Hmotnostní spektrometrie RNDr. Alena Mikušková FN Brno – Pracoviště dětské medicíny, OKB mikuskova.alena@fnbrno.cz Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry) §Fyzikálně-chemická metoda •využívá separace urychlených ionizovaných částic ve vakuu podle jejich hmotnosti při jejich průchodu magnetickými a elektrickými poli § §MS vyvinuta počátkem 20.století, •v klinické biochemii - již několik desetiletí ∙identifikace a stanovení nízkomolekulárních látek na základě měření hmotnosti jejich molekul (detekce látek ve spojení s plynovou chromatografií - GC) •První polovina 90. let 20.století - nové techniky ∙umožnily využívat metodu pro LC (i pro látky vysokomolekulární) • •MS - nejdynamičtěji se rozvíjející metodika současné biochemie ∙vedle metod molekulové genetiky Hmotnostní spektrum • Výstup MS - hmotnostní spektrum • - čarový diagram • - vodorovná osa - hodnota m/z (hmotnost / náboj iontu) • - svislá osa - odezva detektoru nebo relativní zastoupení daného iontu mass 2 Hmotnostní spektrometr • - tři funkční celky: • •Iontový zdroj - ionizace neutrálních molekul měřené směsi: –molekula analytu je převedena do plynné fáze (do vysokého vakua) –získává charakteristický náboj •Iontový separátor –rozdělení iontů různých hmotností –ion je urychlen –z charakteru jeho pohybu vakuovaným prostorem lze vypočítat jeho m/z • •Detektor –detekce iontů po jejich separaci podle hodnoty m/z –určení relativní intenzity (četnosti) jednotlivých iontů Iontový zdroj - Ionizační techniky * Existuje celá řada ionizačních technik * Cíl: vytvoření nabité částice, která je následně analyzována * Použitá technika záleží na - charakteru analyzovaných látek • - separační metodě, na kterou je MS napojen (GC/MS, LC/MS, bez napojení na separaci) •GC/MS: LC/MS, CE/MS, •- Elektronová ionizace EI MS s přímým nástřikem •- Chemická ionizace CI - Elektrospray ESI MALDI • MS electron impact schema maldi 2 ESI Elektronová ionizace, EI * Iontový zdroj - ionizace molekul analytu v plynném stavu pomocí proudu elektronů • • - Z molekuly při srážce s paprskem • elektronů odtržen elektron • - molekula získává kladný náboj • - Následná fragmentace (rozpad) • molekuly přebytkem energie • •EI - tvrdá ionizační technika (fragmentace) MS electron impact •fragmenty rozděleny v další části analyzátoru dle hodnoty m/z a detegovány – - separace magnetickým analyzátorem, – kvadrupólem •Pouze pro teplotně stálé nízkomolekulární látky (50 – 800 Da) • - Dalton – jednotka molekulové hmotnosti P9290055a Elektronová ionizace (fragmentace) •- Hmotnostní spektrum metanolu meoh tabulka fragmentace methanol methanol Chemická ionizace CI * „Měkčí“ varianta elektronové ionizace •Do iontového zdroje přiváděn ionizační plyn (př.metan) –proud elektronů ionizuje nejdříve molekuly tohoto plynu –tyto teprve předávají energii molekule analytu –šetrnější, nedochází k tak rozsáhlé fragmentaci • Srovnání hmotnostního spektra s elektronovou ionizací a chemickou ionizací P9290055a srovnání EI,CI Elektrospray ionizace, ESI §Eluát prochází kapilárou, na ni vloženo vysoké napětí §vzniká sprej vysoce nabitých kapiček §následný postupný odpar rozpouštědla §vznikají ionty (i vícenásobně nabité) §jsou dále separovány (kvadrupól, TOF) §Měkká ionizační technika (bez fragmentace) §Vhodné pro nízko- i vysokomolekulární látky (peptidy, sacharidy, proteiny, nukleové kyseliny,...) ESI • • LC-MS ESI orez Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - MALDI * Vzorek v roztoku smíchán s matricí –matrice - deriváty nízkomolekulárních aromatických kyselin •absorbují energii laserového záření ve VIS nebo blízké UV oblasti * Roztok nakápnut a vysušen (vykrystalizován) na MALDI destičce * Pulzní ozáření směsných krystalů zábleskem laseru –prudké odpaření látek do vakua –ionizovaná matrice strhává sebou molekulu analytu a ionizuje ji –ionty urychleny stejnosměrným elektrickým polem do TOF analyzátoru schema_maldi MALDI - Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization §Velmi měkká, šetrná technika – i pro vysokomolekulární látky (proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy) §Ionty dále separovány analyzátorem TOF • Matrice • • •Spotovací destička •Spotovací destička na monitoru maldi destička maldi destička na monitoru matrix Spotovací destička orez 1 MS – separace iontů •Iontový separátor: rozdělení iontů různých hmotností –ion je urychlen –z charakteru jeho pohybu vakuovaným prostorem lze vypočítat poměr jeho hmotnosti a náboje m/z • • •Magnetický sektorový analyzátor Kvadrupól • • • • • • • • Iontová past • • TOF quadrupole sektor schema orez maldi-tof-ms kvadrupolová past Magnetický sektorový analyzátor §Nejdéle používaný a nejlépe prozkoumaný, stále se vyvíjí §Klasický typ detektoru, využívá skutečnosti, že dráha nabité částice se v magnetickém poli zakřivuje tím více, čím má vyšší náboj a nižší hmotnost §Malé molekuly – pouze GC/MS (EI) §Velmi přesný, ve své moderní verzi velmi nákladný (v klin. biochemii není • používaný) * magnetický analyzátor sektor orez Kvadrupol quadrupole §Konstrukce - 4 kovové tyče, na ně vloženo stejnosměrné a střídavé napětí §Ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, začnou oscilovat §Při vhodné kombinaci obou složek napětí prochází kvadrupolem pouze ionty o určitém poměru m/z §změnou vkládaných napětí je možné nechat projít kvadrupolem postupně ionty v celém rozsahu m/z §Lze použít pro GC/MS i LC/MS (v kombinaci s EI, CI, ESI,…), –pouze pro menší molekuly GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 015 TOF – analyzátor „Time of Flight“ (průletový) §Deteguje hmotnosti ionizovaných molekul na základě doby jejich letu evakuovanou trubicí §rychlosti letu závisí na hodnotách efektivní hmotnosti m/z –- lehčí molekula letí rychleji §Lineární nebo reflektronový mód (reflektron - vyšší rozlišovací schopnost) maldi-tof-ms TOF – analyzátor „Time of Flight“ (průletový) * TOF - teoreticky neomezený rozsah hmotností, pro které se dá používat –v praxi se mu dává přednost pouze pro velké molekuly • * V kombinaci s MALDI, ESI TOF 2 TOF Iontové pasti * stejné fyzikální principy jako kvadrupól –regulace pohybu iontu v určitém prostoru elektrickými poli §ionty se pohybují po určitou dobu v prostoru iontové pasti §vypuzovány z pasti selektivně podle hodnoty m/z * kvadrupolová past Orbitrap Detektor - detekce iontů po jejich separaci podle hodnoty m/z - určení relativní intenzity (četnosti) jednotlivých iontů §Fotonásobič • - před vlastním fotonásobičem umístěna • fosforová destička • - na ni dopadají částice z konverzní dynody • - emise fotonů • - fotony dopadají na fotokatodu • - fotoelektrický jev - emise elektronů • - elektrony zmnoženy stejně jako v elektronovém • násobiči § Elektronový násobič - série dynod se vzrůstajícím potenciálem - ion narazí na povrch první dynody - emise elektronu - po jeho dopadu na další dynodu - vícenásobná emise - kaskádový efekt - velké množství elektronů - detekce detektory orez 1 detektory orez 2 detektory orez 3 Detekce - hmotnostní spektrum §Skenovací mód = zobrazí všechny fragmenty zvoleného rozmezí m/z § § § § • §SIM mód (Selection Ion Monitoring) – způsob, kdy přístroj registruje pouze několik zvolených fragmentů (zvýšení citlivosti) * D:\Dokumenty AM\SIM.png Tandemová hmotnostní spektrometrie, MS/MS §MS/MS - ionty podrobeny dvěma hmotnostním analýzám (zapojení dvou či více iontových separátorů v tandemu) §MS/MS umožňuje rychlou analýzu bez použití separačních metod (GC, LC) ve složité matrici, velice citlivá metoda § •Standardně např. trojitý kvadrupól QqQ: •První kvadrupól vybírá prekursorový ion •Ve druhé části - kolizní cele - probíhá fragmentace prekursorového iontu (srážkou iontu s atomy inertního plynu) •Poslední kvadrupól analyzuje fragmenty • • Pozn.: QqQ v kombinaci s ESI • (přímý nástřik) se používá pro • novorozenecký screening • • • - Obdobně TOF-TOF analyzátor • - Hybridní Q-TOF analyzátor • (kvadrupól – TOF) QQQ Kvantita v hmotnostní spektrometrii •Kvantifikace látek - metoda vnitřního (interního) standardu (IST) * IST pro stanovení určité látky - analogická sloučenina nebo homolog –co nejpodobnější chemicko-fyzikální vlastnosti jako stanovovaná látka –látka, která se v původním zkoumaném vzorku nevyskytuje * IST se přidává do vzorku již na začátku zpracování –pro potlačení vlivu matrice či kontaminace na účinnost ionizace analytu * IST se přidává do všech vzorků ve stejné koncentraci * Z MS spektra se po analýze vyhodnocuje poměr intenzit fragmentů typických pro stanovovanou látku a IST • Pozn.: Pro kvantifikaci je vhodné použití selektivního záznamu iontů (SIM – Selection Ion Monitoring) – způsob, kdy přístroj registruje pouze několik zvolených fragmentů (zvýšení citlivosti) • nejpřesnější postup: • metoda izotopického zřeďování • IST - izotopicky značený standard • stanovované látky • - identické chemicko-fyzikální vlastnosti • - nejčastěji deuterovaný • • mebromide BrcH Příklady použití – GC/MS §Analýza neznámých složek směsi • - hmotnostní spektrum pro každou • složku směsi • - porovnání s databází spekter • v počítači - identifikace §Potvrzení či vyloučení metabolitů, které svědčí pro určité metabolické onemocnění §Kvantifikace určitých metabolitů §Toxikologie – léky, drogy, alkohol § • Ukázka – organické kyseliny v moči GC-MS GC-MS2 schema gcms Příklady použití - LC/MS, LC/MS/MS §Toxikologické analýzy §Farmakokinetické studie, stanovení léků §Proteomika / metabolomika • • Stanovení léků LC/MS (LC/MS/MS) • • • • • • • • • • • • •Pozn.: přístroj registruje pouze dva fragmenty typické • pro danou molekulu (=selektivní záznam iontů = Selection • Ion Monitoring = SIM) LC-MS LC MS MS léky LC MS MS Příklady použití – MS/MS -MS/MS analýza bez použití separační metody (GC, LC) • - uspořádání ESI – trojitý kvadrupol: - - - - - - •Novorozenecký screening dědičných poruch metabolismu •- Stanovení markerů dědičných poruch metabolismu aminokyselin a mastných kyselin ze suché krevní • kapky (15 různých metabolických poruch, • např. fenylketonurie) • newborn_health tandem MS odběr Příklady použití - MALDI-TOF * Analýza biomolekul –proteiny –peptidy –oligosacharidy –nukleotidy… – – – §Identifikace mikroorganismů • po extrakci proteinů z bakterií nebo i metodou celých buněk §MALDI - IMS (imaging mass spectrometry) zobrazení rozložení proteinů i nízkomolekulárních látek ve tkáních přímou „in-situ“ analýzou MALDI - tkáň proteiny z bakterie maldi proteiny SELDI – Surface Enhanced Laser Desorption Ionization • Analýza proteinů pomocí vazby na předpřipravený povrch pevné fáze proteinového čipu §Povrch čipu - tvořený protilátkou, receptorem, ligandem, chemickou úpravou §Po nanesení vzorku - navázání proteinů k povrchu adsorpcí, elektrostatickou interakcí, na afinitním principu,… §Promytí mikročipu - odstranění nenavázané složky §Analýza – viz MALDI - TOF §Vzorek komplexní směsi proteinů lze analyzovat současně na několika různých sorbentech, aby byly navázány veškeré proteiny ze vzorku §Čipy mohou být vyrobeny dle požadavku zákazníka SuperSELDI Děkuji za pozornost… lidi, úsměv