrolyzována na
salicylát. Spektrofotometrické stanovení salicylátu je založeno na metodě, při níž je bezbarvý salicylát
převeden v kyselém prostředí na barevný komplex se železitými ionty. Budeme předpokládat, že se
vytváří komplexní kation s l molekulou salicylové kyseliny:
COONa
ONa
+ 2 H+
+ Fe3+
C
O
O
O
Fe3+
H
H
+ 2 Na+
11. cvičení Biochemický ústav LF MU 2018
5
Takto lze nepřímo stanovit i množství ASA v tabletě medikamentu po alkalické hydrolýze na salicylát:
Materiál: Salicylát sodný (Mr = 160,10), železité činidlo (dusičnan železitý, 0,1 mol/l v 0,12 mol/l HCl), váženka,
odměrná baňka 10 ml, nálevka. Analytické váhy, nastavitelný mikrodávkovač 100–1000 µl. Dělené
pipety 2 ml, mikrozkumavky 1,5 ml, nízké zkumavky, tyčinka, popisovač. Vzorek s neznámou
koncentrací salicylátu, spektrofotometr.
Provedení:
a) Příprava kalibračních roztoků salicylátu
 Připravte 10 ml standardního roztoku salicylátu sodného o látkové koncentraci 5 mmol/l rozpuštěním
připravené navážky.
 Ředěním standardního roztoku salicylátu připravte do očíslovaných mikrozkumavek řadu kalibračních
roztoků dle tabulky. Před odměřováním vypočtěte objemy demi-vody a standardního roztoku potřebné
k přípravě právě 1 ml kalibračního roztoku o dané koncentraci:
Roztok č. Standardní roztok (ml) Demi-voda (ml) c (mmol/l)
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
b) Sestrojení absorpční křivky komplexu Fe3+
-salicylát
 Do dvou zkumavek odměřte přesně skleněnou pipetou po 2 ml železitého činidla.
 Do prvé zkumavky přidejte 100 µl kalibračního roztoku č. 3, do druhé 100 µl demi-vody. Důkladně
promíchejte a ponechte 10 minut stát.
 Pomocí spektrofotometru Spekol 1300 nebo Hélios δ (návod bude přiložen u přístroje) změřte
absorpční spektrum komplexu Fe3+
-salicylát v prvé zkumavce v rozsahu vlnových délek 450–600 nm.
Roztok ve druhé zkumavce použijte jako slepý vzorek.
 1. Zaznamenejte hodnoty absorbancí pro všechny vlnové délky.
 2. Vyneste graficky na milimetrový papír závislost absorbance na vlnové délce záření.
 3. Určete nejvhodnější vlnovou délku (maximální absorbance) pro stanovení koncentrace salicylátu.
 4. Vypočtěte hodnotu molárního absorpčního koeficientu komplexu Fe3+
-salicylát v jeho absorpčním
maximu (uvědomte si správnou hodnotu koncentrace komplexu Fe3+
-salicylát v měřeném roztoku
(0,1 ml kalibrátoru č. 3 + 2,0 ml železitého činidla)).
COOH
O
+ 3 NaOH
C CH3
O COONa
ONa
+ CH3COONa + 2 H2O
100 °C/10 min
Biochemický ústav LF MU 2018 11. cvičení
6
c) Zhotovení kalibračního grafu a stanovení koncentrace salicylátu ve vzorku
 Do sedmi zkumavek odměřte přesně skleněnou pipetou 2 ml železitého činidla.
 Do 1. až 5. zkumavky odměřte po 100 µl příslušného kalibračního roztoku (ke zhotovení kalibračního
grafu), do 6. zkumavky 100 µl neznámého vzorku a do 7. zkumavky 100 µl demi-vody (slepý pokus).
Důkladně promíchejte a ponechte 10 minut stát.
 Změřte absorbanci všech roztoků při vlnové délce absorpčního maxima, které jste určili
v předchozí úloze, proti slepému pokusu.
 5. Ze získaných hodnot absorbance kalibračních roztoků sestrojte kalibrační graf.
 6. Z lineární části grafu vypočtěte kalibrační faktor.
 7. Stanovte koncentraci salicylátu v neznámém vzorku jak odečtením z kalibračního grafu, tak
výpočtem pomocí kalibračního faktoru.
 8. Jaké množství fotonů je absorbováno roztokem, tj. jaká je hodnota T v %, jeli hodnota
absorbance rovna: a) 0,3 b) 1,0 c) 2,0?
 9. V jakých jednotkách se udává absorbance?
 10. V jakých jednotkách se udává molární absorpční koeficient?
 11. Vypočtete koncentraci hovězího sérového albuminu v mg/ml, jestliže roztok albuminu má
absorbanci A280 = 1,334. Procentuální absorpční koeficient pro albumin 1%
280ε = 6,67.