Aplikované analytické a instrumentální
techniky v laboratorní medicíně
LF MU bakalářský obor Zdravotní laborant
PřF MU bakalářský obor Aplikovaná biochemie
Kolektiv autorů
2017
Redakce:
doc. MUDr. Milan Dastych, CSc., MBA
Autorský kolektiv:
RNDr. Miroslava Beňovská, Ph.D.
RNDr. Petr Breinek
MUDr. Dana Bučková, Ph.D.
doc. MUDr. Milan Dastych, CSc., MBA
Mgr. Jana Gottwaldová
RNDr. Alena Mikušková
Předkládaný učební text je určen pro technicky zaměřené bakalářské studijní programy.
Obsahuje popis principů základních analytických a instrumentálních technologií používaných
v medicínských laboratořích. Značný prostor je věnován praktickým aplikacím uvedených
principů. Jsou uvedena jednotlivá, často unikátní řešení různých výrobců. Obsah učebního
textu poskytuje přehled o aktuální situaci v používání laboratorní techniky v rutinních
medicínských laboratořích.
Učební text vznikl jako součást řešení projektu Operačního programu vzdělávání pro
konkurenceschopnost, jehož řešitelem je Masarykova univerzita.
Milan Dastych
OBSAH
1. Analytická a perianalytická automatizace a robotizace ................................................... 8
1.1. Automatické biochemické analyzátory ........................................................................... 8
1.1.1. Princip analyzátoru................................................................................................... 9
1.1.2. Součásti automatického analyzátoru – hardware a software.................................. 10
1.1.3. Přínos zavedení automatických analyzátorů .......................................................... 14
1.1.4. Integrované a modulární systémy .......................................................................... 15
1.1.5. Praktické aplikace .................................................................................................. 15
1.1.6. Znaky moderních analyzátorů................................................................................ 17
1.1.7. Moderní laboratorní provozy ................................................................................. 18
1.1.8. Klinický význam .................................................................................................... 18
1.2. Perianalytická automatizace a robotizace...................................................................... 19
1.2.1. Funkce perianalytických systémů .......................................................................... 19
1.2.2. Základní části robotizovaných perianalytických systémů...................................... 19
1.2.3. Jednotlivé kroky robotizovaného preanalytického procesu: .................................. 20
1.2.4. Typy perianalytické automatizace.......................................................................... 20
1.2.5. Příklady automatických perianalytických systémů na trhu.................................... 21
1.2.6. Robotický chlazený sklad....................................................................................... 22
1.2.7. Postup při automatizaci perianalytické a analytické fáze....................................... 23
1.2.8. Význam a výhody perianalytické automatizace..................................................... 23
1.3. LIS a informační technologie v klinických laboratořích............................................... 23
1.3.1. Elektronická žádanka, požadavek zaslaný v elektronické podobě......................... 24
1.3.2. LIS.......................................................................................................................... 24
1.3.3. Data manager, middleware..................................................................................... 25
1.3.4. Datové standardy.................................................................................................... 25
1.4. Automatizace vyšetření moče ....................................................................................... 25
1.4.1. Chemická analýza moče......................................................................................... 25
1.4.2. Automatizace morfologického vyšetření moče...................................................... 26
1.4.3. Klinický význam močové analýzy......................................................................... 27
2. POCT – testování v místě ošetření pacienta .................................................................... 29
2.1. Charakteristiky POCT................................................................................................... 29
2.2. Výhody POCT............................................................................................................... 29
2.3. Klasifikace POCT zařízení a přístrojů........................................................................... 30
2.3.1. Jednorázová POCT zařízení................................................................................... 30
2.3.2. Stolní POCT přístroje a POCT přístroje do dlaně k opakovanému měření ........... 31
2.3.3. In vivo POCT ......................................................................................................... 33
2.4. Dálková správa – centrální software ............................................................................. 33
2.4.1. Výhody softwarově řízených POCT systémů:....................................................... 34
2.5. Organizace a zajištění POCT ........................................................................................ 34
2.6. Klinický přínos POCT................................................................................................... 35
3. Elektroforéza ...................................................................................................................... 36
3.1. Princip elektroforézy..................................................................................................... 36
3.1.1. Popis základního technického uspořádání elektroforetické aparatury ................... 36
3.2. Rozdělení elektroforetických technik............................................................................ 38
3.2.1. Volná elektroforéza................................................................................................ 38
3.3. Hlavní typy gelové elektroforézy.................................................................................. 40
3.3.1. Gelová nedenaturační elektroforéza....................................................................... 40
3.3.2. Gelová denaturační elektroforéza........................................................................... 40
3.3.3. Kontinuální zónová elektroforéza ......................................................................... 41
3.3.4. Diskontinuální zónová elektroforéza ..................................................................... 41
3.4. Zpracování gelu po separaci - barveni gelů................................................................... 42
3.5. Vyhodnocení elektroforeogramů – detekce a kvantifikace........................................... 43
3.6. Základní elektroforetické techniky................................................................................ 43
3.6.1. Izoelektrická fokuzace (IEF).................................................................................. 43
3.6.2. Izotachoforéza ........................................................................................................ 44
3.6.3. Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE) ...................................................................... 45
3.6.4. Kapilární elektroforéza........................................................................................... 47
3.7. Praktické využití elektroforetických technik v klinické zdravotnické laboratoři ......... 49
3.7.1. Elektroforéza bílkovin krevního séra ..................................................................... 49
3.7.2. Elektroforéza bílkovin moče .................................................................................. 58
3.7.3. Elektroforéza bílkovin mozkomíšního moku........................................................ 60
3.8. Výrobci elektroforetických zařízení.............................................................................. 62
3.8.1. Automatizované systémy pro gelovou elektroforézu bílkovin .............................. 62
3.8.2. Automatizované systémy pro kapilární zónovou elektroforézu............................. 63
4. Chromatografie .................................................................................................................. 65
4.1. Princip chromatografie:................................................................................................. 65
4.2. Klasifikace chromatografických metod ........................................................................ 65
4.2.1. Chromatografie podle uspořádání systému............................................................ 65
4.2.2. Chromatografie podle skupenství mobilní fáze ..................................................... 66
4.2.3. Chromatografie podle separačního mechanismu ................................................... 66
4.2.4. Chromatografie podle složení mobilní fáze ........................................................... 68
4.2.5. Chromatografie podle účelu................................................................................... 69
4.2.6. Přehled chromatografických technik...................................................................... 69
4.3. Planární chromatografie ................................................................................................ 69
4.4. Kolonová chromatografie.............................................................................................. 70
4.4.1. Termodynamika a kinetika separace ...................................................................... 71
4.4.2. Plynová chromatografie, GC.................................................................................. 74
4.4.3. Kapalinová chromatografie .................................................................................... 77
4.4.4. Kvantitativní analýza.............................................................................................. 81
4.5. Příklady praktických aplikací chromatografických technik v klinické biochemii........ 81
4.5.1. Planární techniky.................................................................................................... 82
4.5.2. Ionexová chromatografie........................................................................................ 82
4.5.3. HPLC...................................................................................................................... 83
4.5.4. Plynová chromatografie ......................................................................................... 85
5. Hmotnostní spektrometrie................................................................................................. 86
5.1. Definice hmotnostní spektrometrie ............................................................................... 86
5.2. Hmotnostní spektrum .................................................................................................... 86
5.3. Hmotnostní spektrometr................................................................................................ 86
5.3.1. Iontový zdroj a základní ionizační techniky .......................................................... 87
5.3.2. Iontové separátory.................................................................................................. 92
5.3.3. Detektor.................................................................................................................. 96
5.4. Parametry hmotnostního analyzátoru............................................................................ 97
5.5. Tandemová hmotnostní spektrometrie, MS/MS, MSn
.................................................. 98
5.6. Kvantita v hmotnostní spektrometrii............................................................................. 99
5.7. Praktické aplikace MS, MS/MS v klinické biochemii .................................................. 99
5.7.1. Plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC/MS) ............................. 99
5.7.2. Kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC/MS, LC/MS/MS).. 100
5.7.3. Tandemová hmotnostní spektrometrie MS/MS (bez separační techniky) ........... 101
5.7.4. SELDI – Surface Enhanced Laser Desorption Ionization.................................... 101
5.7.5. Indukčně vázaná plazma (ICP-MS) ..................................................................... 102
6. Atomová absorpční .......................................................................................................... 103
6.1. Historie AAS............................................................................................................... 103
6.2. Atomová spektra ......................................................................................................... 103
6.3. Měření absorpce; Lambertův-Beerův zákon ............................................................... 103
6.3.1. Citlivost................................................................................................................ 104
6.3.2. Mez detekce.......................................................................................................... 104
6.3.3. Mez stanovitelnosti .............................................................................................. 104
6.4. Atomový absorpční spektrometr ................................................................................. 104
6.5. Zdroje primárního záření............................................................................................. 106
6.5.1. Výbojky s dutou katodou (Halow Catode Lamp…HCL) .................................... 106
6.5.2. Bezelektrodové výbojky (EDL) ........................................................................... 107
6.5.3. Laditelný barvivový laser..................................................................................... 107
6.5.4. Speciální zdroje.................................................................................................... 107
6.6. Atomizátor................................................................................................................... 107
6.6.1. Plamenová technika.............................................................................................. 107
6.6.2. Elektrotermické atomizátory ….ETA .................................................................. 110
6.6.3. Hydridová technika .............................................................................................. 114
6.7. Disperzní systém ......................................................................................................... 114
6.7.1. Reflexní difrakční mřížka..................................................................................... 114
6.7.2. Optický hranol...................................................................................................... 114
6.8. Detektory; fotonásobič ................................................................................................ 114
6.9. Korekce pozadí............................................................................................................ 115
6.9.1. Sekvenční korekce pozadí.................................................................................... 115
6.9.2. Simultánní korekce pozadí................................................................................... 115
6.10. Interference................................................................................................................ 118
6.10.1. Spektrální interference ....................................................................................... 119
6.10.2. Nespektrální interference ................................................................................... 119
6.11. Analytické aplikace................................................................................................... 119
7. Imunoanalytické metody ................................................................................................. 121
7.1. Antigeny...................................................................................................................... 121
7.2. Protilátky..................................................................................................................... 121
7.3. Interakce antigen – protilátka................................................................................. 122
7.4. Rozdělení imunoanalytických metod z různých hledisek........................................... 122
7.5. Kompetitivní (soutěživé) metody................................................................................ 123
7.6. Nekompetitivní (nesoutěživé) metody (sendvičová technika) .................................... 123
7.7. Heterogenní imunoanalýza...................................................................................... 124
7.8. Homogenní imunoanalýza....................................................................................... 124
8. Využití luminiscence v imunoanalýze............................................................................. 125
8.1. Luminiscence .............................................................................................................. 125
8.1.1. Druhy luminiscence.............................................................................................. 125
8.2. Fotoluminiscence ........................................................................................................ 125
8.2.1. Fluorescence......................................................................................................... 126
8.2.2. Fosforescence....................................................................................................... 127
8.3. Chemiluminiscence ..................................................................................................... 127
8.4. Luminofory, Fluorofory .............................................................................................. 128
8.5. Využití luminiscence................................................................................................... 128
8.6. Využití luminiscence na automatických imunochemických analyzátorech................ 129
8.6.1. Imunochemické analyzátory ................................................................................ 129
8.7. Chemiluminiscenční techniky na imunochemických analyzátorech – heterogenní
imunoanalýza ..................................................................................................................... 130
8.7.1. Chemiluminiscence s využitím akridinium esteru ............................................... 130
8.7.2. Enzymově zesílená chemiluminiscence ............................................................... 131
8.7.3. Elektrochemiluminiscence ................................................................................... 132
8.8. Chemiluminiscenční techniky na imunochemických analyzátorech – homogenní
imunoanalýza ..................................................................................................................... 133
8.8.1. Technologie LOCI................................................................................................ 133
8.9. Fluorescenční techniky na imunochemických analyzátorech - heterogenní
imunoanalýza ..................................................................................................................... 134
8.9.1. MEIA.................................................................................................................... 134
8.9.2. Technologie “Pegasus” ........................................................................................ 135
8.10. Fluorescenční techniky na imunochemických analyzátorech - homogenní
imunoanalýza ..................................................................................................................... 135
8.10.1. TRACE (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) - Kryptor (Brahms)... 135
8.10.2. FPIA ................................................................................................................... 135
8.11. Diagnostický přínos................................................................................................... 136
9. ELISA - Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay........................................................ 138
9.1. ELISA stanovení ......................................................................................................... 138
9.1.1. Rozdělení ELISA technik podle typu reakce antigen –protilátka........................ 140
9.1.2. Využití ELISA metod........................................................................................... 142
9.1.3. Technická instrumentace...................................................................................... 142
10. DELFIA........................................................................................................................... 145
10.1. Princip metody: ......................................................................................................... 145
10.1.1. Chelátové značení protilátek ............................................................................. 145
10.1.2. Imunochemická reakce....................................................................................... 146
10.1.3. Disociace lanthanidu z komplexu, vznik fluorescenčních chelátů..................... 147
10.1.4. Časově modulované měření fluorescence (time-resolved fluorometry), TRF.. 148
10.1.5. Současné stanovení více analytů:....................................................................... 149
10.2. Praktické provedení metody DELFIA: ..................................................................... 149
10.3. Příklady využití metody DELFIA:............................................................................ 151
10.3.1. Proteiny, hormony.............................................................................................. 151
10.3.2. Novorozenecký screening .................................................................................. 151
10.3.3. Další možné aplikace ......................................................................................... 152
11. Potenciometrie, konduktometrie , polarografie, coulometrie .................................... 153
11.1. Potenciometrie........................................................................................................... 153
11.1.1. Srovnávací (referenční) elektrody...................................................................... 153
11.1.2. Měrné (indikační) elektrody............................................................................... 154
11.2. Konduktometrie......................................................................................................... 156
11.3. Polarografie (voltametrie) ......................................................................................... 157
11.3.1. Klasická polarografie ......................................................................................... 157
11.3.2. Polarografie na tuhých elektrodách.................................................................... 159
11.3.3. Amperometrie..................................................................................................... 159
12. Iontově selektivní elektrody (ISE), biosenzory............................................................ 162
12.1. Stanovení sodného kationu........................................................................................ 164
12.2. Stanovení draselného kationu.................................................................................... 165
12.3. Stanovení chloridového anionu................................................................................. 166
12.4. Stanovení vápenatého kationu (Ionizovaný vápník) ................................................. 166
12.5. Stanovení hořečnatého kationu (Ionizovaný hořčík) ................................................ 167
12.6. Stanovení laktátu....................................................................................................... 167
12.7. Stanovení glukózy..................................................................................................... 168
12.8. Stanovení kreatininu.................................................................................................. 172
12.9. Stanovení močoviny.................................................................................................. 173
13. Analyzátory acidobazické rovnováhy (ABR) a krevních plynů................................. 176
13.1. Stanovení pH............................................................................................................. 177
13.2. Stanovení pO2............................................................................................................ 179
13.2.1. Polarografie (ampérometrie) .............................................................................. 179
13.2.2. Fluorimetrie........................................................................................................ 181
13.3. Stanovení pCO2 ......................................................................................................... 181
13.4. Stanovení saturace hemoglobinu kyslíkem............................................................... 186
14. Průtoková cytometrie (FLOW CYTOMETRY) ........................................................ 188
14.1. Princip průtokové cytometrie.................................................................................... 188
14.1.1. Fluidní systém .................................................................................................... 189
14.1.2. Optický systém................................................................................................... 189
14.1.3. Vyhodnocovací systém ...................................................................................... 190
14.2. Zobrazování dat z flow cytometrické analýzy .......................................................... 191
14.3. Využití flow cytometrie: ........................................................................................... 192
14.3.1. Historie............................................................................................................... 192
14.3.2. Hematologické systémy pro počítání krevních buněk ....................................... 192
14.3.3. Flow cytometrie v močové analýze.................................................................... 194
14.3.4. Buněčná imunologická vyšetření ....................................................................... 196
14.3.5. Multiplexové metody ......................................................................................... 199
15. Osmometrie..................................................................................................................... 201
15.1. Princip ....................................................................................................................... 201
15.1.1. Osmotický tlak ................................................................................................... 201
15.1.2. Osmolární koncentrace....................................................................................... 202
15.2. Měření osmotického tlaku......................................................................................... 202
15.2.1. Kryoskopie ......................................................................................................... 202
15.2.2. Ebulioskopie....................................................................................................... 203
15.2.3. Koloidní osmometr............................................................................................. 203
15.3. Stanovení osmolality v biologickém materiálu......................................................... 204
15.3.1. Osmolalita séra................................................................................................... 204
15.3.2. Osmolální okno (osmolal gap) ........................................................................... 204
15.3.3. Osmolalita moče................................................................................................. 205
15.4. Diagnostický význam stanovení osmolality.............................................................. 205
15.4.1. Osmolalita séra................................................................................................... 205
15.5. Technická řešení výrobců - nejvíce používané kryoskopické osmometry................ 205
16. Molekulárně biologické vyšetřovací techniky.............................................................. 207
16.1. Metody průkazu specifické nukleové kyseliny ......................................................... 207
16.1.1. Hybridizační techniky ........................................................................................ 207
16.2. Metody pro stanovení pořadí nukleotidů .................................................................. 208
16.2.1. Sekvenování ....................................................................................................... 208
16.3. Metody založené na amplifikaci nukleové kyseliny ................................................. 211
16.3.1. PCR (polymerázová řetězová reakce) ................................................................ 211
16.3.2. LCR (ligázová řetězová reakce)......................................................................... 214
16.4. Metody detekce mutací a polymorfizmů................................................................... 215
16.4.1. RFLP + ELFO .................................................................................................... 215
16.4.2. Analýza DNA pomocí Southernova blottingu ................................................... 216
16.4.3. SSCP................................................................................................................... 217
16.4.4. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ........................... 217
8
1. Analytická a perianalytická automatizace a robotizace
Analytická a perianalytická automatizace laboratorních provozů ovlivňuje celý proces
zabývající se zpracováním klinických vzorků (laboratorní a částečně i mimolaboratorní).
V současnosti je využíván vysoký stupeň automatizace a robotizace. Mnohé operace, které se
dříve prováděly ručně, jsou prováděny bez lidského zásahu.
Mimolaboratorní proces zahrnuje přípravu pacienta, odběr biologického materiálu,
transport vzorku a požadavků do laboratoře a cestu výsledku z laboratoře k
ordinujícímu lékaři. Patří sem také označení vzorků, případně elektronické zadání
požadavků. Nejvyšší stupeň automatizace byl dosažen v oblasti transportu vzorků, kdy se
s výhodou využívá potrubní pošta, ale v poslední době také elektrická vozítka na kolejích, či
roboti.
Laboratorní proces tvoří část
• preanalytická - příprava vzorku k analýze: příjem a identifikace biologického vzorku,
kontrola požadavků a správnosti odběru, jejich zadání či převedení do laboratorního
informačního systému, označení vzorků čárovým kódem, centrifugace, odzátkování,
rozpipetování materiálu na díly pro jednotlivé analyzátory a označení těchto alikvótů
štítky s čarovým kódem, roztřídění primárních a sekundárních vzorků, u on-line
připojení přímý vstup do dopravníkového systému analytické části
• analytická - stanovení jednotlivých parametrů obvykle na automatických
analyzátorech a analytická kontrola správnosti výsledku
• postanalytická – archivace primárních případně alikvotních vzorků, elektronický
přenos výsledků do laboratorního informačního systému, validace a interpretace
výsledků a jejich odeslání ošetřujícímu lékaři
1.1. Automatické biochemické analyzátory
Analýzy na automatických analyzátorech tvoří klíčovou část analytického laboratorního
procesu. Do klinické laboratorní praxe tyto analyzátory vstoupily v 60. - 70. letech minulého
století jako pokračování procesu mechanizace laboratorních činností. První analyzátor Technicon
- byl vyroben v roce 1957.
Automatické analyzátory jsou schopny bez zásahu obsluhy provádět jednotlivé kroky analýzy
podle předem naprogramovaného algoritmu. Jedná se o transport analytického vzorku,
pipetování, dávkování reagencií, promíchání, inkubaci, měření změn signálu, výpočet
koncentrace za použití kalibračních standardů, zobrazení a tisk výsledku analýzy a jeho
přenesení v elektronické podobě do laboratorního informačního systému.
První automatické analyzátory se využívaly v klinické biochemii, kde se stále uplatňují
nejvíce ze všech laboratorních oborů. V této kapitole se budeme zabývat automatickými
biochemickými analyzátory, které jsou v literatuře často popisovány jako analyzátory na
klinickou chemii. Jsou na nich zpracovávány vzorky séra, plazmy, moče a mozkomíšního
moku.
Automatické biochemické analyzátory pracují na principu spektrofotometrie a
turbidimetrie (většinou imunoturbidimetrie). Jejich standardní součástí je modul s iontově
selektivními elektrodami (ISE) ke stanovení Na+
, K+
a Cl.
Fotometrických i iontově
selektivních stanovení se v laboratořích běžně provádí několik tisíc denně. Příkladem
9
spektrofotometrického testu je stanovení glukózy, cholesterolu a enzymů (průměrná cena
vyšetření 2-5 Kč/ test); příkladem imunoturbidimetrických testů je stanovení transferinu,
imunoglobinů a specifických bílkovin (cena 15-25 Kč/test).
Někteří výrobci jako součást automatických biochemických analyzátorů zařazují modul s
biosenzory, které umožňují analýzu z plné krve. To vede k výraznému zkrácení běžné doby
stanovení z 10 minut na 1 minutu. Další redukce času při použití této techniky je dosažena
tím, že vzorek není před měřením třeba centrifugovat.
O imunochemickéch analyzátorech, které využívají chemiluminiscenční a fluorescenční
techniky, je pojednáno ve speciálních kapitolách.
Současné automatické biochemické analyzátory patří do generace selektivních „random
access“ analyzátorů, které umožňují u jednoho vzorku volný výběr z desítek metod. Výkon
jednotlivých typů analyzátorů se pohybuje od 100 do několika tisíc analýz za hodinu. Pro
rychlost je důležitý tzv. takt analyzátoru, tj. čas v sekundách, po kterém se pravidelně
pozastavuje reakční kyvetor a umožňuje tak pipetovat další vzorek. Při taktu 4 s je to 15 testů
za minutu a 900 testů za hodinu. Pravidelnou funkcí analyzátorů je možnost přednostního
provedení analýz v tzv. statimovém (akutním) vzorku. Časová odezva na tyto vzorky, kdy na
výsledku závisí léčba pacienta, se počítá v minutách. Popsané úkony jsou jednotlivými
výrobci řešeny standardně nebo unikátně za použití patentovaných postupů. S vědomím
určitého zjednodušení se v dalším textu omezíme na popis příkladu běžného řešení.
1.1.1. Princip analyzátoru
Jako zdroj světelného záření se většinou používá halogenová wolframová žárovka nebo
xenonová výbojka, světelný paprsek spojitého spektra je po průchodu absorpčním prostředím
(kyvetou) rozložen monochromátorem (difrakční reflexní optickou mřížkou) na paprsky s
definovanou vlnovou délkou (monochromatické záření), které dopadají na detektor
diodového pole (diode array). Změny absorbance reakční směsi v kyvetě jsou monitorovány
(zaznamenávány) při každém průchodu kyvety paprskem optického systému – viz obr.1
K transportu světelných signálů z místa, kde je měřena reakční směs, do detekční jednotky se
využívají optická vlákna.
Obr.1 Optická dráha fotometru modulu c501 systému Cobas 6000, Roche
Vysvětlivky:
A Lampa fotometru F Štěrbina (vstupní) K Štěrbina
10
B Vodní plášť G Reakční lázeň L Fotometr
C Filtr k eliminaci infračervené složky H Reakční kyveta s obsahem M Mřížka
D Maska I Štěrbina (výstupní) N Detektor
E Čočky kondenzoru J Zobrazovací čočka
Při vstupu světelného paprsku do fotometru se paprsek odráží od reflexní difrakční mřížky,
která jej rozkládá na jednotlivé vlnové délky, které pak dopadají na příslušná místa pevného
pole 12 fotodiod. Každá fotodioda je trvale nastavena na detekci světla určité vlnové délky. K
odečtu absorbance dochází v okamžiku, kdy otáčející se reakční kyveta prochází před
fotometrem. Při průchodu reakční kyvety světelným paprskem spektrofotometru je změřeno
pro každé stanovení najednou všech 12 vlnových délek.
Většina fotometrických testů využívá při výpočtu výsledků hodnot dvou vlnových délek tzv.
bichromatickou analýzu. Jedna vlnová délka v blízkosti vrcholu absorbance chromogenu,
vytvářeného při reakci, a druhou vlnová délka v oblasti, ve které daný chromogen vykazuje
malou nebo žádnou absorbanci. Použitím rozdílu mezi odečty dvou vlnových délek
(bichromatický systém) může být eliminován vliv interferencí a šumu fotometru, čímž se
zlepšuje citlivost fotometru.
1.1.2. Součásti automatického analyzátoru – hardware a software
Transportní systém dopravuje analytické vzorky ze vstupu analyzátoru do pracovního
prostoru pipetoru a po napipetování na výstup z analyzátoru. Nejčastěji je zajištěn posunem
stojánků se vzorky lineárním nebo otáčivým pohybem. Na vstupu analyzátoru je umístěna
laserová čtečka čárových kódů. Čárový kód jednoznačně identifikuje vzorek pro spojení s
údaji pacienta v laboratorním informačním systému a současně informuje analyzátor o typu
analyzovaného materiálu (sérum, plazma, moč, likvor aj.).
Vzorkový pipetor zajišťuje pipetování vzorku do reakční kyvety. Pipetovací jehla je
vyrobena z inertního materiálu a je opatřena hladinovým senzorem (vodivostní, kapacitní,
radiofrekvenční systém), který při kontaktu jehly s povrchem vzorku zastaví vertikální pohyb
pipetoru a nasátí vzorku se tak uskuteční těsně pod hladinou. Pipetovací objemy se pohybují v
rozsahu 1−20 μl. Aby se zabránilo kontaminaci přenosem (cary over), je pipetovací jehla při
přechodu na další vzorek zevně i vnitřně omyta v mycí stanici. Tam, kde se měří velmi nízké
koncentrace, měřený analyt se vyskytuje v širokém koncentračním rozmezí a existuje
potenciální nebezpečí kontaminace s falešně pozitivním výsledkem, pracují analyzátory s
pipetovacími špičkami na jedno použití. Některé analyzátory jsou vybaveny zdvojenými
(duálními) pipetory ke zvýšení celkového výkonu.
Přesné odměřování objemu vzorku pipetorem a jeho dávkování zajišťují pístové dávkovače,
které jsou s koncovými pipetory spojeny hadičkami. Nasávání vzorku je tak řízeno pohybem
teflonových pístů.
V současné generaci analyzátorů již ke standardní funkci pipetoru patří detekce sraženiny a
pěny na principu sledování hodnoty podtlaku nutného k nasátí vzorku.
Dávkovače reagencií pracují na stejném principu včetně odměřování objemu, hladinových
senzorů a mycí stanice k zabránění vzájemné kontaminace reagencií. Dávkované objemy jsou
programovatelné v rozsahu odpovídajícím objemu reakční kyvety, např. 20–300 μl.
Reakční kyvety se liší podle použitého materiálu, tvaru, objemu a způsobu použití buď jako
jednorázové, které se po použití odstraní do odpadu, nebo opakovaně používané po
automatickém vymytí a vysušení. Základním požadavkem je propustnost materiálu kyvet pro
11
UV záření, což splňují plastové materiály a křemenné sklo. Postupná miniaturizace vedla ke
kyvetám o objemu 100 μl a menším.
V analyzátorech pro klinickou chemii je v reakčním kruhu umístěno několik stovek kyvet.
Kyvety se otáčejí a absorbance se měří vždy v kyvetě, kterou prochází světelné zážení ze
zdroje.
Součásti optické dráhy fotometru: Zdroj světelného záření, monochromátor, absorpční
prostředí a detektor.
Inkubační lázeň je prostředí, ve kterém jsou umístěny reakční kyvety. Inkubační teplota,
důležitá především pro stanovení katalytické koncentrace enzymů, je udržována na 37 °C s
přesností ± 0,1°C. Homogenní teplotní prostředí zajišťuje v inkubační lázni cirkulující voda,
olej nebo vzduch.
Míchání zajišťuje promíchání reakční směsi v kyvetě s využitím ultrazvuku, vibrací,
probubláním vzduchem nebo u rotačním pohybem lopatky míchadla ponořeného krátce do
reakční kyvety (piezoelektrické míchání).
Mycí stanice odsává po skončení měření reakční směs z jednotlivých kyvet. Potom kyvety
opakovaně propláchne vodou, alkalickým detergentem či po určitých metodách zředěnou
kyselinou a vysušením je připraví k dalšímu použití.
Reagencie. Automatické biochemické analyzátory standardně umožňují použití dvou
reagencií na jednu metodu, možné jsou i 3-4 reagencie. V současné době je někteří výrobci
dodávají ve formě kazet, které obsahují všechny potřebné reagencie v tekuté podobě
připravené přímo k měření (ready to use). V analyzátoru jsou uloženy v chlazených
prostorách pro zvýšení jejich stability a snížení odparu. Kazety s reagenciemi jsou označeny
čárovým kódem, který analyzátor registruje a nezáleží tak na poloze jejich uložení v
reagenčním prostoru. Před dávkováním reagencie do kyvety se příslušná nádobka otáčením
kruhu s reagenciemi automaticky nastaví do pipetovací polohy příslušného dávkovače.
Definice parametrů metod. Každá stanovovaná metoda má definované parametry - způsob
měření (end point, kineticky), vlnové délky, objem pipetovaného vzorku a dávkovaných
reagencií, optimální body reakčního průběhu používané pro výpočet koncentrace, měření
vzestupu nebo poklesu absorbance, mezní hodnoty pro opakování analýzy s větším nebo
menším objemem vzorku při příliš vysoké nebo naopak příliš nízké koncentraci.
Zobrazení a přenos výsledků. Výsledky analýz jsou průběžně znázorňovány na obrazovce
analyzátoru, softwarově ukládány, přenášeny do laboratorního informačního systému, dále v
elektronické formě do nemocničního informačního systému do dokumentace pacienta.
Průběh reakce. Změny absorbance reakční směsi v kyvetě jsou průběžně monitorovány a
graficky zaznamenány. Grafický záznam se provádí po celou dobu reakce (inkubace trvá
většinou deset minut a během ní je změřena absorbance až 70x) a je důležitý zvláště u
stanovení katalytické koncentrace enzymů, kdy umožňuje odhalit vyčerpání substrátu při
vysoké aktivitě enzymu a nelinearitu reakce – viz. obr.3.
Chybová hlášení, autodiagnostika. Všechny činnosti a funkce analyzátoru jsou
naprogramované v softwaru řídícího počítače. Pohyb pohyblivých součástí analyzátoru
zajišťují většinou přesné krokové motory. Správná funkce pohyblivých součástí je trvale
12
monitorována pomocí speciálních čidel, které kontrolují koncovou polohu i čas potřebný k
jejímu dosažení. Při nedodržení nastavených poloh a časových limitů se analyzátor zastaví s
příslušným chybovým hlášením. Voda je v analyzátoru poháněna pomocí čerpadel a odsávána
vakuem, které je řízeno magnetickými ventily.
Současné elektronicky řízené automatické biochemické analyzátory mají často značně
sofistikovaný software. Běžné je statistické vyhodnocování kontrolních analýz v číselné i
přehledné grafické podobě a nástroje vnitřní kontroly kvality umožňující výběr a kombinací
Westgardových pravidel. Jinou softwarovou aplikací je např. tzv. reflex mode, který
umožňuje automatické provedení doplňkových analýz až na základě získaných výsledků.
Software k vyhodnocení interní kontroly kvality: Správnost prováděných analýz je
kontrolována v pravidelných intervalech pomocí kontrolních vzorků s deklarovanou hodnotou
stanovovaných analytů. Používají se kontroly na dvou hladinách; jedna hladina je v oblasti
referenčních hodnot, druhá v patologické oblasti. Za vyhovující jsou považovány výsledky
kontrolních analýz v rozmezí ± 2 SD. Výsledky kontrol se kromě číselné hodnoty zobrazují
také ve formě Levey-Jenningsova grafu – viz. obr. 4. Většina analyzátorů má ve svých
řídících programech zabudovaná také Westgardova pravidla ke snadnějšímu posouzení, zda
na základě interní kontroly kvality mohou být výsledky uvolněny nebo musí být série
odmítnuta.
Funkce měření sérových indexů: Sérové indexy určují stupeň potenciální interference
způsobené bilirubinem, hemoglobinem nebo lipémií. Test je založen na měření naředěných
vzorků při různých vlnových délkách a v současné době, zejména pro kompletně
automatizované laboratoře je nezbytností.
Ukázka základních části analyzátoru je na obr.2.
13
Obr.2 Horní plocha analyzátoru Hitachi 917, firma Roche
Vysvětlivky:
1. transportní systém dopravující vzorky ve stojáncích k sérovému pipetoru
2. rotor v chlazeném prostoru pro kalibrátory, kontroly a statimové vzorky
3. rotor s reakčními kyvetami uložený ve vodní lázni temperované na 37 °C
4. reagencie (R1, R2) v nádobkách značených čárovým kódem; chlazený prostor je za
provozu uzavřen víkem (v současnosti je běžnější umístění reagencie 1 a 2 v jedné
kazetě)
5. sérový pipetor
6. reagenční pipetor – dávkovač
7. rotační míchadlo
8. mycí stanice reakčních kyvet
14
Obr.3 Grafické znázornění průběhu reakce včetně bodů použitých pro
výpočet koncentrace (vertikální vyznačení)
1.1.3. Přínos zavedení automatických analyzátorů
 zvládnoutí enormního nárůstu požadavků kliniků
 zkrácení časové odezvy (TAT) - statim desítky minut, vysoce speciální metody hodiny
 zajištění vyhovující přesnosti a správnosti analýz
 snížení spotřeby reagencií - zavedení mikrometod snižuje náklady a je šetrnější k
životnímu prostředí
Obr.4 Levey-Jennings graf
Slouží k přehlednému sledování výsledků kontrolních analýz.
Zobrazuje graficky hodnoty kontrol na dvou hladinách s
deklarovanou (správnou) hodnotou ve středu.
15
 snížení potřeby biologického materiálu
 zvýšení hygienického standardu
 elektronické zpracování získaných dat
1.1.4. Integrované a modulární systémy
Charakteristickým znakem vývoje automatizovaných analytických přístrojů v posledních
letech byla konstrukce integrovaných systémů spojujících analyzátory pracující na různém
principu. Jedná se o pracovní stanice či modulární systémy spojující klinickou chemii a
imunochemii. Z jedné zkumavky tak může být provedeno v jednom přístroji velké množství
různých typů testů a výsledky jsou soustředěny v jednom řídícím počítači. V případě
modulárních systémů mohou být při nárůstu požadavků jednotlivé moduly přidávány bez
nároků na výměnu celého systému.
Jeden systém tak využívá i několik různých analytických principů – fotometrii,
turbidimetrii, luminescenci, ISE (v ojedinělém případě i nefelometrii).
Prvním přístrojem tohoto typu byl Dimension RxL vyrobený firmou Dade Behring v roce
1997. Širší uplatnění pro spojení modulů na klinickou chemii a modulů na imunochemii však
našly tyto systémy až od roku 2004 – Modular Analytics, Roche.
Pod pojmem integrované systémy rozumíme i spojení analytické a preanalytické techniky.
Tato problematika je diskutována v další části této kapitoly.
1.1.5. Praktické aplikace
Významní výrobci automatických analyzátorů nabízejí přístroje s nízkým, středním a
vysokým výkonem, což umožňuje zákazníkovi výběr dle kapacity laboratoře.
a) Příklady biochemických analyzátorů pro střední a velké laboratoře
Analyzátory řady Beckman Coulter UniCel DxC, Danaher - kromě fotometrie a ISE jsou
vybaveny biosenzory k analýze glukózy, kreatininu, vápníku, celkové bílkoviny a CO2
ADVIA 2400, Siemens - 2400 testů/hod., předředění vzorků 1:5
Olympus AU5400, Daneher - nový vysokokapacitní biochemický systém:
 výkon až 4 800 fotometrických testů/hod., jednotka ISE až 1 800 testů/hod.
 pracuje jako konsolidovaná pracovní stanice s kapacitou stanovení až 99 různých
analytů
 široké spektrum testů včetně léků, drog a hormonů
 křemenné kyvety
16
Obr.5 Beckman Coulter UniCel DxC 600, firma Danaher
Charakteristiky: data manager Remisol 2000
nevyžaduje denní údržbu, nemění se lampy
detekce a odstranění sraženiny
65 metod na palubě s výkonem 990 testů za hodinu
b) Příklady biochemických analyzátorů pro malé laboratoře
Alcyon, Abbott - stolní analyzátor, 300 fotometrických a 450 ISE testů/ hod.
BS-300, MINDRAY - dodává firma Medusa; 300 fotometrických testů/hod.,180 ISE
testů/hod.; 50 pozic na reagencie; na ISE modulu lze stanovit i Li+
c) Příklady integrovaných a modulárních analytických systémů
Cobas 8000, Roche
 kombinace chemických a imunochemických testů
 flexibilní pohyb vzorků mezi moduly
 software detailně plní akreditační požadavky
 kazetové reagencie
 až 70 kazet na palubě fotometrického modulu
Systém Architect, Abbott
Umožňuje integraci modulu pro klinickou chemii Architect c 16000 s imunoanalytickým
modulem Architect i2000 SR.
Architect c 16000 - systém s výkonem až 1800 klinických testů/hod.
 otevřený pro reagencie jiných firem
 unikátní technologie mytí vzorkové jehly – deklarován přenos vzorku do 0,1 ppm
 rozšířená linearita FlexRate pro fotometrii - vlnové délky (od 340 do 804 nm)
 kyvety z křemenného skla
 integrovaný ISE Chip modul pro Na+
, K+
, Cl
smart Wash - technologie pro 8krokové mytí kyvet a dávkovacích jehel
 65 reagencií na palubě
Dimension Vista 1500 - Inteligentní Lab Systém, Siemens
17
Integrovaný systém, který kombinuje princip spektrofotometrie, turbidimetrie,
nefelometrie, integrované multisenzorové technologie a LOCI (moderní homogenní
chemiluminiscence). Poskytuje možnost provádět prakticky všechny testy v jednom
sytému. Výkon je1500 testů/hod., při spojení dvou systému 3000 testů/hod.
Obr.6 Cobas 8000, Roche
Obr.7 Cobas 8000, Roche
Detail modulu c 701 na klinickou chemii:
zdvojené vzorkové a reagenční pipetory
zajišťují vysoký výkon 2000 testů/hod
c) Příklad analyzátorů pracujícího se suchou chemií
Analyzátory řady Vitros, Ortho
Pracují bez kapalných reagencií. Reakční zónu tvoří tzv. „slide“, na kterém je
zabudována suchá reagenční multivrstva na podložce z polystyrenu.
1.1.6. Znaky moderních analyzátorů
 detekce sraženiny
 výměna reagencií bez zastavení přístroje
 integrovaná chemie a imunochemie
 efektivní distribuce vzorků – rychle získané výsledky, krátký TAT
c701 c701 e601
18
 malý objem kyvety, malý mrtvý objem - u pacientů v kritickém stavu nebo u
novorozenců je biologickým materiálem třeba šetřit
 kazetové reagencie bez přípravy
 minimální doba údržby
 široká nabídka vyšetření
 instalace metod s využitím webu
 možnost nainstalovat metodu jiného výrobce
 měření sérových indexů
1.1.7. Moderní laboratorní provozy
Automatizace a později integrace analyzátorů umožnila vznik centralizovaných laboratoří a
vytvořila vhodné podmínky pro konsolidaci pracovišť.
Zajistila zvýšenou efektivitu práce, redukovala variabilitu výsledků, zvýšila
reprodukovatelnost a omezila počet chyb.
Konsolidace
Konsolidace laboratoří ve zdravotnictví představuje proces spojování laboratoří pracujících
v různých oborech do jednoho celku. Takto lze často spojit oddělení biochemie, hematologie
a mikrobiologie-serologie.
Centralizace
Centralizace zajišťuje spojování pracovišť stejného oboru a dochází při ní k vytvoření většího
laboratorního celku s možností efektivně provádět široké spektrum laboratorních vyšetření.
Systém využívá svozu biologických vzorků z větší oblasti.
1.1.8. Klinický význam
Klinický význam parametrů stanovovaných na biochemických analyzátorech je obrovský.
Přesto, že náklady klinických laboratoří ve zdravotnictví představují pouze 7 %, hrají
laboratoře zásadní roli (až v 70%) při rozhodování kliniků. Biochemické analyzátory přitom
mají klíčovou úlohu.
Uvádíme několik příkladů patologických výsledků ve vazbě na diagnózu:
 zvýšený bilirubin a enzymy ALT, AST při jaterních chorobách
 snížená bílkovina u popálenin, zvýšená bílkovina u mnohočetného myelomu
 zvýšené enzymy amyláza a lipáza u pankreatitidy
 zvýšená urea a kreatinin při zhoršené funkci ledvin
 zvýšený C-reaktivní protein při bakteriálních zánětech
 snížené železo, feritin a zvýšený transferin u anémie z nedostatku železa
19
1.2. Perianalytická automatizace a robotizace
Preanalytické zpracování biologických vzorků v laboratoři je nezbytnou a důležitou částí
laboratorní práce. Představuje celou řadu manuálních, často stereotypních činností, k jejichž
provedení není třeba speciálních znalostí a dovedností, ale jsou náročné na pozornost,
vyžadují zachování standardního postupu a je při nich důležité zabránit možnosti vzniku chyb.
Nejzávažnější a také nejobávanější chybou je záměna vzorků nebo chyba v identifikaci, které
mohou v konečném důsledku ohrozit pacienta. Jednotlivé pracovní kroky se ve velkých
klinických laboratořích opakují ve stonásobcích.
Uvedená charakteristika preanalytické laboratorní fáze ukazuje, že celý preanalytický
laboratorní proces je předurčen k automatizaci a robotizaci. Zařízení, která preanalytickou
automatizaci zajišťují, jsou současně využívána k automatizaci a robotizaci fáze
postanalytické. Nahrazují tak manipulaci s biologickými vzorky předcházející analýze a
jejich uložení po analýze.
Pojmy preanalytický a postanalytický souhrnně zahrnuje termín perianalytický.
Cílem perianalytické automatizace je odstranění stereotypní nekvalifikované práce, zabránění
možnosti vzniku chyb, zrychlení provozu a zvýšení kapacity při zachování precizního
provedení všech potřebných operací.
První perianalytické systémy byly realizovány již v 80. létech v Japonsku. V klinických
laboratořích se však rozšířily až v posledních létech. Celková laboratorní automatizace se
tak stala reálnou a relativně dostupnou.
1.2.1. Funkce perianalytických systémů
a) preanalytická část - načtení jednoznačně identifikovaného materiálu, předtřídění vzorků,
centrifugace, odzátkovaní zkumavek, rozpipetování vzorku na potřebné díly (alikvotace),
označení alikvótů vygenerovaným čárovým kódem, zátkování vybraných alikvótů či
primárních vzorků a roztřídění materiálu pro jednotlivé přístroje, které nejsou
s perianalytickým systémem spojené on-line
b) postanalytická část – archivace a skladování vzorků včetně jejich likvidace
v naprogramovanou dobu, vytřídění a návrat vzorků k provedení doordinovaných vyšetření
Po příchodu do laboratoře tak může být vzorek vložen do automatického systému a bez
dalšího dotyku lidské ruky analyzován a uložen. Popsána je dokonce možnost vzorek při
odběru na klinice označit čárovým kódem a poté vložit na dopravníkový pás, který vede do
laboratoře a je přímo spojen s preanalytickou částí automatického systému.
Podmínkou pro takové zpracování vzorků je využití odběrových zkumavek se separačním
gelem, který po centrifugaci oddělí krevní elementy od séra či plazmy a zabrání průniku
látek, které se nacházejí v krevních elementech ve vyšší koncentraci (např. K+
). Odstraňuje
tak nutnost sérum nebo plazmu po centrifugaci přenést do jiné zkumavky.
1.2.2. Základní části robotizovaných perianalytických systémů
 Vstup – místo pro vkládání primárních zkumavek s biologickým materiálem.
20
 Dopravníkový systém, který zajišťuje transport zkumavek mezi jednotlivými
funkčními jednotkami.
 Laserová čtečka k identifikaci vzorku načtením čárového kódu.
 Robotizovaná centrifuga.
 Zařízení, které provede odzátkování odběrové nádobky.
 Zásobník zkumavek pro aliquoty.
 Tisk a nalepení štítků s čárovým kódem.
 Alikvotační modul a pipetorem, který je vybaven detekcí sraženiny, měřením výšky
hladiny a někdy i měřením kvality séra (hemolýza, lipémie, ikterus).
 Robotizované rameno zajišťující roztřídění primárních zkumavek a aliquotů do
stojánků pro cílové analyzátory.
 Chlazený sklad pro uložení vzorků.
1.2.3. Jednotlivé kroky robotizovaného preanalytického procesu:
Primární zkumavky s plnou krví jsou na vstupu vloženy do transportního systému.
Laserová čtečka identifikuje jejich čárový kód.
Zkumavky jsou vloženy do centrifugy.
Po skončení centrifugace jsou zkumavky vráceny zpět do transportního systému.
Následuje optické ověření kvality séra nebo plazmy a posunutí zkumavky do místa, kde
dojde k odzátkování.
Je-li třeba požadovaná vyšetření provádět na více přístrojích, provede pipetor rozpipetování
vzorku z primární zkumavky do alikvotačních zkumavek a označí je totožným čárovým
kódem, jaký má původní zkumavka.
Systém aliquoty roztřídí do stojánků pro cílové analyzátory.
Primární zkumavky jsou uloženy pro archivaci.
1.2.4. Typy perianalytické automatizace
Perianalytickou automatizaci lze rozdělit na celkovou a diskrétní:
Automatizace celková představuje integrované nebo modulární automatické perianalytické
systémy, které jsou přímo napojeny na analyzátory. Výrobci nabízejí připojení k
analyzátorům pro klinickou chemii i imunochemii a někdy také interface pro hematologické,
koagulační a močové analyzátory. Jedná se o tzv. „on-line“ systémy.
Dělí se na dva typy:
a) kruhové uspořádání – na vodící dráhu jsou připojena perianalytická zařízení i
jednotlivé analyzátory – viz obr.8.
b) moduly uspořádané stavebnicově za sebou – na zařízení sloužící
k preanalytickým a postanalytickým funkcím přímo navazují jedna nebo více větví
analytických konsolidovaných jednotek –viz obr.9.
Automatizace diskrétní tvoří alternativu pro laboratoře střední velikosti. Jedná se o
samostatně stojící pracovní stanice. V jednom přístroji jsou spojené funkce jako kontrola
integrity vzorku, roztřídění, centrifugace, alikvotace a oštítkování alikvotů. Připravené
alikvóty a vzorky pak personál roznáší k analýze do jednotlivých samostatně stojících
přístrojů. Výhodou je, že laboratoř může neomezeně využívat přístroje od různých výrobců
– viz obr.10.
21
1.2.5. Příklady automatických perianalytických systémů na trhu
Většina světových firem, které vyrábí a nabízí automatizované analytické systémy, vyvinula i
automatizované a robotizované preanalytické linky. Hlavní dodavatelé preanalytických
technologií jsou firmy Siemens, Roche, Danaher, Ortho, Thermo Electron Corporation a
Abbott.
Příkladem systémů s kruhovým uspořádáním je:
ADVIA LabCell, Siemens
Beckman Coulter Power Processor, Danaher
ACCELERATOR, Abbott
Obr.8 Systém ADVIA LabCell, spojený s dvěma automatickými analyzátory
Advia 1600 a imunochemickým analyzátorem Advia Centaur, firma Siemens
Příkladem modulárního systému je:
Modular Preanalytics, Roche
TCAutomation, Thermo Electron Corporation (Ortho)
Diagnostics
ACU-1 ACU-2 DSP AQN BCL RSP FSS
vstup výstup
22
Obr.9 Modular Preanalytics, firma Roche
Představuje modulární linku, která se přímo spojuje s analytickým systémem Cobas 6000 nebo Cobas 8000.
Nabízí různé varianty v počtu modulů i v prostorovém uspořádání.
Vysvětlivky: ACU-1,2 robotizované centrifugy
DSP decaper (odzátkování)
AQN aliquoter (rozpipetování)
BCL bar code laber (označení alikvotů čárovým kódem)
RSP recaper (zazátkování alikvótů k uložení)
FSS flexible sample sorter (roztřídění alikvótů)
Příkladem diskrétní automatizace jsou systémy:
OLA 2000, Danaher
Genesis FE 500, Abbott
RSA Pro, Roche
Obr.10 Samostatně stojící systém OLA 2000,
firma Danaher
1.2.6. Robotický chlazený sklad
Součástí perianalytické automatizace je robotický sklad. Jedná se o zařízení, které se dostalo
na trh jako poslední. Slouží ke skladování analyzovaných vzorků, které se v laboratoři
uchovávají několik dnů a po uplynutí skladovací doby je likviduje (př. modul p501systému
Modular Preanalytics, Roche – viz obr.11). Automaticky posílá vzorky zpět do analyzátorů k
analýze doordinovaných testů (např. sklad systému Power Processor, Danaher).
23
Obr.11 Skladový modul p501 ze systému Modular Preanalytics, Roche
Funkce: ukládá 400 zkumavek/hod.
automaticky zátkuje a odzátkovává
likviduje vzorky po uplynutí expirace
kapacita 13500 zkumavek
1.2.7. Postup při automatizaci perianalytické a analytické fáze
Po rozhodnutí, že laboratoř bude automatizována, probíhá přípravná fáze celého procesu. Je
nutno podrobně specifikovat požadavky, provést podrobnou časovou a množstevní analýzu
laboratorních procesů (workflow analýza), detailně se seznámit s perianalytickými systémy
na trhu a instalaci technicky i finančně připravit.
Cílem je zajištění vyváženého systému, kde průchodnost jednotlivých perianalytických i
analytických částí odpovídá denním maximům včetně rezervy pro budoucí rozvoj laboratoře.
Pokud to situace vyžaduje, po instalaci se provede změna toku vzorků a následná
optimalizace provozu. Nikdy by se neměl automatizovat špatný proces.
1.2.8. Význam a výhody perianalytické automatizace
Perianalytické systémy zvyšují produktivitu práce, zlepšují plynulost zpracování a rychlost
vydávání výsledků, snižují počet chyb, omezují práci s infekčním materiálem a nahrazují
nezáživnou stereotypní práci. V současnosti jich ve světě v klinických laboratořích pracuje
několik tisíc a instalace každým rokem rychle přibývají.
1.3. LIS a informační technologie v klinických laboratořích
Automatizace laboratorních procesů je pevně spojena s informačními technologiemi. Způsob
jakým se pohybují zdravotnická data – požadavky kliniků a naměřené výsledky - je pro
laboratorní provoz zcela klíčový. Pro moderní klinickou laboratoř je charakteristická poměrně
komplikovaná počítačová síť s řadou uživatelských stanic spojující několik klíčových
softwarů.
Základní cesta toku dat je následující: Požadavky od kliniků přicházejí ve formě elektronické
žádanky z nemocničního informačního systému (NIS) do laboratoře do laboratorního
24
informačního systému (LIS). K LIS jsou připojeny jednotlivé analyzátory. Po ukončení
analýzy vzorků se výsledky automaticky přenášejí z analyzátorů do LIS a po validaci do
nemocničního informačního systému k lékaři, který vyšetření původně ordinoval. Takový
přenos dat již není omezen na jedno pracoviště, ale může spojovat zařízení v různých
lokalitách. Jedná se o oboustrannou komunikaci.
1.3.1. Elektronická žádanka, požadavek zaslaný v elektronické podobě
Identifikační údaje pacienta i požadavky na vyšetření jsou zadány do informačního systému
na klinických pracovištích. Poté se zde vygenerují jednoznačné čárové kódy a nádobky
s odebraným biologickým materiálem se jimi označí.
Při příjmu materiálu v laboratoři se načte čárový kód na zkumavce laserovou čtečkou.
Identifikační údaje i požadavky na biochemická vyšetření se tak automaticky přenesou do
LIS.
1.3.2. LIS
Základní software laboratoře tvoří laboratorní informační systém. Zajišťuje komplexní
zpracování dat v laboratoři od příjmu požadavku na vyšetření, přes jeho zpracování ve všech
fázích laboratorní práce, technickou a lékařskou validaci výsledků, jejich vydání objednateli a
vyúčtování provedených výkonů.
V LIS se sdružují výsledky z jednotlivých přístrojů v laboratoři a mohou tak být posuzovány
v širších souvislostech. Tyto základní činnosti laboratorního informačního systému mohou být
pak doplněny škálou různých tiskových sestav, statistik a přehledů a nadstavbovými
programy pro další zpracování uložených dat. Veškeré údaje přicházející do systému z
nejrůznějších zdrojů, ať už ručně zadané nebo přijaté elektronickou cestou od jiných
počítačových systémů či laboratorních analyzátorů, zůstávají trvale uloženy v systému a lze s
nimi kdykoliv zpětně pracovat.
V ČR nabízí LIS asi patnáct firem. K největším patří firma STAPRO se systémem
OpenLIMS, MP Program s produktem Infolab a firma LIRS se stejnojmenným LIS.
Významné charakteristiky moderních laboratorních informačních systémů
 kompletnost ( pro všechny typy klinických laboratoří)
 vhodnost pro řetězce laboratoří, podpora detašovaných pracovišť
 přizpůsobitelnost provozním podmínkám např. automatizaci
 dokonalé sledování nákladů
 údržba a upgrade prostřednictvím internetu
 podpora akreditace
 databázová nezávislost
 části nastavitelné uživatelem
 grafická prezentace výsledků
 prohlížení výsledků přes web na základě nastavených práv
 možnost generování elektronické žádanky
25
Trendy LIS
 snaha otevřít informační systémy do okolí, podpořit komunikaci s lékaři
 kvalitní statistika a mezioborové využívání dat (např. získání souvislosti laboratorních
údajů s právě aplikovaným léčivem a demografickými údaji)
 automatické účtování pro pojišťovny
 schopnost přijímat data z programů zajišťujících napojení POCT přístrojů (systém
umožní denní kontrolu glukometrů, ABR analyzátorů a koagulometrů, možnost
jednotné archivace výsledků, vyúčtování testů v pojišťovně)
Moderní systémy využívají web klient (na PC je pouze web rozhraní). Tyto systémy mají
mnohovrstevnou strukturu, jsou mnohem flexibilnější, lze u nich postupně měnit jednotlivé
vrstvy a snadněji s nimi mohou pracovat také jiní programátoři než autor.
1.3.3. Data manager, middleware
V automatizovaných laboratořích přímé spojení LIS se softwarem analyzátoru již v dnešní
době mnohdy nestačí. Mezi analytickým systémem, LIS a softwarem perianalytického
systému bývá ještě začleněn middleware (MW) zajišťující vzájemnou oboustrannou
komunikaci, umožňuje kontrolu a řízení pohybu vzorku po laboratoři včetně jeho archivace,
kontrolu kvality, případně validaci výsledků. Dalším softwarem, který může být zařazen mezi
jednotlivé laboratorní přístroje a LIS je data manager (DM), který umožňuje řídit více
přístrojů z jedné stanice a představuje tzv. centrální kontrolní modul. V některých případech
plní funkce, které LIS neumožňuje (např. definace různých pravidel a podmínek).
Datová cesta od požadavku lékaře po obdržení výsledku lékařem vypadá v komunikační síti
následovně:
NIS – LIS – MW – Analyzátor – DM – MW – LIS - NIS
1.3.4. Datové standardy
Přenášení dat mezi jednotlivými informačními systémy umožňují tzv. datové standardy. Jedná
se o několikamístné číselné kódy, z nichž každý odpovídá určitému analytu. Standardy byly
akceptovány naprostou většinou odborných společností. Ve světovém měřítku však jednotný
systém neexistuje.
Pro komunikaci mezi informačními systémy užívanými ve zdravotnictví v ČR byla vytvořena
první verze takového datového standardu v r. 1997 (ing. Zámečník). Jedná se o Národní
číselník laboratorních položek (NČLP).
NČLP zajišťuje:
 předávání informací o pacientech mezi zdravotnickými informačními systémy
 objednávání požadavků směrem do LIS, sdělování výsledků z LIS
1.4. Automatizace vyšetření moče
Močové analyzátory využívají podobné prvky automatizace jako dříve popsané analyzátory
na klinickou chemii – pipetory, transportní mechanismy, míchání pomocí vzduchové bubliny.
1.4.1. Chemická analýza moče
Automatizace v oblasti chemické analýzy moče probíhala od 80. let minulého století.
26
V současnosti jsou na trhu plně automatizované přístroje s integrovanou čtečkou čárového
kódu k identifikaci vzorků. Na přístrojích se semikvantitativně stanovuje bilirubin,
urobilinogen, bílkoviny, ketony, hemoglobin, leukocyty, dusitany, pH, glukosa a specifická
hmotnost. Analýza využívá diagnostické proužky (suchá chemie). Celá procedura je
standardizovaná, takže se vyhodnocení provádí až po uplynutí inkubační doby. Na přístrojích
současné generace se diagnostické proužky do moče nenamáčejí, ale moč je napipetována na
jednotlivé reakční zóny. Přístroj pracuje na principu reflektanční fotometrie.
Reflektanční fotometrie
Princip stanovení: Zdrojem světla jsou světlo emitující diody, které emitují záření o různých
přesně definovaných vlnových délkách. Světlo dopadá v různých úhlech na reagenční zóny
diagnostického proužku a je odráženo na fotodiodu , která slouží jako detektor. Intenzita
odraženého světla závisí na vybarvení reakční zóny (od bílé zóny se odráží prakticky 100%,
čím tmavší zóna, tím víc světla je absorbováno).
Praktické aplikace:
a) vysokokapacitní analyzátory
Urisys 2400, firma Roche (kazety se 400 diagnostickými proužky, minimální objem vzorku
1.5ml)
iChem VELOCITY, firma IRIS (může pracovat samostatně, ale výhodně je využíván ve
spojení s přístroji řady IQ200 na automatickou mikroskopii)
UriSed, dodává firma DOT (využívá se v přímém propojení s přístrojem LabUMat)
b) přístroje pro malé laboratoře
Miditron Junior a Urisys 1800, firma Roche
Aution Mini, firma Arkray
1.4.2. Automatizace morfologického vyšetření moče
Automatizace v oblasti morfologického vyšetření moče se na trhu objevila později, až kolem
roku 1995. Z tohoto období pochází přístroj UF 100 firmy Sysmex pracující na principu
průtokové cytometrie. V současné době tuto metodiku zastupuje přístroj UF 1000, který je
popsán v kapitole Flow cytometrie.
V roce 2004 vyvinula firma Iris první přístroj pracující na principu automatizované
mikroskopie, který získal dominantní postavení na trhu. Dřívější aplikace této i jiných
společností měly jen omezené uplatnění. Jednalo se o přístroj IQ 200.
Automatizovaná mikroskopie
Princip analýzy: Po nasátí vzorku je v mikroskopu přístroje automaticky vytvořena tenká
vrstvička moče sendvičovitě uzavřená mezi vrstvy suspendované tekutiny. Mikroskop je
spojen s digitální kamerou, která s využitím stroboskopu zachytí 500 obrázků z jednoho
vzorku. Výsledný záznam je digitalizován, jednotlivé obrazy částic jsou izolovány do
rámečků – každá částice zvlášť. Přístroj rozlišuje 12 základních kategorií částic. Software
umožňuje jejich prohlížení, případně přeřazení do jiné kategorie nebo podkategorie vytvořené
zákazníkem.
Praktické aplikace:
Analyzátory řady IQ 200 – např. IQ 200 SPRINT (100 vzorků/hod.)
IQ 200 ELITE (70 vzorků/hod.).
27
Charakteristiky přístrojů:
• stanovení počtu erytrocytů, leukocytů, epitelií, válců na 1 ul moče
• identifikace a kvantifikace krystalů, bakterií a hlenu
• možnost prohlížení částic na obrazovce a přeřazování je do jiné kategorie
• archivace nálezů
• možnost provádět mikroskopické vyšetření pouze u pozitivních vzorků dle nastavených
kritérií (výběr se provádí na základě výsledků chemické analýzy)
Přístroje řady IQ 200 lze zakoupit propojené s analyzátorem na chemickou analýzu moče
iChem VELOCITY. Komplet od firmy IRIS se dodává jako iRICELL Workcell. Toto
spojení umožňuje kompletní automatizaci močové analýzy – viz obr.12. Je v současnosti na
trhu nejrozšířenější.
Obr.12 iRICELL Workcell, firma IRIS
Automatizace močového sedimentu
Princip analýzy: Metodika využívá automatickou mikroskopii, ale příprava vzorku kopíruje
klasický způsob provedení močového sedimentu v miniaturním měřítku (součást přístroje je
centrifuga a postup využívá desetinásobné zakoncentrování vzorku).
Praktická aplikace:
Přístroj LabUMat and UriSed, dodává firma DOT
Charakteristika přístroje:
• není potřeba žádných drahých reagentů, pro provoz stačí pouze destilovaná voda k
promývání pipety
• každý vzorek je prohlížen v jednorázové kyvetě
• výsledkem jsou jasné, ostré obrázky jednotlivých částic močového sedimentu
• lze prohlížet obrázek jednotlivé částice nebo celého zorného pole
• všechny obrázky jsou pak uloženy v databázi, odtud mohou být kdykoli vyvolány
1.4.3. Klinický význam močové analýzy
Zvýšení parametrů močové analýzy způsobují četné chorobné stavy. Jedná se zejména o
záněty ledvin a močových cest, kdy se projevují patologicky zvýšené hodnoty bílkoviny,
erytrocytů, leukocytů, epitelií a válců. U pacientů s diabetem melitus nacházíme zvýšenou
glukózu a ketony. Různé patologie se mohou objevit také u fyziologických stavů např.
v těhotenství nebo po velké fyzické námaze.
28
Literatura:
Beňovská M.: Automatizace a robotizace perianalytických procesů v klinické laboratoři –
projekt pro velkou biochemickou laboratoř, disertační práce 2009.
1. Bishop M.L., Fody E.P., Schoeff L.E.: Clinical Chemistry Techniques, Principles,
Correlation. 2010, ISBN 978-0-7817-9045-1.
2. Burtis C:A:, ASHWOOD E:R:, Bruns D.E.: Tietz Fundamentals of Clinical
Chemistry. 2008, ISBN 978-0-7216-3865-2.
3. Compendium of Background Information firmy Roche. 2011.
4. Dastych M.: Instrumentální technika. 2007, ISBN 978-80-210-4226-1.
5. Dastych M., Breinek P. a kol.: Klinická biochemie. 2008, ISBN 978-80-210-4572-9.
6. www.abbott.com – převzato 16.2.2011.
7. www.beckmancoulter.eu – převzato 3.5.2011.
8. www.roche-diagnostic.cz – převzato 9.7.2011.
9. www.wikiskripta.eu – převzato 6.4.2011.
29
2. POCT – testování v místě ošetření pacienta
V současné době se vedle biochemických analyzátorů využívaných v provozu klinických
biochemických laboratoří používají mimo laboratoře také malé přenosné a stolní analyzátory.
Jedná se o tzv. Point of care testing (POCT), který zajišťuje provádění měření a testů in vitro
v místě péče o pacienta. Využívají se diagnostické přístroje s jednoduchým ovládáním. Slouží
pro rychlá stanovení přímo u lůžka pacienta (centrální příjem, jednotky intenzivní péče), v
malých laboratorních provozech, ordinacích praktických lékařů a specialistů nebo pro
sebetestování chronicky nemocných pacientů doma – tzv. Near patient testing. Jedná se o
zařízení do ruky, stolní analyzátory či zařízení na jedno použití. Jsou konstruována tak, aby je
mohli úspěšně obsluhovat pracovníci bez specializovaného laboratorního vzdělání na
klinických odděleních nebo sám pacient. Výsledky POCT urychlují rozhodovací proces o
dalším postupu léčby a péče o pacienta. Některé POCT přístroje jsou vhodnější pro screening
než pro stanovení diagnózy.
Specifickým rysem POCT analyzátorů je jejich jednoduchý způsob obsluhy, vysoce rozvinutý
systém autodiagnostiky s minimálním požadavkem na kalibraci, kontrolu a údržbu ze strany
laboratorně neškoleného zdravotnického personálu.
Ke vzniku POCT zařízení vedla miniaturizace v klinické diagnostice, která je dlouhodobým
trendem. Využívá se rovněž možnosti výroby stabilních reagencií na suché vrstvě využívané u
diagnostických proužků a kazet na jedno použití. Většina POCT zařízení pracuje na bázi
senzorové technologie. Obvyklým řešením je tzv. kazetový systém (cartridge), kdy vložená
kazeta obsahuje všechny potřebné reagencie, kalibrační a kontrolní materiály, případně další
potřebné jednorázové součásti jako např. měřící elektrody.
POCT tvoří nedílnou součást laboratorní diagnostiky a má pevné místo v uspořádání
konsolidované laboratorní medicíny. POCT je důležitým prvkem v péči o pacienta a
optimálním zaváděním POCT do praxe je jeho řízený proces a efektivní využívání jak
z hlediska péče o pacienta tak i z hlediska ekonomického. POCT představuje významný podíl
na diagnostickém trhu a jeho objem roste každým rokem.
2.1. Charakteristiky POCT
 Jednoduchá obsluha nevyžadující obsluhu s laboratorním vzděláním
 Kvantitativní výsledky s přesností a správností podobné jako v klinické laboratoři
 Zabudované kalibrátory a kontroly kvality vedoucí k automatické periodické kalibraci
i automatickému měření kontrolních vzorků
 Nízká cena přístroje, vyšší cena za jedno vyšetření
 Servis výměnou přístroje
 Softwarové uložení výsledků
 Čtečka čárového kódu
 On-line přenos výsledků měření do LIS/NIS
 Dálková správa a supervize laboratoře
2.2. Výhody POCT
 rychlá analýza z plné žilní nebo kapilární krve (malý objem vzorku)
 získání výsledku v době, kdy se lékař plně věnuje pacientovi
 zkrácení analytického času odezvy (krátká doba čekání pacienta)
30
 cílená změna péče v případě časného získání výsledku (rychlost může zachránit
život)
 možnost zlepšení kvality života pacienta
 malá velikost, snadný transport, snadná instalace, snadná obsluha, minimální
údržba
 možnost využití v terénu
Nevýhodou POCT je omezené spektrum prováděných testů a to, že většinou nelze vybrat
jednotlivé testy, ale je třeba provádět celý panel vyšetření.
2.3. Klasifikace POCT zařízení a přístrojů
POCT technologií se analyzují analyty, u kterých je významný požadavek na co nejkratší
dobu odezvy. V současné době je již k dispozici několik desítek POCT testů. Analýza se
provádí z plné venózní a kapilární heparinizované krve nebo moče.
Nejčastěji měříme parametry acidobazické rovnováhy, glukózu a ionty (Na+
, K+
a Cl),
ale
také kardiální markery (troponin T, myoglobin, NT-proBNP) a D-dimer, dále pak enzymy,
Helicobacter pylori nebo albumin v moči.
POCT zařízení a přístroje mohou být
 jednorázové - kvalitativní nebo kvantitativní
 k opakovanému měření
2.3.1. Jednorázová POCT zařízení
Jedná se o diagnostické použky (k chemickému vyšetření moče) pro jeden nebo více analytů
nebo imunoanalytické kazety.
Imunoanalytické kazety obsahují biosenzory. Detekce je založena na měření reflektance,
fluorescence či optického signálu. Princip měření je sendvičový.
Příklad stanovení: Analýza se provádí z plné krve, takže na matrici ze skleněných vláken je
nejdříve třeba oddělit plazmu. Jedna protilátka s obsahem biotinu je navázaná na povrch
porózní matrice. Druhá je značená zlatou vrstvičkou nebo barveným latexem. Vytvořený
komplex se pohybuje po celulózové vrstvě, dokud nedoputuje k záchytné zóně, kde je
ukotven streptavidin, na který se komplex naváže. Výsledek reakce je buď přímo viditelný
okem nebo je vyhodnocen v readeru reflektanční fotometrií.
Jedná-li se o kvantitativní test, využívá se CCD kamera ( zařízení s vázaným nábojem –
charge couplet device). Takto pracuje např. kardiální reader firmy Roche, sloužící ke
stanovení troponinu T, myoglobinu a D-dimeru.
Nejčastěji se jednorázový POCT využívá k měření glukózy. Glukometry mají zabudované
biosenzory využívající glukózoxidázu nebo hexokinázu s fotometrickou nebo
elektrochemickou detekcí. V poslední době u nich podařilo omezit vliv interference
způsobované jinými redukčními činidly. K tomu se jako mediátor využívá ferrocen.
Velký význam mají multitestové kazety ke screeningovému stanovení drog (obr.13), z nichž
některé je možno zakoupit v lékárnách.
31
Obr.13 Kazety ke stanovení přítomnosti drog,
dodává firma Inlab Medical
Na trhu jsou rovněž k dispozici kazety na screening karcinomu tlustého střeva.
Ke stanovení glykovaného hemoglobinu se využívá light – scattering imunostanovení,
v koagulační terapii optické senzory.
Jednorázovým zařízením lze stanovovat také kreatinin, alergeny a fertilitní hormony.
Některá zařízení ke stanovení většího počtu parametrů mají v sobě zabudovanou centrifugu.
2.3.2. Stolní POCT přístroje a POCT přístroje do dlaně k opakovanému měření
Využívají se na jednotkách intenzivní péče, urgentním příjmu, operačních sálech. Pracují na
podobném principu jako jednorázová zařízení – využívají senzory nebo diagnostické proužky.
Nejčastěji měří glukózu, laktát, ureu, krevní plyny. Senzory bývají umístěny společně
s kalibrátory a reagenciemi do jedné kazety.
Nejčastěji využívané POCT přístroje k opakovanému měření – příklady:
 Stanovení kapilární glukózy
Nejzastoupenější ze všech POCT testů je stanovení kapilární glukózy. Glukometrů, na
kterých se měření provádí jsou v nemocnicích desítky. Přístroj se pohodlně vejde do
dlaně. Příkladem je bezdrátové zařízení AccuChek Inform II od firmy Roche. Výsledky
naměřené glukózy jsou elektronicky dokumentovány. POCT na glukózu jsou často
využívány také v domácím monitorování.
32
Obr.14 Glukometr AccuChek Inform II, firma Roche
 Stanovení krevních plynů, derivátů hemoglobinu a elektrolytů
Příkladem je Gem Premiér 3000 od firmy Instrumentation Laboratory.
Nevyužívanější princip při stanovení krevních plynů a elektrolytů je potenciometrie,
amperometrie nebo konduktometrie s využitím senzorů.
Analýza derivátů hemoglobinu je v současnosti založena na spektrofotometrii s
měřením multivlnové délky (60 a více vlnových délek).
 Koagulace
Provádí se měření ACT (aktivační srážecí čas). Vyšetření monitoruje heparinovou terapii.
Je velmi důležité mít pod kontrolou homeostázu po operačních výkonech. Předávkování
heparinem může vést ke krvácení, nedostatečná dávka pak ke tvorbě sraženiny
způsobující embolii.
 Stanovení kardiálních (srdečních) markerů
POCT stanovení založená na imunochemických metodách často využívají reagencie na
tenké vrstvě a time-resolved fluorescenci k detekci.
Jedním z nejnovějších přístrojů ke stanovení srdečních markerů je v současné době analyzátor
firmy Radiometer AQT 90 Flex (obr. 15). Jedná se o stolní analyzátor, ke kterému jsou kromě
testovacích souprav pro kardiální markery vč. NT-proBNP k dispozici též soupravy pro
stanovení βhCG, CRP a D-dimeru.
Principem stanovení na analyzátoru AQT 90 Flex je jednokroková heterogenní sendvičová
imunoanalýza.
Stanovení na AQT 90 Flex: Biotinylované monoklonální protilátky imobilizované na
streptavidinovém vnitřním povrchu testovacího kalíšku tvoří se stanovovaným analytem a
protilátkami značenými europiem sendvičový komplex. Výsledná koncentrace je
kvantifikována porovnáním intenzity signálu vzorku získaného principem časově rozložené
fluorometrie (time-resolved fluorescence - FTR) a kalibrační křivky uložené v softwaru
analyzátoru. Doba stanovení jednoho testu je přibližně 20 minut, u více požadovaných testů v
jednom vzorku se celková doba stanovení prodlužuje o 2 minuty za každý test. U libovolného
vzorku lze provést maximálně 5 testů.
33
Obr.15 Analyzátor AQT 90 Flex, firma Radiometer
 V praxi je využíván také stolní POCT analyzátor k měření krevního obrazu
 Na trhu lze zakoupit také přenosné POCT přístroje určené pro veterinární medicínu.
Příkladem je přístroj VetScan i-Stat dodávaný firmou Inlab Medical na kterém lze
stanovit dle volby 1-8 parametrů. Stanovení trvá pouze 2 minuty.
2.3.3. In vivo POCT
POCT in vivo je prozatím nepříliš rozšířený. Lze takto stanovit krevní plyny nebo glukózu.
Zařízení je umístěno v krevním řečišti a pracuje na principu optické technologie nebo
elektrochemických senzorů.
Popsaná je také mimotělní - ex vivo aplikace. Zařízením protéká uzavřená smyčka krevního
řečiště. Slouží ke stanovení glukózy nebo bilirubinu.
2.4. Dálková správa – centrální software
POCT analyzátory v současnosti podléhají tzv. supervizní činnosti laboratorních pracovníků.
Ta je usnadněna jejich on-line zapojením do nemocničních sítí, což umožňuje dálkovou
správu, monitorování jejich funkce, vyhodnocování automaticky prováděných kontrolních
analýz a přenos naměřených dat do laboratorních a nemocničních informačních systémů.
Systémy umožňují laboratoři prohlížet výsledky testů, kontroly kvality, přístroje a operátory
z jedné pracovní stanice. Po supervizi ze strany laboratoře se pak data dostávají do
nemocničního informačního systému (NIS), tedy zpět na oddělení, kde byla naměřena.
Transfer dat umožňuje existence POCT standardů.
Řada POCT software je specifických pro jednoho výrobce. Moderní systémy jsou však
schopny integrace a soustřeďují a přenáší data z POCT různých výrobců.
34
Cenou za rychlou dostupnost a jednoduchou obsluhu jsou výrazně vyšší finanční náklady ve
srovnání s klasickým laboratorním vyšetřením.
Software pro nemocniční síť POCT glukometrů nabízí již delší dobu např. firmy Abbott,
Roche a Johnson and Johnson.
Příkladem takového softwaru je systém cobas IT 1000. Cobas IT 1000 je systémem rozhraní
pro data pacientů naměřená v místě ošetření, který lze používat ve spojení s glukometry,
koagulometry, readerem na srdeční markery a močovými analyzátory firmy Roche,
vybranými acidobazickými analyzátory firmy Roche, Radiometr a IL, močovým
analyzátorem Sysmex atd. Systém umožňuje centrální management desítek přístrojů a dat a
zajišťuje oboustrannou komunikaci.
Umožňuje koordinátorovi POCT na místě ošetření sledovat a řídit činnost vzdálených
testovacích míst a zajišťovat řádné shromažďování, ověřování a schvalování všech dat před
jejich odesíláním do LIS a do lékařských záznamů NIS. Výsledky kontrolních měření je
možné dále analyzovat, exportovat a zobrazovat pomocí Levey-Jennings a kumulativních
grafů.
Systémy na stanovení glukózy Accu-chek Inform a Accu-Chek Inform II obousměrně
komunikují se systémem cobas IT 1000. Umožňují přenos výsledků měření pacientů a
kontroly kvality do cobas IT 1000. Do glukometrů je pak možné odesílat demografické údaje
pacientů, seznam oprávněných operátorů a centrálně spravovat nastavení konfigurace všech
připojených glukometrů.
Systém je možné dále rozšířit o e-learningový modul cobas academy, který je plně integrován
s cobas IT 1000. Operátoři pak mohou absolvovat pravidelná školení na svém počítači a po
úspěšném složení zkoušky získávají automaticky certifikát pro daný typ analyzátoru na další
období.
2.4.1. Výhody softwarově řízených POCT systémů:
 Snížení počtu chyb způsobených nesprávným měřením, seřízením přístroje či
opisováním dat
 Dokumentace a archivace výsledků - permanentní zdravotní záznam
 Možnost účtovat testy zdravotní pojišťovně
 Standardizace konfigurace jednotlivých přístrojů
 Zachování rychlého získání výsledků a současné poskytnutí vysoké kvality výsledků
 Zajištění dodržení správného postupu
 Možnost centrální laboratoře monitorovat přístroje v oddělených lokalitách, provádět
určité servisní procedury, případně vypnout přístroj
 V data manageru je uložena kalibrační křivka, limity pro kontrolu kvality
 Splnění legislativních požadavků pro in vitro diagnostiku
2.5. Organizace a zajištění POCT
K zajištění efektivního systému POCT je vhodné, aby jednotlivá zdravotnická zařízení
jmenovala koordinátora POCT, který zajistí dobrou komunikaci a vztahy mezi dodavatelem
POCT techniky, laboratoří a jednotlivými klinikami. Každá klinika či oddělení dále potřebuje
osobu odpovědnou za POCT včetně zaškolování, která komunikuje s POCT koordinátorem.
Je nezbytné, aby tento pracovník obdržel detailní návod, který při zaškolování nového
personálu průběžně využívá.
35
Systém POCT by měl být standardizován a zajišťovat, aby výsledky z jednotlivých oddělení
byly srovnatelné. Výhodou je, že jednotný systém vede k množstevním slevám a tedy nižší
ceně za test.
Před umístěním POCT analyzátoru je vhodné zodpovědět následující otázky:
Jak se liší časová odezva (doba, za kterou lékař obdrží výsledek) a cena/test provedená
pomocí POCT analyzátoru a v klinické laboratoři?
Sníží využití POCT dobu čekání v ambulanci či délku hospitalizace?
Neřeší problematiku efektivněji využití vhodného transportu vzorků do laboratoře?
Bude POCT systém na daném oddělení finančně efektivní (při malém počtu testů se
nevyplatí zaškolování personálu, tvorba dokumentace atd.) ?
V dnešní době POCT splňují klinické požadavky po analytické i operační stránce. Existují
velmi dobré přístroje, které dávají vysoce kvalitní výsledky v reálném čase.
Je doporučováno, aby akreditace POCT byla součástí akreditace laboratoře a aby pro POCT
bylo využíváno stejné či podobné dokumentace jako v laboratoři – správné operační postupy,
zácvik operátorů, systém interní i externí kontroly kvality, srovnání s laboratorní metodikou,
záznam poruch a nápravných opatření.
U systémů POCT na jedno použití může být obtížné dosáhnout takových požadavků.
Projevuje se zde silná závislost na schopnosti výrobce pracovat reprodukovatelně.
2.6. Klinický přínos POCT
Vzhledem k pestrosti měřených testů je i přínos jednotlivých vyšetření různorodý.
Screeningové testy mohou vyloučit či potvrdit těhotenství (stanovení hCG) nebo prokázat
např. požití drog. Stanovení koncentrace glukózy pomáhá monitorovat diabetes v domácí péči
a u pacientů v nemocnicích sledovat aktuální glykémii. Stanovení parametrů acidobazické
rovnováhy ( pH, PO2 a pCO2 ), iontů (Na+
, K+
a Cl)
a urey při příjmu pacienta přispívá ke
stanovení rychlé a správné diagnózy.
Literatura:
10. Beňovská M.: Automatizace a robotizace perianalytických procesů v klinické
laboratoři – projekt pro velkou biochemickou laboratoř, disertační práce 2009.
11. Bishop M.L., Fody E.P., Schoeff L.E.: Clinical Chemistry Techniques, Principles,
Correlation. 2010, ISBN 978-0-7817-9045-1.
12. Burtis C:A:, ASHWOOD E:R:, Bruns D.E.: Tietz Fundamentals of Clinical
Chemistry. 2008, ISBN 978-0-7216-3865-2.
13. www.roche-diagnostic.cz – převzato 15.5.2011.
14. www.wikiskripta.eu – převzato 24.6.2011.
15. www.vzorova-ordinace.cz – převzato 24.6.2011
36
3. Elektroforéza
Elektroforéza je analytická metoda, která se řadí mezi elektromigrační separační metody.
Principem této metody je využití rozdílné pohyblivosti (migrace) nabitých částic (iontů)
v elektrickém poli. Při elektroforéze se jedná o mechanický přenos hmoty vlivem působení
elektrického pole.
3.1. Princip elektroforézy
Elektroforéza využívá schopnosti nabitých částic pohybovat se v elektrickém poli. Toto
elektrické pole je vytvořeno vložením konstantního stejnosměrného napětí mezi dvě
elektrody .
Na nabitou částici o náboji Q působí v elektrickém poli o intenzitě E dvě síly:
 Elektrostatická síla F1, která jí uvádí do pohybu :
F1 = QE
kde:
E = intenzita elektrického pole: E = U / l [Volt/cm]
U = napětí mezi elektrodami [Volt]
l = vzdálenost elektrod [cm]
Q = náboj iontu
 Odpor viskózního prostředí F2, který jí brzdí :
F2=kv
kde:
ν- je rychlost pohybu iontu [cm/s]
koeficient k - závisí na velikosti a tvaru částice (iontovém poloměru rozpuštěné
látky) a na viskozitě prostředí (η):
k=6πrη
kde:
r = poloměr iontu [cm], η = vizkozita, π = Ludolfovo číslo
Hnací silou pohybu částice je rozdíl mezi elektrostatickou silou F1 a odporem prostředí F2.
V počátečním okamžiku je rychlost v nulová, částice je uvedena do pohybu elektrostatickou
silou F1. S rostoucí rychlostí v roste síla F2 (odpor prostředí) tak dlouho, až se obě síly
působící na částici vyrovnají a nastane stacionární stav: F1 = F2 ; QE = kv
Rychlost pohybu určité částice v elektrickém poli o jednotkové intenzitě je definována jako
elektroforetická pohyblivost (mobilita) - µ [cm2
s-1
V-1
] :
µ = v/E = Q/k = Q/ 6πrη
Každá elektricky nabitá částice se v elektrickém poli pohybuje ve směru daném znaménkem
svého náboje a orientací elektrického pole. Záporně nabité částice putují k anodě, kladně
nabité částice putují ke katodě. Menší částice s větším nábojem se pohybují rychleji než
částice objemné, které nesou malý elektrický náboj.
3.1.1. Popis základního technického uspořádání elektroforetické aparatury
37
Obr.16 Schéma elektroforetické aparatury
1. prostory pro pufry (anodický a katodický)
2. elektrody – vyrobeny z platiny nebo karbonu, polarita každé z nich je dána připojením
k napájecímu zdroji
3. elektroforetický nosič, kde probíhá vlastní separace – může být přímo v kontaktu
s pufrem, nebo je s pufry spojen prostřednictvím knotů (pufrovaných houbiček)
4. knoty – pufrované houbičky
5. kryt – zabraňuje vypařování, chrání systém během elektroforézy
3.1.1.1. Napájecí zdroj
Funkcí napajecího zdroje při elektroforéze je dodání elektrické energie. Komerčně dostupné
napájecí zdroje umožňují provoz v podmínkách konstantního proudu, napětí nebo výkonu,
které jsou nastavitelné. Při průtoku proudu elektrolytem vziká tzv. Joulovo teplo
H(heat)= (E)(I)(t)
kde:
E = napětí (V)
I = proud (A)
t = čas (s)
Teplo vyvinuté během elektroforézy zvyšuje vodivost systému (snižuje odpor). Při
konstantním napětí je výsledný nárůst proudu příčinou zvýšení tepelného rozrušení
rozpuštěných iontů, způsobuje zvýšení míry migrace proteinů a zvýšení vypařování vody
z nosného média. Ztráta vody je příčinou zvýšení iontové koncentrace a snížení odporu (R,
rovnice č.6). K minimalizaci těchto vlivů na míru migrace je nejlepší použití konstantního
proudu (vloženého na napájecí zdroj).
Podle Ohmova zákona: E= (I)(R)
Pokud se sníží odpor (R), vložené napětí se také sníží (proud zůstává konstantní). To na druhé
straně se sníží tepelný efekt a udrží se relativně konstantní rychlost migrace.
Použítí zdrojů :
Izoelektrická fokuzace (IEF) – používá se zdroj s konstantním výkonem, během separace
dochází ke změně proudu a napětí. Kapilární elektroforéza (CE) – využívá vysokonapěťové
zdroje.
3.1.1.2. Funkce pufru při elektroforéze
Při elektroforetické separaci slouží pufr jako multifunkčí komponenta.
38
Funkce pufru:
 nese vložený proud
 stanoví pH, při kterém probíhá elektroforetické děleni
 určuje výsledný elektrický náboj rozpuštěné látky
Iontová síla pufru ovlivňuje :
 vodivost nosného média
 tloušťku iontové atmosféry okolního náboje molekuly
 rychlost migrace
 ostrost elektroforetických zón
Čím vyšší je koncentrace pufru, tím větší je iontová atmosféra molekuly a molekula se stává
méně pohyblivou.
Vysoká iontová síla roztoku způsobí ostřejší separaci jednotlivých frakcí, ale dochází také
k větší produkci Joulova tepla a tento efekt vede k denaturaci proteinů.
Iontová síla (značená jako I)se počítá podle rovnice
I = 0,5∑ cizi
2
ci = koncentrace iontu [mol/l]
zi = náboj iontu
Iontová síla elektrolytu (pufru), který se skládá z monovalentních iontů, je přímo úměrná jeho
molaritě [mol/l].
3.2. Rozdělení elektroforetických technik
3.2.1. Volná elektroforéza
Při této technice se elektroforéza provádí ve vodných roztocích (elektrolytech), kde částice
s nábojem putují směrem k elektrodě s opačnou polaritou. Rychlost migrace a vzájemné
oddělování částic je dáno velikostí náboje částice a použitým gradientem napětí. Separaci ruší
konvenční proudy a difúze v kapalině, které vznikají vlivem tepla (Joulovo teplo). Tato
technika se již téměř nepoužívá.
2.2. Zónová (zonální) elektroforéza na nosičích
Pro zónovou elektroforézu se využívají hydrofilní (nerozpustné ve vodě) porézní nosiče,
které mají co nejmenší absorpční schopnosti. Prvními použitými nosiči byly neklížený
(chromatografický) papír, acetát celulózy, škrob a celulóza. V současné době se jako nosiče
používají hlavně gely – nejčastěji agarózový (AGE) a polyakrylamidový gel (PAGE). Při
přípravě PAGE gelu je možné ovlivňovat stupeň polymerace (zesíťování) - tedy velikost pórů.
Rychlost migrace proteinů závisí na těchto faktorech:
 Elektrický náboj molekuly
 Velikost a tvar molekuly
 Síla elektrického pole
 Vlastnosti nosného média
 Teplota
Proteiny s rozdílnou pohyblivostí migrují v gelu jako pásy (bandy).
39
3.2.1.1. Elektroforéza v agarózovém gelu - Agarose Gel Elektrophoresis (AGE)
Agaróza je získávána z mořských řas. Je to lineární polysacharid, jehož základní strukturní
jednotka je složena z D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy (viz obr.č.17 ). Průměrná
velikost molekuly agarozy činí 300-400 základních jednotek.
Agarózový gel se připravuje tzv. gelifikací agarózy. Agaróza má za nižších teplot podobu
gelu, gelifikuje (viz obr. č. 18) působením vyšší teploty ve vodném roztoku taje. Bod tání
závisí na koncentraci a typu agarózy. Pro přípravu běžných agarózových gelů se používají
agarózy, které tají při teplotách 85-100 º C a gelifikují při poklesu teploty pod 45-50 º C.
Velikost pórů v gelu závisí na koncentraci agarózy, typicky se pohybuje mezi 100 a 300 nm.
Pro elektroforézu na agarózovém gelu se nejčastěji používá 1-2 % gel agarózy. Používá se
pro dělení částic na základě jejich rozdílného náboje.
Obrázek č.17 Obrázek č.18
3.2.1.2. Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (PAGE = polyacrylamide gel
electrophoresis)
Polymerací akrylamidu (CH2=CH-CO-NH2) vznikají lineární molekuly polyakrylamidu. Ty
se spojují příčnými můstky, které vznikají kopolymerací s N,N‘methylenbisakrylamidem(CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2).
Akrylamid i
methylenbisakrylamid jsou poměrně stabilní látky; polymerace probíhá v nepřítomnosti
vzdušného kyslíku (odstraní se odvzdušněním pomocí vakua) a zahajuje se přidáním
katalyzátorů peroxydisíranu amonného ( persíran amonný, APS) a N,N,N‘,N‘tetramethylendiaminu
(TEMED). APS ve vodném roztoku s TEMED uvolňuje volné
kyslíkové radikály, které atakují molekuly akrylamidu a bisakrylamidu a spouštějí tak jejich
polymeraci (viz obr.č.19,20). Fyzikální vlastnosti gelu a velikost pórů jsou dány podílem
polyakrylamidu v gelu a stupněm jeho zesíťování. Nejčastěji používané koncentrace
polyakrylamidu jsou 5-15%, přičemž koncentrace N, N´-methylebisakrylamidu je obvykle 5%
celkového množství akrylamidu.Nevýhodou je vysoká toxicita akrylamidu N,N´metylenbisakrylamidu.Používá
se pro dělení částic nejen na základě jejich rozdílného
náboje, ale i na základě velikosti molekuly (tzv. síťový efekt).
Obrázek č. 19 Obrázek č.20
40
3.3. Hlavní typy gelové elektroforézy
3.3.1. Gelová nedenaturační elektroforéza
3.3.1.1. Nativní gelová elektroforéza (nedenaturační)
Probíhá bez denaturačních činidel (někdy jsou používány relativně vysoké, nebo nízké
hodnoty pH). Migrace proteinů gelem závisí na jejich náboji, velikosti a tvaru. Citlivost
elektroforézy je dána charakterem póru gelu.
Mobilitu proteinů v nativním gelu ovlivňují tyto faktory:
 Náboj proteinu
 sekvence aminokyselin – relativní počet kyselých a bazických zbytků
 pH roztoku
 trojrozměrná struktura proteinu
 Velikost a tvar proteinu
 Koncentrace a stupeň zesíťování gelu
 gel obecně snižuje mobilitu proteinů, v závislosti na jejich volné pohyblivosti (bez
přítomnosti gelu)
 větší molekuly jsou gelem ovlivněny vice než menší molekuly
 složení gelu může být ovlivněno tak, že dělení probíhá na základě rozdílné velikosti
molekul
Podmínky při elektroforéze musí být optimalizovány pro určitý protein.
Obrázek č.21 Vliv pH na celkový náboj proteinu
Tvar křivky na obr.č. 21 je závislý na sekvenci aminokyselin a vlastní struktuře proteinu. Pro
každý protein existuje pH při kterém je pozitivní a negativní náboj v rovnováze a molekula
nemá žádný náboj. Tato hodnota pH se nazývá izoelektrický bod – pI. Pokud je pH > pI,
),
pokud je pH< pI, protein má pozitivní náboj (AA
3+ ).
3.3.2. Gelová denaturační elektroforéza
3.3.2.1. SDS gelová elektroforéza (denaturační)
Proteiny jsou denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) a β-merkaptoetanolem (zruší
disulfidické vazby). Mobilita proteinů závisí na jejich molekulové hmotnosti.
SDS je anionaktivní detergent, který nese poměrně vysoký náboj, a proto ve vazbě na
bílkovinu vyrovnává nábojové rozdíly bílkovin, které se potom pohybují v gelu jen podle
velikosti. Všechny bílkoviny váží SDS v konstantním poměru, asi 1,4g SDS na 1g bílkoviny,
a tím charakteristicky mění svou konformaci. Výsledné komplexy SDS-bílkovina pak mají
stejnou hodnotu povrchového náboje a jejich konformace se do té míry unifikuje, že relativní
molekulová hmotnost bílkoviny odpovídá velikosti jejího komplexu s SDS (viz obr.č.22).
41
Obrázek č.22
dodecyl sulfát sodný micela SDS ve vodě struktura komlexu SDS - bílkovina
Vzorek proteinu se zpracuje s tzv. vzorkovým pufrem („sample buffer“), který mimo SDS
obsahuje i redukční činidlo dithiothreitol nebo β-merkaptoethanol. Působením těchto látek
dojde k rozrušení kvarterní, terciární a do značné míry i sekundární struktury. Experimentálně
byla prokázána lineání závislost mezi log molekulové hmotnosti a elektroforetickou
mobilitou komplexů SDS - bílkovina.
Pro vlastní odhad molekulové hmotnosti neznámého proteinového vzorku se používají
komerční směsi proteinů - standardy (viz obr.č.23). Tato metoda je vhodná pro analýzu
makromolekulárních komplexů.
Obrázek č.23 Určení molekulové hmotnosti SDS-PAGE
3.3.2.2. Denaturační gelová elektroforéza s močovinou
Vlastností močoviny je její schopnost rozpouštět některé typy proteinů a také štěpit
polymerní proteiny na polypeptidové složky. Při použití močoviny jsou proteiny separovány
podle svého náboje. V tomto případě se používají výhradně polyakrylamidové gely.
3.3.3. Kontinuální zónová elektroforéza
Jde o nejběžnější typ elektroforézy, kdy vlastní separace probíhá v jednom médiu a většinou
v jediném typu pufru.
Při kontinuálním uspořádání proteiny migrují v zóně, která je minimálně tak široká jako je
výška vzorku v gelové jamce při nanesení. Z toho důvodu jsou pak proteinové pásy
v konečném výsledku hůře rozlišené.
Složení elektrodového a gelového pufru je stejné. Tuto techniku nelze použít pro velmi
zředěné vzorky. Kontinuální elektroforéza může probíhat na ktrémkoliv typu gelu, je však
typická především pro agarózové gely.
3.3.4. Diskontinuální zónová elektroforéza
Diskontinuita může být jak v koncetracích gelu, tak především v pH a iontové síle. Je dnes
hlavní elektroforetickou technikou pro analýzu proteinů. Byla vytvořena Ornsteinem a
42
Davisem (1964), zdokonalena Laemmlim (1970).Oproti kontinuální elektroforéze má vysoké
rozlišení a citlivost.
Používá se dvou gelů tzv. koncentrujícího („stacking“) gelu nahoře a separačního („running“)
gelu dole (obr.č. 24).
Obrázek č. 24 Vrstvení a separace v diskontinuálním gelu
Vzorek se nanáší mezi dva elektrolyty s rozlišnou pohyblivostí iontů - mezi vodící (vedoucí)
elektrolyt ve stacking gelu, jehož ionty mají vyšší pohyblivost, a koncový elektrolyt
(terminátor) s nižší pohyblivostí než kterýkoliv iont (kationt nebo aniont v roztoku)
v katodovém pufru. Vzorky nejprve volně prochází gelem s většími póry a poté se na
rozhraní s gelem o malé velikosti pórů koncentrují do úzké zóny („stack“=kupa, hromada)
mezi vedoucím a koncovým iontem.
V tomto uskupení migrují tak dlouho, dokud se nedostanou do separačního gelu -
izotachoforéza.
(dále viz Izotachoforéza)
3.4. Zpracování gelu po separaci - barveni gelů
Po proběhnuté elektroforéze je nutné gel rychle sušit nebo fixovat fixačním roztokem
(obsahuje kyselinu, např.kys. octovou). Tím dojde k denaturaci proteinů a jejich imobilizaci
v nosném médiu, aby se zabránilo difúzi jednotlivých zón. Dále je nutné gel obarvit, aby
došlo k vizualizaci jednotlivých proteinových frakcí. Po promytí přebytku barviva se gel suší.
Barvy, které se používají k vizualizaci se liší podle typu použití a jsou uvedeny v tabulce 1.
Množství barviva, které se během barvení váže na proteiny záleží na mnoha faktorech. Je
ovlivněno typem proteinu nebo stupněm denaturace při fixaci.
Barva použití
Amax
[nm]
Amidočerň 10B
barvení proteinů
620
Coomassie Brilant Blu R-250 590
Coomassie Brilant Blu G-
250
595
Fast Green 610
Acid violet Imunoelektroforéza
Alcian Blu glykoproteiny 630
Basic Fuschin
Glykoproteiny,glykoproteiny
bohaté na sialovou kys.,
nukleové kys.
550
Methyl Green
DNA
635
Ethidium Bromide
(Fluorimetrická detekce)
43
Bromcresol Green
Methylene Blue
RNA
665
Pyrinin Y 510
Toluidine Blu O 620
Tabulka 1 Přehled používaných barviv
3.5. Vyhodnocení elektroforeogramů – detekce a kvantifikace
Po elektroforetické separaci a barvení je možné kvantifikovat jednotlivé zóny jako
procentuální podíl přímou denzitometrii.
Denzitometr je přístroj, který slouží k vyhodnocení hustoty zbarvení v plošném uspořádání.
Jedná se o postup, který je podobný fotometrickému stanovení (liší se v uspořádání),
zaznamenává měnící se hodnotu absorbance v závislosti na intenzitě zbarvení.
Při denzitometrii se měří intenzita záření procházejícího průsvitnou plochou nebo odraženého
záření při neprůsvitné podložece a získává se tak grafický záznam, elektroforeogram.
Jednotlivé frakce dělené směsi tvoří na záznamu v ideálním případě souměrné křivky
zvonovitého tvaru. Plocha pod křivkou těchto píků připadající jednotlivým frakcím je
úměrná relativnímu zastoupení jednotlivých frakcí v dělené směsi. Elektroforeogram se
automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené vlnové délky (400 – 700
nm, tabulka 1), v místě frakcí dochází k částečné absorpci záření to se projeví při dopadu na
detektor. Po zpracování signálu integrátorem získáme číselné výsledky jednotlivých frakcí.
Na jedné podložce je současně vyhodnocováno až 30 elektroforetických drah.
3.6. Základní elektroforetické techniky
3.6.1. Izoelektrická fokuzace (IEF)
Metoda IEF se používá k separaci amfoterních látek (aminokyseliny, peptidy a proteiny).
V závislosti na pH mají amfoterní molekuly kladný nebo záporný celkový náboj („net
charge“).(obr.č. 25) Pro posouzení tohoto náboje při různých hodnotách pH je důležitá
hodnota izolektrického bodu (pI).
Obrázek č. 25 IEF
Tato metoda využívá gely s velkými póry, které obsahují směs syntetických alifatických
polyamino-polykarboxylových skupin, které se označují jako nosné amfolyty. Ty jsou voleny
tak, že pokrývají široký rozsah izoelektrických bodů. Jakmile gel připojíme ke zdroji
elektrického napětí, amfolyty vytvoří stabilní lineární gradient pH s nejnižší hodnotou pH při
anodě a nejvyšší při katodě. Stabilita amfolytů v gelu je zajišťována silnou kyselinou (anoda)
a silnou zásadou (katoda).
Proteiny se po nanesení na gel budou pohybovat pH gradientem až do míst, kde se pH gelu
vyrovná s jejich izoelektrickým bodem (pI). V tomto bodě je protein elektricky neutrální –
44
jakmile by se z této polohy vychýlil na jakoukoli stanu, získal by kladný nebo záporný
náboj a vrátil by se zpět. Výsledkem jsou velmi úzké zóny na gelu (odtud název
„fokuzace“ - „zaostřování“). Proto je rozlišovací schopnost této metody vysoká a lze jí
oddělit i proteiny, lišící se o 0,01 jednotky svých pI.
Proteiny, které se liší nábojem, ale mají prakticky stejnou molekulovou hmotnost (např.
izoenzymy), lze separovat pouze IEF.
IEF se obvykle provádí v 3-4% polyakrylamidových gelech, nebo v agaroze. Do roztoku pro
přípravu gelu se přidávají 2-2.5% amfolyty. Jedná se o směs nízkomolekulárních oligoaminooligokarboxylových
kyselin, které mají rozdílné pI hodnoty. Gradienty se tvoří nejčastěji v
rozmezí pH 3-10 nebo v užším. Nadměrně dlouhým průběhem IEF se působením proudu
gradient zhroutí (amfolyty se začnou pohybovat).
Jinou možností tvorby gradientu je použití immobilinů. Gradient je v tomto případě
imobilizován v gelu, čehož se dosahuje použitím akrylamidových derivátů obsahujících
ionizovatelné skupiny s pufrujícími vlastnostmi.
Anodový roztok je kyselý (k. fosforečná, k. octová, kyselý pufr), katodový roztok je bazický
(NaOH, triethylamin, bazický pufr).
Izoelektická fokuzace se provádí ve vertikálním uspořádání. Hotové IEF gely s amfolyty nebo
immobiliny se dodávají komerčně spolu s přístroji pro auomatizovanou IEF.
Vzorky se obvykle nanášejí na katodové straně. Denaturující podmínky při IEF jsou docíleny
použitím 9 M močoviny nebo neionogenních detergentů (Triton X-100).
3.6.2. Izotachoforéza
Jde o diskontinuální zónovou elektroforézu.
Používá se dvou gelů tzv. koncentrujícího („stacking“) gelu nahoře a separačního („running“)
gelu dole. (obr.č.24). Každý z těchto gelů se připravuje s jiným pufrem (liší se hodnoty pH),
elektrodový pufr se pak liší od obou gelových pufrů.
Vzorek se nanáší mezi dva elektrolyty s rozlišnou pohyblivostí iontů - mezi vodící (vedoucí)
elektrolyt, jehož ionty mají vyšší pohyblivost, a koncový elektrolyt (terminátor) s nižší
pohyblivosí než kterýkoliv iont ( kationt nebo aniont v roztoku). Vodící elektrolyt je na
začátku izotachoforézy obsažen v katodovém prostoru koncový elektrolyt v anodovém
prostoru. Po připojení stejnosměrného napětí se udržuje konstantní proud (asi 102
µA) a
vzorek se začne dělit podle pohyblivostí jeho složek. Rychlejší ionty se dostávají dopředu a
pomalejší se opožďují. Po určité době se ustaví stacionární stav, v němž tvoří jednotlivé
kationty zóny seřazené za sebou podle klesající pohyblivosti iontů. Ve stacionárním stavu se
zóny pohybují stálou a všechny stejnou rychlostí (odtud název izo-tachoforéza). Koncentrace
iontu uvnitř zóny je konstantní, závisí na jeho pohyblivosti a na koncentraci a druhu vodícího
elektrolytu.
O koncentraci v zóně dané látky vždy rozhoduje koncentrace látky v předcházející zóně,
počínaje vodícím elektrolytem. To, že se méně pohyblivé ionty ve stacionárním stavu
pohybují stejně rychle jako ionty pohyblivější, je způsobeno tím, že v každé zóně je jiný
(potenciálový) spád. Gradient potenciálu je tím vyšší, čím méně pohyblivé ionty se zóně
nacházejí (na méně pohyblivé ionty působí větší hnací síla).
Jednotlivé zóny jsou ve stacionárním stavu velmi ostré, protože zde působí tzv.
samozaostřující efekt - opustí-li iont vlivem difúze svoji zónu a dostane se do zóny méně
pohyblivých iontů (působí na něj větší gradient potenciálu), je zvýšením hnací síly popohnán
zpět do své zóny.
Základní rozdíly:
 pracujeme s konstantním proudem
45
 jednotlivé zóny se liší potenciálovým spádem - který závisí na pohyblivosti daných
iontů
 rychlost pohybu zón je ve stacionárním stavu konstantní
 zóny na sebe navazují
 nedochází promísení zón díky samozaostřujícímu efektu
3.6.3. Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE)
Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE) je analytická a preparativní technika, která je schopná
účinně separovat komplexní směsi bílkovin. 2-DE je klíčovou technikou proteomiky. Poprvé
byla popsána již v r. 1975 (O´Farrelem a Klosem), rozšířena byla až s rozvojem proteomiky
v posledních letech. Proteomika je obor, který se zabývá globálním hodnocením exprese
genetické informace na úrovni bílkovin (proteomem), rovněž však zkoumá strukturu a
interakce proteinů. Cíle proteomiky formulovala v roce 2001 Human Proteome Organization
– HUPO :
 expresní proteomika - identifikace všech proteinů kódovaných lidským genomem s
následným stanovením jejich exprese v různých buňkách daného organizmu
 strukturní proteomika zahrnuje subcelulární lokalizaci proteinů v různých organelách,
jejich posttranslační modifikaci a jejich vzájemnou interakci
 funkční proteomika - vztah mezi strukturou a funkcí proteinů
Podstatou 2-DE je využití dvou odlišných fyzikálně chemických vlastností proteinů: nejdříve
jsou proteiny rozděleny podle jejich izoelektrického bodu (pI) v prvním rozměru - pomocí
izoelektrické fokuzace (IFE) a dále v druhém rozměru se proteiny dělí v závislosti na jejich
molekulové hmotnosti použitím elektroforézy v polyakrylamidovém gelu a SDS (SDS -
PAGE).
První rozměr: izoelektrická fokuzace (IFE)
Provádí se na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu s malými póry s imobilizovanými
gradienty pH (Immobilized pH gradients = IPG (obr. č. 26); pH nejčastěji v rozsahu 3-10).
Proteiny migrují ke katodě či anodě dle svého celkového náboje až do chvíle, kdy pH místa v
gelu odpovídá pI proteinu. Podle zvoleného rozsahu pH můžeme měnit škálu proteinů, které
rozdělíme.
Obrázek č. 26 Imobilizovaný pH gradient v polyakrylamidovém gelu s disociovatelnými
karboxy- a aminoskupinami, R= kyselá nebo bazická pufrující skupina
46
Druhý rozměr: elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS
PAGE)
Po separaci v prvním rozměru je provedena běžná elektroforéza na polyakrylamidovém gelu
(PAGE), kdy napětí aplikujeme kolmo vzhledem k původní orientaci elektrod. Proužek gelu
obsahující proteiny po prvním dělení izoelektrickou fokuzací je po ekvilibraci
v ekvilibračním pufru umístěn na vrch deskového gelu, který obsahuje SDS dávající
proteinům uniformní náboj, tj. náboj vztažený na jednotku relativní molekulové hmotnosti.
Cílem ekvilibrace je převést bílkoviny do pufrů vhodných pro SDS separaci a maximalizovat
přenos bílkovin z gelového stripu po prvním dělení. Proteiny poté migrují v druhém rozměru
gelem čistě v závislosti na jejich velikosti.
Vizualizace: barvení 2-DE gelů
Po proběhnutí obou fází 2D elektroforézy je třeba proteiny vizualizovat některou z barvících
či značících metod (chemických nebo radioaktivních). Výsledné "mapy" proteinů lze
porovnávát např. mezi experimentálním a kontrolním vzorkem nebo mezi vzorky odebranými
od pacientů s konkrétním onemocněním oproti zdravým kontrolám a identifikovat tak odlišně
exprimované proteiny, které mohou mít souvislost s patogenezí daného onemocnění.
Proto je třeba ověřit identitu těchto odlišně exprimovaných proteinů, nejčastěji pomocí
"vyříznutí" oblasti gelu vykazující odlišnost a jeho následnou analýzou pomocí hmotnostní
spektrometrie. (obr. č. 27)
Obrázek č. 27
2DE gely
Identifikace proteinů: Hmotnostní spektrometrie
Hmotnostní spektrometrie je metoda, která umožňuje přesné měření molekulární hmotnosti
široké škály látek. Jelikož zkoumaná látka musí být převedena jako intaktní do plynné fáze,
využití hmotnostní spektrometrie pro analýzu proteinů (ale i polysacharidů či
oligonukleotidů) bylo umožněno vývojem "měkkých" ionizačních technik hmotnostní
spektrometrie, kam se řadí desorpce/ionizace za účasti matrice (MALDI) a ionizace
elektrosprejem (ESI). Identifikace proteinu se provádí v zásadě dvěma základními způsoby:
Protein je naštěpen trypsinem nebo jiným proteolytickým enzymem na menší peptidy, jejichž
přesné hmotnosti jsou pomocí MS změřeny. Spektrum těchto hmotností je pak porovnáno s
47
teoretickými spektry, která jsou vypočítána ze sekvencí proteinů v dostupných databázích
(pomocí bioinformatických metod).
Tandemová MS umožňuje zvolit peptid, který je následně fragmentován kolizí s inertním
plynem. Profil výsledků fragmentace (fragmentation pattern) poskytuje částečnou či úplnou
informaci o sekvenci proteinu, která je vodítkem pro hledání shody s daty uloženými v
databázích.
Mimo samotnou identifikaci proteinů je MS neocenitelným nástrojem pro analýzu
postranslačních modifikací proteinů, protože umožňuje lokalizaci dané modifikace uvnitř
proteinu a napomáhá rovněž zjištění charakteru takové modifikace.
Metoda 2D elektroforézy má samozřejmě i své nevýhody - patří mezi ně omezená
reprezentativnost vzorku (problematické jsou velmi zásadité proteiny, proteiny málo
rozpustné ve vodné fázi a membránové proteiny), senzitivita (proteiny přítomné ve velmi
nízkých koncentracích vyžadují speciální typy barvení), reproducibilita a ve srovnání s
obdobnými technikami pro nukleové kyseliny špatná automatizovatelnost.
3.6.4. Kapilární elektroforéza - Capillary Electrophoresis (CE)
Zvláštním způsobem elektroforézy je tzv.kapilární elektroforéza, která vyžívá
elektrokinetických principů elektroforézy a elektroosmózy k separaci látek uvnitř kapiláry.
3.6.4.1. Elektroosmotický tok (EOF)
Povrch křemenné kapiláry obsahuje negativně nabité funkční skupiny, které přitahují
pozitivně nabité ionty. Pozitivně nabité ionty migrují k negativní elektrodě a unáší molekuly
rozpouštědla stejným směrem. Tento celkový pohyb kapaliny je nazýván elektroosmotický
tok. (obrázek č. 28 ) Během separace se neutrální molekuly pohybují stejným směrem jako
elektroosmotický tok (s nepatrnou vzájemnou separací). Pozitivně nabité ionty jsou
elektroosmotickým tokem urychlovány, negativně nabité naopak zpomalovány.
Obrázek č. 28
Elektroosmotický tok-schematicky
Velikost elektroosmotického toku je závislá na náboji kapiláry, viskozitě elektrolytu a
elektrické permitivitě elektrolytu :
μ(eo) = ε ζ / η r
μ(eo) = "EOF mobilita" (rychlost EOF)
η = viskozita
ζ = zeta potenciál (elektrostatický potenciál vzniklý v důsledu náboje na povrchu kapiláry)
r = poloměr kapiláry
ε – permitivita elektrolytu
48
ε ∗ ζ je náboj (v Coulombech) podobně jako μ=q/6πηr
Velikost EOF je značně závislá na pH elektrolytu, protože zeta potenciál je řízen ionizací
silanolových skupin. Do pH=4 je ionizace malá, nad pH=9 jsou prakticky všechny skupiny
ionizované.
Jedním z důsledků existence EOF je možnost detekce kationtů a aniontů v jednom
experimentu v případech, kdy velikost EOF je vyšší než elektroforetická mobilita aniontů
(např. při pH>7), protože tok kapaliny unáší všechny látky ke katodě, kde je detektor.
Nejdůležitější praktické důsledky EOF:
• mohou být detekovány i separovány pozitivní, negativní i neutrální molekuly
• elektrolyt je pumpován od anody ke katodě
Různě nabité molekuly v separovaném vzorku se pohybují různými směry podle náboje, ale
všechny jsou neseny ve směru katody díky elektroosmóze. Kladně nabité molekuly dosáhnou
katody jako první, neboť elektroforetická migrace i elektroosmotický tok mají stejný směr.
Jestliže se za podmínek volné kapilární elektroforézy separují anionty, pak elektroosmotický
tok elektrolytu a elektroforetická migrace mají opačný směr (obr.č. A) Směr
elektroosmotického toku však může být změněn přidáním povrchově aktivních chemických
aditiv do elektrolytu.
3.6.4.2. Technické uspořádání
Kapilární elektroforéza je prováděná v křemenných kapilárách (čistý oxid křemičiý) s malým
průměrem, které jsou vně potažené tenkou vrstvou polyimidu (jiná možnost je teflonová
kapilára nebo skleněná kapilára), případně v kapilárách plněných gelem (CGE). Hydroxylové
skupiny křemene mohou disociovat a nabíjet tak vnitřní stěnu kapiláry. Vnější průměr je
obvykle 180 – 375 µm, vnitřní průměr se pohybuje mezi 20 -180 µm. Celková délka kapiláry
je 20 cm až několik metrů. Kapiláry slouží jako elektroforetická komora, která je terminálním
koncem připojena na detektor a přes rezervoár s pufrem je napojena na vysokonapěťový zdroj
(viz obr.č. 29).
Obrázek č.29
Kapilární elektroforéza-technické uspořádání
Největší výhodou CE oproti tradičním elektroforetickým technikám je možnost účinného
odvodu tepla během separace. To umožňuje použití vysokého napětí v rozmezí 25 – 30 kV,
což vede ke zvýšení separační účinnosti a redukci doby separace, v některých případech až
pod 1 min..
49
Pufry pro CE
Stejně jako při konvenční elektroforéze je pro úspěšné provedení CE kritickým bodem výběr
vhodného pufru. Vybraný pufr nesmí interferovat při detekci stanovovaného analytu, analyt
v něm musí být dokonale rozpustný, během analýzy musí mít vysokou pufrační kapacitu a
musí zaručit požadovanou efektivitu při separaci. Bežně používané pufry s nízkou hodnotou
pH jsou např. fosfátový, acetátový nebo citrárový pufr. Nejvíce používáné pufry pro
alkalickou oblast pH jsou např. TRIS, borátový pufr nebo CAPS (N-cyklohexyl-3aminopropansulfonová
kys.). Intová síla pufru je dalším důležitým variabilním faktorem,
který má efekt (pozitivní i negativní) na elektroforetckou separaci, hlavně proto, že vysoká
iontová síla pufru generuje nadměrné množství Joulova tepla.
Objem vzorku
Množství vzorku musí být přizpůsobeno velikosti separační kapiláry. Typický objem kapiláry
je 1-10 µl a objemy vzorků nepřesahují 0,1-1% této hodnoty (1-10 nl).
Detekce
Většina CE systémů používá on –line detektory (on –column), které musí být citlivé,
vzhledem k malému množství aplikovaného vzorku. Pro detekci se nejběžněji použivá
optický UV – VIS detektor. Více citlivé optické systémy používané při detekci jsou např.
detektory fluorescenční, chemiluminiscenční nebo vodivostní.
3.6.4.3. Základní rozdělení CE technik
CE elektroforéza se provádí několika způsoby - jako zónová elektroforéza, gelová
elektroforéza, micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC), izoelektrická fokusace
nebo izotachoforéza.
3.7. Praktické využití elektroforetických technik v klinické zdravotnické laboratoři
Běžně používanou elektroforetickou separační technikou je gelová elektroforéza,
elektroforéza s následnou imunofixací, kapilární elektroforéza, izoelektrická fokuzace.
Využívají se pro separaci proteinů krevního séra, moče, mozkomíšního moku nebo jiných
biologických tekutin. Dále se používají pro separaci a kvantifikaci izoenzymů (ALP,LDH,
CK), lipoproteinů, frakcí hemoglobinu nebo transferinu.
3.7.1. Elektroforéza bílkovin krevního séra - Serum Protein Electrophoresis (SPE)
Elektroforéza bílkovin krevního séra je běžnou technikou používanou klinickými
laboratořemi k vyhledávání abnormalit ve spektru bílkovin.
Přehled nejvíce používaných elektroforetických technik
Gelová elektroforéza
Při standartní SPE jsou vzorky nanášeny v blízkosti katodického konce nosného média, které
je saturováno alkalickým pufrem (pH 8,6) s nízkou iontovou sílou (asi 0,05). Jako nosné
médium se nejčastěji používá agarózový gel (méně často acetát celulóza).
Nosné medium je spojeno s dvěma elektrodami a proud prochází nosným médiem
k separovaným proteinům. Typické parametry při elektroforetické migraci jsou: proud 10 mA
na 1 cm šířky gelu s časem migrace asi 10 min. (napětí 240 V, teploty 20 º). Všechny hlavní
sérové proteiny nesou při pH 8,6 negativní náboj a migrují k anodì. Při standartnì používané
SPE se sérové proteiny dìlí na 5-6 proteinových frakcí.
50
Každá zóna obsahuje jeden a více sérových proteinù. Nejvíce anodicky putuje albumin,
následují α1-globuliny α2-globuliny, β1-globuliny, β2-globuliny a gamaglobuliny. Každá zóna
obsahuje jeden a více sérových proteinů (obr. č.30 ). Šířka proteinového bandu frakce závisí
na počtu proteinů, které jsou ve frakci přítomny.
Obrázek č. 30
Po elektroforetické separaci jsou proteinové frakce zafixovány v nosném médiu ponořením do
kyselého fixačního média (např. kys. octová), dojde k denaturaci proteinů a jejich imobilizaci
v nosném médiu. V dalším kroku jsou proteiny vizualizovány barvením. Nejčastěji se jako
barvivo používá Amidočerň 10B nebo Coomasie blue. Vyhodnocení elektroforeogramu je
buď vizuální nebo denzitometrické (viz Vyhodnocení elektroforeogramů – detekce a
kvantifikace). Po zpracování signálu integrátorem PC získáme číselné výsledky jednotlivých
frakcí v %. Koncentrace je vypočítana jako % z hodnoty celkové bílkoviny, která byla
stanovena kvantitativně (např. nejvíce používanou Biuretovou metodou).
Obrázek č. 31
Vysokorozlišovací elektroforéza – High Resolution electrophoresis (HR)
HR elektroforéza je určena k elektroforetickému rozdělení bílkovin lidského séra ( dalších
biologických tekutin jako jsou moč a likvor) na alkalicky pufrovaných agarózových gelech o
pH 8.6. Vyhodnocení je buď vizuální nebo denzitometrické (relativní kvantifikace
jednotlivých zón).
V principu jde o zónovou elektroforézu prováděnou na agaróze. Většina laboratoří používá
tradiční pětizónovou (nebo šesti-zónovou) elektroforézu, HR elektroforéza však přináší další
diagnostické informace.Bílkoviny séra dělí na přibližně 10 frakcí. Každá frakce obsahuje
jeden a více sérových proteinů. Složení gelu, podmínky elektroforézy a volba barvičky
dovoluje vynikající rozlišení a vysokou senzitivitu zvláště v gama zóně. ( obr.č.32) Gely je
51
možné obarvit amidočerní nebo kyselou violetí. Obarvené elfogramy lze vyhodnotit vizuálně
a denzitometrií.
Obrázek č. 32 HR elektroforéza
Kapilární elektroforéza
Další technikou ve zdravotnických laboratořích pro elektroforézu proteinů krevního séra je
kapilární elektroforéza. (viz výše) Povrch křemenné kapiláry obsahuje negativně nabité
funkční skupiny, které přitahují pozitivně nabité ionty. Pozitivně nabité ionty migrují
k negativní elektrodě a unáší molekuly rozpouštědla stejným směrem. Tento celkový pohyb
kapaliny je nazýván elektroosmotický tok. Během separace se proteiny pohybují stejným
směrem jako elektroosmotický tok. Elektroforetické dělení proteinů probíhá v silikonových
kapilárách o délce 30 -50 cm s vnitřním průměrem 25-100 µm. Detekce se provádí v oblasti
vlnových délek 200-600 nm.
Elektroforéza s následnou imunofixací - serum immunofixacion electrophoresis (sIFE)
IFE je určena k detekci monoklonálních proteinů v lidském séru a v moči. Proteiny
separované elektroforézou na alkalicky pufrovaných agarózových gelech jsou inkubovány se
specifickými antiséry proti těžkým řetězcům Ig G, Ig A, Ig M a lehkým volným i vázaným
kappa a lambda řetězcům. Po odstranění nezreagovaných bílkovin jsou precipitáty obarveny
kyselou violetí nebo amidočerní. Elektroforeogramy se hodnotí vizuálně a pátrá se po
přítomnosti monoklonálních bílkovin.
Atypické proužky zjištěné elektroforézou v zóně alfa2 až gamaglobulinů mohou vyvolávat
podezření na výskyt monoklonálních proteinů (M-proteiny, paraproteiny, monoklonální
imunoglobuliny) a tím gamapatie. K identifikaci těchto abnormálních proužků slouží
imunofixace. Imunofixační elektroforéza umožní zafixování proteinů in situ, kde tvoří
nerozpustné komplexy s odpovídajícími protilátkami.
Provádí se ve čtyřech krocích
1. Separace proteinů elektroforézou na agarózovém gelu.
2. Imunofixace (imunoprecipitace) proteinů rozdělených elektroforézou – příslušné
migrační stopy jsou překryty jednotlivými antiséry. Antiséra difundují do gelu a
precipitují přítomné antigeny. Proteiny v referenční stopě jsou jsou fixovány fixačním
roztokem.
52
3. Neprecipitované, rozpustné proteiny jsou z gelu odstraněny odsátím a promytím.
Komplex antigen-protilátka zůstává v gelové matrix.
4. Precipitované proteiny jsou vizualizovány obarvením.
Elektroforetické dělení vzorku probíhá simultánně v šesti stopách. Po elektroforéze – první
stopa (ELP) slouží jako referenční. Zbývajících 5 stop je použito k nanesení specifických
antisér – trivalentní proti těžkým řetězcům (G, A, M) a anti-kappa a anti-lambda volným a
vázaným lehkým řetězcům (Obr. č.33).
Imunofixační proužky jsou porovnány s odpovídajícími frakcemi referenčního vzorku –
odpovídající proužek by měl mít stejnou migrační pozici.
Obrázek č. 33 Imunofixace séra: Sérum 1 – typ mIg : IgG kappa, sérum 2 – typ mIg: IgG
lambda
3.7.1.1. Klinický význam stanovení
Vyšetření slouží k diagnostice a monitorování mnohočetného myelomu a dalších
patologických stavů spojených s absorpcí, nadměrnou produkcí bílkovin, popř. stavů
spojených se zvýšenými ztrátami bílkovin následkem orgánového postižení nebo změnou
nutričních návyků.
Elektroforéza sérových bílkovin se provádí zejména, zjistíme-li patologický výsledek celkové
bílkoviny, nebo potřebujeme-li podrobnější informaci o sérových bílkovinách. Zvlášť cenná
je pro průkaz dysproteinemie – změna koncentrace a kvalitativního složení jednotlivých
bílkovin v séru, paraproteinemie – charakterizována přítomností monoklonálních
imunoglobulinů.
Referenční hodnoty jednotlivých bílkovinných frakcí pro dospělé osoby jsou uvedeny
v tabulce č. 2
(zdroj: Clinical guide to laboratory tests, Tietz, fourth edition)
Frakce %
Albumin 39-51
α1-globuliny 2 - 4
α2-globuliny 4– 8
β1-globuliny
β2-globuliny
5-10
gamaglobuliny 6-12
Tabulka č.2
53
Velkou předností elektroforézy ve srovnání s kvantifikaci specifických proteinů je přehled,
který poskytuje. Elektroforeogram nám dává informace o relativním zvýšení, snížení nebo
homogenitě jednotlivých proteinových frakcí.
Proteiny tvoří velkou skupinu látek přítomných v plazmě (séru), jejich celková koncentrace se
pohybuje v rozmezí 60 - 80 g/l. Tyto proteiny plní řadu funkcí, nacházíme zde transportní
proteiny, protilátky, inhibitory enzymů, srážecí faktory, aj. Pro vyšetření spektra krevních
proteinů je nejvhodnějším sérum: na rozdíl od plazmy neobsahuje fibrinogen (faktor I
koagulační kaskády), jehož fyziologická koncentrace je kolem 3 g/l. V případě vyšetření
plazmy se fibrinogen nachází v místech, kde se za patologických situací mohou vyskytovat
tzv. monoklonální imunoglobuliny (viz dále). Během různých onemocnění se mění relativní
zastoupení jednotlivých proteinů v séru a tím i elektroforeogram (výsledek elektroforézy),
který tak může sloužit k orientačnímu zhodnocení zastoupení výše uvedených frakcí proteinů.
Hlavní proteiny jednotlivých elektroforetických frakcí
Přehled v tabulce č.3 uvádí proteiny jednotlivých frakcí i proteiny vyskytující se mezi
uvedenými frakcemi, v tzv. interzónách. Za fyziologických podmínek je koncentrace těchto
proteinů nízká, proto netvoří samostatné frakce (píky v elektroferogramu).
frakce bílkovina význam komentář
Albumin Albumin
Albumin je syntetizován
v játrech. Jeho koncentrace
v séru je 35 - 50 g/L a
biologický poločas činí 20 dní.
Albumin je velmi významný
transportní protein - váže a
přenáší mnohé látky (mastné
kyseliny, hormony, bilirubin,
léky, kovy). Dále se podílí na
udržení vodní rovnováhy mezi
intravaskulárním a
extravaskulárním prostorem
(udržování onkotického tlaku
krevní plazmy) a pufruje tělní
tekutiny
- zvýšení:
dehydratace
- snížení:
poškození jater,
chronická infekce,
onemocnění
ledvin, podvýživa,
monoklonální
gamapatie
Interzóna
albumin /alfa-1
Alfa1-lipoproteiny
Alfa1-fetoprotein
Alfa1-kyselý
glykoprotein
(orozomukoid)
Alfa1-lipoproteiny
(= lipoproteiny o vysoké
hustotě, HDL) se účastní
transportu cholesterolu a
vitamínů rozpustných v tucích.
-zvýšení:
hyperlipidemie
- snížení:
onemocnění jater
Alfa1-fetoprotein je
onkofetální antigen
syntetizovaný během vývoje
zárodku
zvýšení: karcinom
jater
54
Alfa1-kyselý glykoprotein
(orozomukoid) je glykoprotein
syntetizovaný v játrech
- zvýšení: jako
odpověď na různá
akutní a chronická
zánětlivá
onemocnění
- snížení: při
poruše
proteosyntézy v
játrech
Alfa-1
globuliny
Alfa1-antitrypsin (=
alfa-1-inhibitor
proteáz; API)
Alfa1-antitrypsin (= alfa-1inhibitor
proteáz; API) patří
mezi inhibitory proteolytických
enzymů (např. elastázy,
kolagenázy) produkovaných
leukocyty nebo bakteriemi.
Řadí se mezi tzv. „proteiny
(reaktanty) akutní fáze“
zvýšení: akutní
zánětlivé reakce
- snížení: těžké
hepatopatie,
hypoproteinemie,
vrozený defekt
tvorby API
Interzóna alfa-
1 / alfa-2
Alfa1-
antichymotrypsin
Alfa1-antichymotrypsin je
inhibitor proteolytických
enzymů.
-zvýšení: akutní
zánětlivé reakce
Alfa-2
globuliny
Alfa-2-
makroglobulin
Haptoglobiny
Alfa-2-makroglobulin je také
inhibitorem proteolytických
enzymů. Jeho koncentrace jsou
závislé na věku (vyšší v
dětství).
-zvýšení:
nefrotický
syndrom
- snížení:
reumatoidní
artritida, myelom,
akutní
pankreatitidy
Haptoglobiny tvoří skupinu
proteinů vázajících volný
hemoglobin (Hb) za tvorby
hemoglobin-haptoglobinového
komplexu, který je rychle
z krve vychytáván buňkami
retikuloendoteliálního systému,
kde je metabolizován;
Hb-haptoglobinový komplex
tak zabraňuje ztrátám železa
močí.
-zvýšení: akutní a
chronické záněty
- snížení:
onemocnění jater,
hemolytická
anemie
Beta-1
globuliny
Transferin
Transferin je hlavní transportní
protein pro železo; přenáší
železo ze střeva a mezi místy
syntézy a odbourávání
hemoglobinu.
- zvýšení: anemie
způsobené
nedostatkem
železa
- snížení:
onemocnění jater,
55
podvýživa,
zánětlivá
onemocnění,
malignity
Interzóna beta-
1 / beta-2
Beta-lipoproteiny
Beta-lipoproteiny (=
lipoproteiny o nízké hustotě,
LDL) se podílí na transportu
cholesterolu.
- zvýšení:
hyperlipidemie
- snížení:
hladovění
Beta-2
globuliny
C3 složka
komplementu
C3 složka komplementu je
jeden z proteinů systému
komplementu, podílejícího se
na zánětlivé rekci.
-
zvýšení: akutní
zátěž organismu
- snížení:
autoimunitní
onemocnění
(tvorba
imunokomplexů)
Gamaglobuliny Imunoglobuliny
Gamaglobuliny jsou
imunoglobuliny (protilátky)
syntetizované plazmatickými
buňkami. Kvantitativně je
nejvýznamnější IgG.
Normální rozsah migrace
polyklonálního IgG je celá
katodická část počínaje zónou
b1, IgM – migruje v anodické
zóně gama, IgA – migruje v
iterzóně b1 a b2- globulinů.
-
zvýšení:
polyklonální (nebo
monoklonální)
gamaglobulinemie,
jaterní
onemocnění,
chronické infekce
- snížení:
fyziologicky u
malých dětí,
hypoimunitní
syndrom
Tabulka č.3
Jednotlivé elektroforetické typy jsou v tabulce č.4:
Typ
elektroforeogram
u
kometář Alb α1 α2 β γ
Výskyt
(příklad)
Typ akutního
zánětu
zvýšení
pozitivních
reaktantů akutní
fáze (α1-
antitrypsinu,
orosomukoidu,
haptoglobinu,
ceruloplazminu,
CRP, C3)
pokles
akutní fáze
infekčních
onemocnění,
akutní
poškození tkáně
(infarkt
myokardu,
chirurgický
výkon),větší
56
negativních
reaktantů akutní
fáze
popáleniny
Typ
chronického
zánětu
polyklonální
zmnožení
imunoglobulinů
rekonvalescenc
e po infekčním
onemocnění
některá
revmatická
onemocnění
Chronický
aktivní zánět
zvýšení α-
globulinů
svědčí o
reaktivaci
procesu
chronická
aktivní
revmatoidní
artritida
Typ hepatopatie
vázne
proteosyntéza
v hepatocytech
jater
nadměrná
tvorba
imunoglobulinů
někdy se
neoddělí β a γ
frakce (tzv. β-γ
můstek – při
zvýšení IgA)
chronická
jaterní
onemocnění –
jaterní fibróza a
cirhóza
57
Typ nefrotického
syndromu
výrazné ztráty
bílkovin močí
(převládají
renální ztráty
albuminu)
zvýšení
bílkovin s
největší Mr –
α2-
makroglobulinu
a β-lipoproteinu
nadměrná
tvorba
imunoglobulinů
někdy se
neoddělí β a γ
frakce (tzv. β-γ
můstek – při
zvýšení IgA)
nefrotický
syndrom
Hypogamaglobui
nemie
pokles v oblasti
γ globulinů
primární
deficity tvorby
protilátek
sekundární
deficit tvorby
protilátek
ztráty
imunoglobulinů
Monoklonální
gamapatie
homogenní
vrchol kdekoliv
v oblasti α2 až γ
deficit
polyklonálních
Ig
benigní
monoklonální
gamapatie
maligní
monoklonální
gamapatie
(mnohočetný
myelom)
Tabulka č.4
58
SPE s následnou denzitometrií má klíčový význam při diagnostice monoklonálních gamapatií
(MG). Monoklonální gamapatie jsou definovány jako skupina onemocnění, které jsou
charakterizovány proliferací jednoho klonu plazmatických buněk produkujících homogenní
imunoglobulin. Toto onemocnění má maligní nebo potenciálně maligní charakter (např.
mnohočetný myelom). V elektroforeogramu pátráme vizuálně po atypické zóně – proužek
monoklonálního imunoglobulinu.
Při elektroforéza séra mohou monoklonální imunoglobuliny migrovat v širokém rozsahu od
oblasti alfa2-globulinů až po katodický konec zóny gama-globulinů. Pro typizaci
monoklonálního imunoglobulinu se používá elektroforéza s následnou imunofixací.
3.7.2. Elektroforéza bílkovin moče - Urine Protein Electrophoresis (UPE)
Elektroseparační techniky pro analýzu moče poskytují kvalitativní pohled na proteinurii.
Zjištění a identifikace proteinurie je užitečnou informací při diagnostikování onemocnění
ledvin. Proteinurie může být důsledkem mnoha patologických stavů. Identifikace hlavních
bílkovin v moči pomáhá přesně určit typ poškození ledvin (tubulární, glomerulární nebo
smíšený) a dále pomáhá při identifikaci monoklonálních gamapatií (Bence- Jonesovy
bílkoviny).
UPE poskytuje informaci o přítomnosti některých vylučovaných proteinů – albuminu,
transferinu, IgG, α1- mikroglobulinu, hemoglobinu, event. monoklonálních volných lehkých
řetězců imunoglobulinů (tzv. Bence - Jonesova bílkovina) v závislosti na jejich koncentraci
v séru a funkcích ledvin. Elektrofoforeogram bílkovin moče je podobný rozdělení bílkovin v
séru, avšak intenzita frakcí závisí na filtrační schopnosti ledvin. K analýze používáme
zahuštěné nebo nezahuštěné vzorky moče. Zahuštění se provádí na koncentraci bílkoviny asi
15 - 20 g/l pomocí koncentračních zkumavek (Vivaspine 2, Santorius). Tyto zkumavky
obsahují speciální hydrofilní membránu, což znesnadňuje vazbu proteinů. Membrána je
vyrobena z polyethrsulfonátu (PES), triacetátu celulózy (CTA) nebo ze stabilizované celulózy
(Hydrostat), má cut-off hodnotu podle molekulové hmotnosti, pro kterou je nepropustná.(5,10
a 30 kDa). Stabilita moče pro vyšetření elektroforézy je minimálně 1 týden při teplotě 2 – 8
°C, není doporučeno vzorky mrazit.
3.7.2.1. Přehled nejvíce používaných elektroforetických technik
Elektroforéza v zahuštěné moči se provádí za stejných elektroforetických podmínek jako
SPE a sIFE.
Gelová elektroforéza na agarózovém gelu v kombinaci s monoklonálními protilátkami proti
vybraným proteinům
Bílkoviny jsou rozděleny na zásaditě pufrovaných agarózových gelech (pH 9.1) a
imunofixovány pomocí specifických antisér bílkovin, které představují různé typy proteinurie.
Imunofixační elektroforéza umožňuje ukotvení bílkovin in situ po elektroforéze vytvořením
nerozpustných komplexů s odpovídajícím antisérem. Tento postup umožňuje v jednom kroku
charakterizovat různé proteinurie a detekci Bence Jonesových bílkovin jako kvantitativní
pomůcka při identifikaci monoklonálních gamapatií.
Vzorek zahuštěné moče je současně podroben elektroforéze v devíti stopách na alkalicky
pufrovaném agarózovém gelu. Po elektroforéze slouží jedna stopa (ELP) jako referenční pro
znázornění elektroforetického uspořádání bílkovin ve vzorku. Zbývajících osm stop je
imunofixováno příslušným antisérem. Nevysrážené, rozpustné proteiny jsou z gelu
odstraněny pomocí odsávání a promývání. Precipitovaný komplex antigen-protilátka je
59
zachycen v matrici gelu. Vysrážené bílkoviny jsou vizualizovány barvením kyselou violetí.
Přebytečné barvivo se odstraňuje kyselým roztokem.
Následuje imunofixace specifickými antiséry proti různým bílkovinám.
- tubulární proteiny ß2 mikroglobulin, Protein vázající Retinol (RBP) a α1 mikroglobulin,
- glomerulární proteiny (Albumin a α2 makroglobulin),
- těžké řetězce gama, alfa a mí (s trivalentním antisérem)
- lehké řetězce kappa, volné i vázané
- lehké řetězce lambda, volnι i vázané
- lehké volné řetězce kappa
- lehké volné řetězce lambda
Imunoprecipitovanι frakce jsou potom porovnány s odpovídajícími abnormálními frakcemi v
elektroforetickιm záznamu vzorku a identifikovány podle reakce nebo nepřνtomnosti reakce s
jednotlivými antiséry (obrázek č. 34 ).
Obrázek č. 34
SDS – elektroforéza na agarózovém (SDS AGE) nebo polyakrylamidovém gelu (SDS
PAGE)
Pokud je nutné provést typizaci proteinů moče, je možné provést elektroforézu na neutrálně
pufrovaných SDS gelech, které separují močové bílkoviny podle jejich molekulové hmotnosti
a zcela jasně odlišují bílkoviny tubulární od bílkovin glomerulárního původu. Výsledek
elektroforetického dělení proteinů obarvených kyselou violetí je vizuálně porovnáván s
proteinovými markery v referenční stopě. Tímto způsobem lze identifikovat jednotlivé
bílkoviny a proteinurii správně klasifikovat. Elektroforéza ke klasifikaci proteinurie se
provádí v nezahuštěné moči.
V přebytku anionického detergentu SDS (Sodium Dodecyl Sulfate – laurylsíran sodný) jsou
bílkoviny změněny v komplexy obsahující SDS. V těchto komplexech dochází k rozrušení
nativní struktury bílkovin a zaujetí uniformní struktury o stejném negativním elektrickém
náboji na jednotku hmotnosti.
Při elektroforéze na mediu s prosívacími vlastnostmi (gely s vysokou koncentrací ) dochází
k rozdělení močových bílkovin dle jejich molekulární hmotnosti (obr.č.35). Jednotlivé
bílkoviny tubulárního původu (M.V. < 65 - 70 kDa) jsou jasně odlišeny od glomerulárních
(M.V. > 65 - 70 kDa). Dle detekovaných bílkovin lze proteinurii klasifikovat jako tubulární,
glomerulární a smíšenou. Nastavení parametrů procedury a citlivost barvení kyselou violetí
umožňuje detekci proteinů bez předchozího zahuštění moče. Minimální detekční hladina je 15
mg/L na frakci.
60
Obrázek č. 35
3.7.2.2. Klinický význam stanovení
Vyšetření močových bílkovin stále zůstává jedním ze základních vyšetření v nefrologii.
Toto vyšetření má nezastupitelné místo v časné diagnostice nemocí ledvin. Současná
diagnostika je založena na vyšetření celkové bílkoviny a albuminu v moči, méně často je
vyšetřována močová exkrece jednotlivých dalších močových proteinů.
Glomerulární kapilární stěna ledviny efektivně brání průniku bílkovin v závislosti na jejich
molekulové hmotnosti (velikosti), náboji a tvaru. Bílkoviny s molekulovou hmotností větší
než albumin (69 kD) pronikají do moči velmi omezeně. Nízkomolekulární bílkoviny, které
jsou volně filtrovány v glomerulech, jsou účinně resorbovány a následně katabolizovány v
proximálním tubulu a jejich koncentrace v moči jsou minimální. Nejvýznamnější součástí tzv.
fyziologické proteinurie je tzv. Tamm-Horsfallův protein (uromodulin) – mukoprotein.
Dalšími složkami jsou albumin (do 10 mg/24 h), IgG a sekreční IgA (do 10 – 15 mg/24 h) a
volné lehké řetězce imunoglobulinů (do 10 – 15 mg/24 h).
Při běžné svalové aktivitě nepřesáhne fyziologická proteinurie 50 – 80 mg/24 h, při větší
svalové aktivitě, prolongované ortostáze a sníženém příjmu tekutin může být vyšší – horní
hranice fyziologické proteinurie je arbitrárně definována na 150 mg/24 h.
Podle velikosti ztrát bílkovin do moči za 24 h se proteinurie dělí na malou (0,15 – 1,5 g/24
h), střední (1,5 – 3,5 g/24 h) a velkou (> 3,5 g/24 h).
3.7.3. Elektroforéza bílkovin mozkomíšního moku
Vyšetření mozkomíšního moku (Cerebrospinal fluid-CSF) je důležitou součástí diagnostiky
onemocnění centrálního nervového systému (CNS).
Celá řada onemocnění CSN se vyznačuje zvýšením proteinů v mozkomíšním moku v
důsledku zvýšené permeability hemato-encefalické bariéry nebo zvýšené syntézy
imunoglobulinů - v první řadě imunoglobulinu (Ig) ve třídě IgG v CNS. Přítomnost
intratékálního Ig G je významnou informací vedoucí k dg. zánětlivého onemocnění CNS
jehož příčinou je např. skleróza multiplex. Ačkoliv oligoklonální proužkování není ani
diagnostické ani specifické pro toto onemocnění, je široce používáno jako podpůrná
informace a považováno za základní vyšetření dle konsenzu "Evropské komise pro sklerózu
multiplex". Potvrzuje diagnózu u pacientů s klinickými příznaky choroby a pomáhá při
diagnostice případů s nepřesvědčivými klinickými znaky.
61
Kritéria pro detekci Ig G oligoklonálních pásů v CSF
 metoda s největší rozlišovací schopností a citlivostí pro detekci oligoklonálních pásů
je izoelektrická fokusace
 oligoklonální Ig G musí být detekováno specifickým antisérem
 pro potvrzení intrathekální syntézy musí být vzorek séra a CSF pacienta analyzován
paralelně, pro demonstraci rozdílů v Ig G distribuci
 koncentrace Ig G v CSF i séru musí být nastavena na stejnou hladinu
 mělo by se předejít zahušťování CSF.
3.7.3.1. Nejvíce používaná elektroforetická technika
Izoelektrická fokuzace s imunofixací
Procedura zahrnuje izoelektrofokuzaci na agarózovém gelu, následovanou immunofixací s
anti-IgG antisérem. IgG immunofixační vzorky CSF a séra od téhož pacienta jsou pak
vizuálně porovnány. Citlivost metody dovoluje analýzu CSF bez předchozího zahušťování.
Test se provádí ve dvou stupních
 Izoelektrofokuzace na agarózovém gelu k rozdělení proteinů ve vzorcích CSF a séra.
 Imunofixace anti Ig G antisérem značeným enzymem (peroxidáza) určeným k detekci
Ig G oligoklonálních proužků a demonstrace rozdílů nebo nepřítomnosti Ig G v CSF a
v séru.
Při koncentraci IgG 10 mg/L (a více), může být jeho rozdělení detekováno bez zahuštění
CSF vzorku. K potvrzení intrathekální syntézy Ig je nutno analyzovat sérum a mozkomíšní
mok paralelně ve stejných koncentracích, aby byl demonstrován rozdíl v distribuci IgG.
1 CSF, 1´
sérum, 2 CSF, 2´ sérum .........pacientů
7.3.2. Klinický význam stanovení
Nejcitlivější metodou pro průkaz intrathekální syntézy protilátek je stanovení oligoklonálních
imunoglobulinů metodou izoelektrické fokuzace s následným barvením nebo imnofixací.
Fyziologicky mají imunoglobuliny v séru i mozkomíšním moku polyklonální charakter a
vyjadřují heterogenitu individuálních protilátek produkovaných jako odpověď na nejrůznější
antigeny, s nimiž se jedinec setkal.
Předpokládá se, že do CNS vstupuje pouze omezený počet B-lymfocytů, které se po aktivaci
antigenem (např. určitým mikroorganizmem nebo autoantigenem) diferencují v plazmatické
buňky secernující protilátky. Intrathekálně produkované protilátky se vyznačují pouze
omezenou (oligoklonální) heterogenitou, což se při izoelektrické fokusaci projeví jako
izolované proužky, které nejsou patrné při analýze séra. Z toho vyplývá nutnost provádět
současně analýzu imunoglobulinů likvoru i séra. Srovnává se přítomnost či nepřítomnost
identických pruhů IgG v séru a moku; počet a lokalizace proužků nemá diferenciálně
diagnostický význam.
62
Popisuje se pět různých typů izoelektroforegramů (obr. 36 ):
Orázek č. 36
Základní typy izoelektroforegramů mozkomíšního moku (obr. )
Typ 1 – v séru i v moku pouze polyklonální IgG – normální nález;
Typ 2 – oligoklonální proužky pouze v likvoru – lokální syntéza IgG (např.u roztroušené
míšní sklerózy)
Typ 3 – oligoklonální proužky v likvoru a další oligoklonální proužky v likvoru i v séru –
lokální syntéza IgG a produkce protilátek v organizmu (např. chronická infekce CNS,
roztroušená skleróza);
Typ 4 – identické oligoklonální proužky v séru i moku (tzv. „zrcadlový“ obraz proužků v
séru a v likvoru – dochází k průniku protilátek z krve do likvoru) – systémová imunitní
aktivace bez lokální syntézy IgG v CNS;
Typ 5 – identické monoklonální proužky v séru i moku v krátkém úseku pH gradientu, jde
o přítomnost monoklonálního paraproteinu v likvoru sérového původu ; myelom;
monoklonální gamapatie
3.8. Výrobci elektroforetických zařízení
Vzhledem k vysokému počtu analyzovaných vzorků, hlavně vzorků séra, většina
zdravotnických laboratoří používá pro elektroforézu automatické systémy. Plná automatizace
snižuje objem manuální práce na minimum. Tyto systémy provádí automatickou aplikaci
vzorku a reagencií (např. promývací roztoky, antiséra) na gel, elektroforetickou separaci,
fixaci barvení, promytí a sušení gelu.
3.8.1. Automatizované systémy pro gelovou elektroforézu bílkovin
Výrobce Sebia (Francie) – analyzátor HYDRASYS
Poloautomatické systémy HYDRASYS jsou nejrošířenější elektroforetické systémy
v klinických laboratořích. Tyto systémy jsou určeny pro elektroforézu bílkovin na agaróze
(AGE). Lze provést až 145 elektreforéz bílkovin krevního séra za hodinu. Na jednom gelu je
možné separovat až 54 vzorků séra v jednotlivých elektroforetických stopách. Analyzátor
Hydrasys se skládá z modulu migračního (aplikace vzorku, elektroforetická migrace atd.) a
barvícího (fixace, barvení a sušení gelu). Provádí všechny fáze elektroforézy. Migrační model
je vybaven systém pro kontrolu teploty (Peltierův effekt), který během migrace zajistí
konstantní teplotu. Druhá generace přístrojů má zabudovaný skenovací modul pro následné
63
denzitometrické vyhodnocení elektroforeogramů. Skenovací modul umožňuje snímání s
vysokým rozlišením obrazu a kvantifikaci gelu za méně než jednu minutu. Tento přístroj má
také mudul pro izoelektrickou fokuzaci.
Sebia pokytuje velmi širokou nabídku diagnostickách souprav pro elektroforetickou separaci
proteinů krevního séra, moče mozkomíšního moku nebo jiných biologických tekutin.
Diagnostické kity umožňují provedení SPE, UPE, imunofixace séra a moče, izoelktrickou
fokuzaci,separaci a kvantifikaci izoenzymů (ALP,LDH, CK), lipoproteinů, frakcí
hemoglobinu nebo transferinu.
Výrobce Helena Biosciences Europe (Anglie) – analyzátor SAS1-4, SPIFE 4000
Analyzátor SAS 1-4
Tento výrobce nabízí poloautomatické systémy SAS 1 – 4 (dle kapacity přístroje) pro gelovou
elektroforézu na agaróze. Lze provést až 100 elektroforéz bílkovin krevního séra za hodinu.
Přístroj má obdobné uspořádání a poskytuje stejnou nabídku vyšetřovaných parametrů jako
výrobce SEBIA.
SPIFE 4000 analyzátor pro elektroforézu (SPE) a imunofixaci (IFE) bílkovin krevního
séra
Je plně automatizovaný systém pro elektroforézu a imunofixaci séra. Tento automat má
kapacitu 560 SPE a 80 IFE během 8 hodin. Analyzátor provádí vše automaticky včetně
aplikace antiséra (pro IFE), která jsou umístěny na palubě. Po usušení je gel automaticky
přenesen do skanovacího modulu.
Výrobce Interlab (Itálie)-Analyzátor Microge,l analyzátor G26
Je plně automatizovaný elektroforetický systém pro elektroforézu na agaróze. Jeho kapacita je
150 vzorků za hodinu. Systém má 4 držáky na gel, do každého lze umístit 1-2 gely. Na
jednom gelu je možné současně analyzovat 26 vzorků. Obsahuje také modul pro
izoelektrickou fokuzaci. Unikátní dvojitý aplikátor umožňuje současně aplikovat vzorky v 1
nebo 2 řadách na každý gel. Migrační modul má 3 elektrody, což umožní zrcadlové dělení
vzorků, při 2-řadové aplikaci vzorků na gel (obr. č.37).
Obrázek č. 37
Tento systém je plně automatizovaný (včetně pipetování vzorků) pro elektroforézu bílkovin
séra, moče , lipoproteiny, izoenzymy alkalické fosfatázy, kreatinkinázy,
laktátdehydrogenázy.http://www.interlab-srl.com/img08/hr/microgel/3.jpg
3.8.2. Automatizované systémy pro kapilární zónovou elektroforézu
Multikapilární elektroforetické systémy se v současné době stávají významným nástrojem
rychlého, rutinního, vysokokapacitního a zcela automatizovaného měření základních
proteinových frakcí krevního séra. Vysoká pracovní kapacita multikapilárních zařízení pro
64
kapilární zónovou elektroforézu (CZE) komunikujících s laboratorním informačním
systémem představuje možnost zvýšení efektivity měření v režimu průběžného zpracování
vzorků z primárních zkumavek identifikovaných čárovými kódy. Jsou eliminovány možné
chyby způsobené postupem barvení a denzitometrickým hodnocením. Současné možnosti
instrumentace pro kapilární elektroforézu vedou k rychlé a účinné separaci s vysokým
rozlišením.
Výrobce Sebia (Francie) – analyzátor CAPILLARYS
Plně automatizovaný systém pro kapilární elektroforézu CAPILLARYS 2 provádí
elektroforetickou separaci součastně na osmi kapilárách a je schopen analyzovat 80 vzorků za
hodinu. Životnost kapiláry je 3000 vzorků/1 kapiláru, tzn. 24 000 vzorků pro celý systém. Pro
detekci se používá optický UV – VIS detektor s detekcí vlnové délky v závislosti na
stanovovaných parametrech (při elektroforéze sérových proteinů je měřena absorbance při
200 nm). Systém Capillarys 2 umožňuje rozdělení bílkovin krevního séra na 6 frakcí - frakce
betaglobulinů se dělí na beta-1 a beta-2 frakci .
Přístroj je vybaven čtečkou čárového kódu, což umožňuje identifikaci vzorků. Na tomto
systému je možné provádět elektroforézu séra a moče, imunofixaci, dělení frakcí
hemoglobinu a transferinu.
Výrobce Helena Biosciences Europe (Anglie) – analyzátor V8
Analyzátor V8 – plně automatizovaný systém pro kapilární elektroforézu. Přístroj má 8
kapilár, je vybaven UV-VIS detektorem a čtečkou čárového kódu. Spektrum prováděných
vyšetření je stejné jako u výrobce Sebia - elektroforéza séra a moče, imunofixace, dělení
frakcí hemoglobinu a transferinu.
65
4. Chromatografie
Chromatografie je separační metoda, založená na rozdílné afinitě dělených látek ke
stacionární (nepohyblivé) a mobilní (pohyblivé) fázi. Chromatografické metody patří k
nejdůležitějším metodám, které umožňují analyzovat složité směsi biologických molekul nebo
vybrané složky směsi izolovat.
Metoda byla poprvé použita v roce 1901 ruským botanikem Michailem Cvětem pro izolaci
rostliných barviv na sloupci uhličitanu vápenatého (proto se v názvu metody vyskytuje řecké
slovo chromos – barva).
4.1. Princip chromatografie:
Mobilní fáze proudí přes nosič nebo
kolonu, obsahující stacionární fázi.
Během pohybu mobilní fáze dochází
k distribuci komponent směsi mezi
obě fáze: látky s vyšší afinitou ke
stacionární fázi migrují pomaleji než
látky s nižší afinitou ke stacionární
fázi (tyto zůstávají přednostně
v mobilní fázi a migrují rychleji);
jednotlivé složky směsi tedy
procházejí systémem různou
rychlostí.
Obr.38: Princip chromatografie
4.2. Klasifikace chromatografických metod
Chromatografické metody lze je rozdělit podle různých kriterií a níže uvedené způsoby se
mohou při jednom chromatografickém uspořádání různě kombinovat (podrobnější vysvětlení
bude uvedeno u konkrétních příkladů).
4.2.1. Chromatografie podle uspořádání systému
Rozeznáváme chromatografii plošnou (planární) a kolonovou (sloupcovou). Při plošné
chromatografii je stac. fáze zakotvena na papíru (papírová chromatografie) nebo je
rozprostřená na inertní podložce (chromatografie na tenké vrstvě, angl. thin-layer
chromatography, TLC). Při papírové chromatografii je stacionární fází voda nebo polární
rozpouštědlo zakotvené na vláknech papíru, při TLC je stacionární fází tenká vrstva částic
materiálu (silikagel, alumina, celulóza, aj.) rovnoměrně rozložená na skleněné desce, plastu
nebo hliníkové fólii a zpevněná pojivem. Pokud tenká vrstva sestává z částic o malém
průměru (4,5 μm), technika se nazývá HPTLC – high perfomance thin layer chromatography.
Uspořádání plošných technik může být vzestupné nebo sestupné podle směru pohybu mobilní
fáze.
V kolonové chromatografii může být stacionární fází silikagel, polymer; fáze může být
nanesena nebo chemicky navázána na nosné částice (př. uhlovodíkové řetězce zakotvené na
nosných částicích silikagelu); může tvořit náplň kolony nebo být nanesena na její vnitřní
povrch.
66
4.2.2. Chromatografie podle skupenství mobilní fáze
Kolonovou chromatografii dále rozdělit na plynovou (gas chromatography, GC) a
kapalinovou (liquid chromatography, LC). Pokud je stacionární fáze pro LC tvořena
částicemi malého průměru, technika se nazývá HPLC (high perfomance LC).
4.2.3. Chromatografie podle separačního mechanismu
Rozeznáváme chromatografii
1. iontoměničovou
2. rozdělovací
3. adsorpční
4. gelovou permeační
5. afinitní.
Iontoměničová chromatografie (ionexová, angl. ion-exchange) je založena na výměně iontů
elektrostaticky vázaných na nabitém povrchu stacionární fáze a ionty v roztoku. Stacionární
fází je iontoměnič (ionex), tvořený částicemi gelu (syntetické pryskyřice) s navázanými
nabitými funkčními skupinami. Na těchto skupinách je kvůli zachování elektroneutrality
vázán opačně nabitý ion a tento je na začátku analýzy vyměněn za ionty analytů ze vzorku.
Složky dělené směsi jsou pak z kolony eluovány postupně změnou pH a/nebo iontové síly
mobilní fáze.
Ionexy umožňující výměnu kationtů (katexy) mají na
nosných částicích navázány silně kyselé sulfonové
skupiny –SO3
-
H+
nebo slabě kyselé skupiny, např.
karboxy-, karboxymethyl-, sulfomethyl-, sulfoethyl-,
sulfopropyl- nebo fosfo- skupiny. Ionexy umožňující
výměnu aniontů (anexy) mají na povrchu navázány silně
bazické triethylaminoethylové skupiny nebo slabě bazické
aminoethyl-, diethylaminoethyl-, guanidoethyl- apod.
Obr.39: Ionexová chromatografie skupiny.
Ionexová chromatografie má v klinické biochemii široké využití, umožňuje dělit biologické
nízkomolekulární (např. aminokyseliny, nukleotidy) i vysokomolekulární ionty (peptidy,
proteiny, oligonukleotidy, nukleové kyseliny).
Rozdělovací chromatografie je založena na distribuci látek mezi dvě nemísitelné tekutiny,
tedy na rozdílech v rozpustnosti složek vzorku v mobilní a stacionární fázi (platí pro
kapalinovou chromatografii - LLC) nebo na rozdílu hodnot rozpustnosti složek vzorku ve
stacionární fázi (pro plynovou chromatografii - GLC). Jako fáze stacionární slouží kapalina,
která může být naadsorbována nebo chemicky navázána na pevném nosiči (např. na vláknech
papíru u papírové chromatografie nebo na nosných částicích u HPLC) nebo nanesena na
vnitřním povrchu kapilární kolony (u plynové chromatografie). O pohyblivosti jednotlivých
složek dělené směsi rozhoduje rozdělovací koeficient dělených látek mezi oběma fázemi:
K = corg / cvod
K ... rozdělovací koeficient
corg ... koncentrace rozpuštěné látky v organické fázi
cvod ... koncentrace rozpuštěné látky ve vodné fázi
67
Obr.40: Rozdělovací chromatografie
Rozdělovací chromatografie může být plynová (gas-liquid, GLC, zjednodušeně GC) nebo
kapalinová (liquid-liquid, LLC, zjednodušeně LC) podle charakteru mobilní fáze. LLC může
být ve dvou provedeních – LLC s normální fází (polární tekutina je fází stacionární, méně
polární rozpouštědlo nebo směs rozpouštědel je fází mobilní) nebo s obrácenou (reverzní) fází
(stacionární fáze je nepolární, mobilní fáze je polární – častěji používané provedení).
Adsorpční chromatografie: Dělení je založeno na rozdílech v adsorpci a desorpci látek
analyzované směsi na pevný povrch sorbentu elektrostatickými silami, vodíkovými můstky
nebo disperzními silami. Adsorpci popisuje tzv. Langmuirova adsorpční izoterma, vyjadřující
závislost množství analytu ve stacionární fázi na koncentraci v mobilní fázi:
CS = w . z . CM / (1 + w . CM)
w … adsorpční koeficient pro daný analyt
z … počet volných interakčních míst na povrchu
CS, CM… koncentrace analytu v obou fázích
Obr. 41: Adsorpční chromatografie
Obr.42: Grafické znázornění Langmuirovy
izotermy:
Při nízkých koncentracích analytu v mobil. fázi je
závislost CS na CM lineární, při vysokých
koncentracích CM dojde k vysycení interakčních
míst na povrchu sorbentu a závislost se zakřivuje.
Gelová permeační chromatografie umožňuje dělit molekuly podle jejich velikosti a tvaru.
Stacionární fázi tvoří gelové částice kulovitého tvaru, nejčastěji na bázi polysacharidů nebo
polyakrylamidu, s póry pokud možno definovaných rozměrů. V mobilní fázi, která protéká
kolem těchto kuliček, jsou rozpuštěny dělené látky. Molekuly, jejichž průměr je menší než
průměr pórů, difusním pohybem vnikají do vnitřních prostor gelových částic, čímž jsou na
koloně zadržovány déle než velké molekuly, které jsou unášeny proudem mobilní fáze a
vytékají z kolony dříve.
68
Obr. 43, 44: Gelová permeační chromatografie
Afinitní chromatografie využívá specifické interakce molekul. Tyto interakce mohou být
biologické povahy (enzym - substrát, enzym - inhibitor, antigen - protilátka, receptor hormon
apod.) nebo biologickou interakci napodobující (bílkovina - triazinové barvivo,
bílkovina - kovové ionty apod.). Jeden z partnerů (tzv. ligand) je pevně navázán na nosič,
kterým je naplněna chromatografická kolona. V dělené směsi (mobilní fázi) je přítomna řada
molekul, z nichž jen některé mají afinitu k ligandu, naváží se na něj a ostatní složky směsi se
z kolony vymyjí. Po promytí kolony se změní složení mobilní fáze tak, aby se oslabila
interakce ligand – navázaná molekula, ta se takto z kolony uvolní a získá se v relativně čisté
podobě. Bioafinitní chromatografii lze použít k separaci, izolaci a k čistění složek vzorku.
Obr.45: Afinitní chromatografie
Pro dělení bílkovin byla vyvinuta moderní chromatografická kolonová technika
Chromatografie s hydrofobní interakcí (HIC, angl. Hydrophobic Interaction
Chromatography). Jako stacionární fáze slouží speciální nosiče nesoucí hydrofobní skupiny,
na něž se bílkoviny váží, aniž by byly (na rozdíl od chromatografie s obrácenými fázemi)
denaturovány. Při vysoké iontové síle mobilní fáze na začátku chromatografie se bílkoviny
váží na stacionární fázi; postupným snižováním iontové síly (sestupný solný gradient) dochází
k oslabování hydrofobních interakcí bílkovin s nosičem a k jejich postupné eluci z kolony.
4.2.4. Chromatografie podle složení mobilní fáze
Podle složení mobilní fáze rozeznáváme izokratické dělení, kdy mobilní fáze má po celou
dobu dělení konstantní složení, a gradientové dělení s proměnlivým složením mobilní fáze,
kdy se některé složky dělené směsi nejdříve pevně zachytí na stacionární fázi, ostatní složky
69
se mobilní fází vymyjí, poté se náhle nebo postupně (gradientem) mění složení mobilní fáze a
zachycené látky se postupně z kolony vymývají).
4.2.5. Chromatografie podle účelu
Preparativní chromatografie je používána pro přípravu většího množství čistých molekul
(např. příprava proteinů nebo protilátek afinitní chromatografií atd.).
Analytická chromatografie slouží pro určení identity a koncentrace látek ve směsi.
Následující text se týká chromatografie analytické.
4.2.6. Přehled chromatografických technik
planární
papírová rozdělovací
tenkovrstvá TLC
tenkovrstvá rozdělovací (SF kapalina)
tenkovrstvá adsorpční (SF pevná látka)
kolonová
plynová GC
plynová rozdělovací GLC (SF kapalina)
plynová adsorpční GSC (SF pevná látka)
kapalinová LC
kapalinová rozdělovací LLC (SF kapalina)
kapalinová adsorpční LSC (SF pevná látka)
gelová permeační GPC (SF pevná látka)
iontově výměnná IEC (SF pevná látka)
afinitní (a další)
SF…stac.fáze
4.3. Planární chromatografie
Dělení látek probíhá na plošném povrchu stacionární fáze. Vzorky jsou nasazeny na startovací
pozici blízko okraje pruhu papíru nebo TLC destičky ve formě malých kapek nebo tenkých
čar. Papír nebo destička jsou pak umístěny do uzavřené skleněné nádoby (chromatografické
vany) tak, aby spodní konec nosiče byl ponořen do mobilní fáze pod úrovní startovací linie
(papírová chromatografie umožňuje i sestupné uspořádání, kdy je papír v chromatografické
vaně zavěšen ve žlábku s mobilní fází). Mobilní fáze v důsledku kapilárních sil migruje přes
stacionární fázi a unáší s sebou složky směsi v závislosti na jejich afinitě ke stacionární fázi.
Až mobilní fáze doputuje do požadované vzdálenosti, chromatogram je vyjmut z nádoby a
usušen. Skvrny separovaných složek jsou pak podle potřeby různým způsobem vizualizovány,
např. osvícením UV světlem (pokud byla stacionární fáze „obarvena“ fluorescenčním
indikátorem, projeví se UV absorbující látky jako tmavé skvrny na svítícím pozadí),
fluorescenčně nebo nejčastěji přestříkáním chromatogramu vhodným barvotvorným činidlem.
Charakteristikou látky je retenční faktor Rf , jehož hodnota je pro dané uspořádání
experimentu stálá:
Rf = A / B A…vzdálenost start – střed skvrny B…vzdálenost start – čelo rozpouštědla
70
V praxi jsou planární techniky používány většinou jako metody kvalitativní nebo
semikvantitativní s vizuálním hodnocením, skvrny dělených látek se hodnotí srovnáním se
skvrnami standardů chromatografovaných na témže nosiči. U HPTLC připadá v úvahu
kvantitativní hodnocení pomocí denzitometru.
Dokonalejší separace lze dosáhnout pomocí dvourozměrné TLC: Vzorek na TLC desce se
vyvíjí první mobilní fází, po usušení se destička otočí o 90o
a vyvíjí druhou mobilní fází.
Výsledkem je dvourozměrný obrázek rozložení skvrn.
Obr.46, 47: TLC – dělení barviv (http://www.demochem.de/Grafik/TLC2.gif)
Obr. 48: TLC - vysvětlení retenčního faktoru
4.4. Kolonová chromatografie
V GC a LC mobilní fáze s eluovanými látkami opouští kolonu a prochází přes vhodný
detektor, kde produkuje elektronický signál. Signál je graficky zaznamenán jako funkce času,
případně objemu, eluované analyty jsou graficky znázorněny jako série vrcholů (píků).
Takovýto výstup se nazývá chromatogram, data reprezentovaná chromatogramem slouží
k identifikaci a kvantifikaci analytů.
Obr. 49: Vzor chromatogramu Obr. 50: Popis chromatografického vrcholu:
tr…retenční čas, wh…šířka píku v polovině výšky,
h…výška
Kvalitativní charakteristikou analytu je retenční čas tr (doba, za kterou analyt projde
z dávkovače přes kolonu do detektoru), kvantifikace analytu probíhá na základě plochy
případně výšky píku.
71
4.4.1. Termodynamika a kinetika separace
Při postupu vzorku kolonou se jednotlivé složky vzorku (analyty) separují, tj. dospějí do
detektoru v různých retenčních časech. Zároveň se zóny jednotlivých analytů postupně
rozšiřují.
Termodynamika separace se zabývá vlivy, které ovlivňují velikost interakce mezi
stacionární fází a analytem, zadržování (retenci) a zpožďování (retardaci) analytů, rychlost
migrace analytů kolonou, rozdíl v retenčních časech analytů a dělení analytů od sebe
navzájem. Kinetika separace studuje vlivy, které ovlivňují rozmývání zón analytů během
postupu kolonou, tj. šířky píků na chromatogramu. Termodynamika a kinetika spolu úzce
souvisí a obě určují, jak dokonale budou zóny sousedních analytů odděleny.
Základní pojmy a vztahy:
Vs (ml)…objem stacionární fáze kolony
Vm (ml)…objem mobilní fáze v koloně
L (cm)…délka kolony
Fm (ml/min)…objemový průtok mobilní fáze
u (cm/min)…lineární rychlost mobilní fáze při průtoku kolonou; u = L / tM
VR,i (ml)…retenční objem i-tého analytu (objem mobilní fáze, který musí projít kolonou, aby
se příslušný analyt dostal od počátku ke konci separační kolony); VR,i = Fm . tR,i
tR,i (min)…retenční čas i-tého analytu (celkový čas, který příslušný analyt stráví v separační
koloně)
VM (ml)…mrtvý objem kolony (objem mobilní fáze, který musí projít kolonou, aby se
nezadržovaný analyt dostal od počátku ke konci separační kolony)
tM (ml)…mrtvý čas kolony (retenční čas analytu, který není v koloně zadržován, tj. pohybuje
se stejnou rychlostí jako mobilní fáze)
V’R,i (ml)…redukovaný retenční objem i-tého analytu; V’R,i = VR,i – VM
t’R,i (min)…redukovaný retenční čas i-tého analytu (čas, který příslušný analyt stráví ve
stacionární fázi); t’R,i = tR,i - tM
Pozn.: Všechny analyty stráví v mobilní fázi stejný čas – mrtvý čas kolony
Distribuční (rozdělovací) konstanta KD,i vyjadřuje poměr koncentrací složky ve dvou
fázích:
 
 
 
  s
m
mi
si
mi
si
iD,
V
V
n
n
c
c
K 
(ci)s, (ci)m...koncentrace i-tého analytu ve stacionární a mobilní fázi ( c = n / V)
(ni)s, (ni)m…látkové množství i-tého analytu ve stacionární a mobilní fázi
Kapacitní faktor (retenční faktor, kapacitní poměr) ki vyjadřuje poměr látkového
množství složky ve stacionární a mobilní fázi:
 
  m
s
iD,
mi
si
i
V
V
K
n
n
k 
Kapacitní faktor ki lze zjistit přímo z chromatogramu jako poměr doby, kterou stráví složka
vzorku ve stacionární fázi, k době, kterou stráví v mobilní fázi (kolikrát déle je složka vzorku
zadržována stacionární fází, než by byla doba jejího transportu kolonou rychlostí toku mobilní
fáze):
M
iR,
M
MiR,
i
t
t´
t
t-t
k 
M
R,i
M
MR,i
i
V
V´
V
V-V
k 
72
Distribuční (rozdělovací) konstanta a kapacitní faktor (kapacitní poměr) jsou pojmy
termodynamické a charakterizují selektivitu kolony, tj. jak se analyty na koloně zadržují a
zpožďují.
Základní rovnice chromatografie (platí hlavně pro chromatografii rozdělovací):
VR.i = VM + KD,i . VS siD,iR, VKV´ 
m
siD,m
m
iR,
iR,
F
VKV
F
V
t


m
siD,
m
iR,
iR,
F
VK
F
V´
t´


Obr.51: Popis chromatografického píku
tr,j…retenční čas j-tého analytu
tM…mrtvý čas kolony (retenční čas nezadržovaného
analytu)
w1/2,j…šířka píku j-tého analytu v polovině výšky
wj…šířka píku j-tého analytu při základně (vytyčená oběma
tangentami v inflexních bodech)
Pozn. Šířka píku se udává v délkových nebo časových
jednotkách
Zóny dělených analytů se během postupu kolonou rozšiřují v důsledku difůze. Účinnost
kolony charakterizuje, jak moc se zóny separovaných látek rozšiřují. Mírou účinnosti kolony
je
a) počet teoretických pater dané kolony - n
2
j
jR,
w
t
16n








  wj…šířka píku analytu při základně
b) výškový ekvivalent teoretického patra – H (mm)
2
jR,
j
t
w
16
L
n
L
H








  L…délka kolony
Výškový ekvivalent teoretického patra (H) závisí na lineární rychlosti mobilní fáze (u).
Závislost vyjadřuje Van Deemterova rovnice:
H = A + B / u + C . u
A…vířivá difůze, B…podélná molekulární difůze, C…odpor proti přenosu hmoty ve stac. a
mobilní fázi
Obr.52: Grafické znázornění Van Deemterovy rovnice Obr.53: Vysvětlení difůze
73
Pozn. k obrázku 53:
1. Vířivá difůze – efekt toho, že různé molekuly urazí při pohybu kolonou různé vzdálenosti.
Vířivá difůze (tj. člen A ve Van Deemterově rovnici) je úměrná velikosti částic stac.fáze,
projevuje se hlavně u HPLC
2. Podélná molekulární difůze - molekuly putují z místa o vyšší koncentraci do místa s nižší
koncentrací
3. Odpor proti přenosu hmoty ve stac. fázi (různé molekuly difundují různě hluboko do
stacionární fáze) – závisí na typu stac.fáze, projevuje se hlavně u plynové chromatografie
4. Odpor proti přenosu hmoty v mobilní fázi (rychlostní profil mobilní fáze uvnitř kanálku je
parabolický)
Cílem je dosáhnout minimální hodnoty H, tedy maximálního počtu teoretických pater dané
kolony a tím její maximální účinnosti. Minimum Deemterovy křivky tedy odpovídá optimální
průtokové rychlosti, při které daná kolona vykazuje největší účinnost a tedy minimálně
rozšiřuje zóny analytů.
Obr.54: Optimalizace rozlišení látek A, B (přejato ze Zýka a
kol.:
Analytická příručka 1.díl, 3.vydání, Praha 1979, SNTL)
a) Špatné rozlišení
b) Dobré rozlišení změnou termodynamických faktorů (př. změna
mobilní fáze)
c) Zlepšení účinnosti kolony oproti b) změnou kinetických faktorů
(př. použití delší kolony tj. zvýšení počtu teoretických pater, nebo
kolonu s menším průměrem částic apod.)
d) Téměř stejné rozlišení jako u c), ale v kratší době (zvýšení
průtokové rychlosti mobilní fáze)
Rozlišení R je mírou chromatografické separace. Pro dobré rozdělení dvou sousedních
analytů (pro minimalizaci jejich překryvu) je nutné, aby analyty měly dostatečně rozdílné
retenční časy a aby byly jejich zóny dostatečně ůzké.
 
ji
R
ji
jR,iR,
ji,
ww
Δt2
ww
tt2
R






Ri,j…rozlišení i-tého a j-tého analytu
V případě hodnoty rozlišení menší než 0,8 je separace nedostatečná, zatímco dobré separace
až na základní linii je dosaženo při hodnotách rozlišení nad 1,25.
Obr.55: Rozlišení píků
74
Rozlišení lze vyjádřit i pomocí termodynamických (αj,i , kj) a kinetických (n) parametrů:
j
j
ij,
ij,
ji,
k1
k
α
1α
4
n
R


 
Ri,j…rozlišení dvou sousedních analytů, n…počet teoretických pater kolony,
kj…kapacitní (retenční) faktor j-tého analytu, αj,i…separační faktor: αj,i = kj / ki = KD,j / KD,i
Počet teoretických pater n lze ovlivnit změnou rychlosti mobilní fáze, délkou kolony nebo
velikostí částic náplně. Separační faktor α lze ovlivnit změnou mobilní a/nebo stac. fáze.
Kapacitní (retenční) faktor ovlivní změna množství stacionární fáze, teplota nebo změna
mobilní a/nebo stacionární fáze.
4.4.2. Plynová chromatografie, GC
Mobilní fází unášející směs těkavých analytů přes stacionární fázi v koloně je tzv. nosný plyn
(nejčastěji inertní plyn - dusík, helium, argon). Separace u GC je založena na rozdílech tlaku
par analytů a interakcích se stacionární fází; těkavější analyty se tedy pohybují kolonou
rychleji než analyty méně těkavé a navíc analyty interagující se stacionární fází procházejí
kolonou pomaleji než analyty se slabší interakcí. U GSC chromatografie je touto interakcí
adsorpce analytů na pevný povrch náplně kolony. GLC používá jako stacionární fázi
netěkavou kapalinu zakotvenou na částicích náplně nebo přímo na vnitřním povrchu kapilární
kolony a separace probíhá na základě rozdělení mezi plynnou mobilní fázi a kapalnou
stacionární fázi.
Nosný plyn unáší separované analyty z kolony do detektoru. Analyty jsou identifikovány
podle retenčního času (v případě GC s hmotnostní spektrometrií i podle hmotnostního
spektra), kvantifikace se provádí na základě velikosti chromatografického píku (plochy,
případně výšky), která je úměrná množství detegovaného analytu.
4.4.2.1. Plynový chromatograf
Plynový chromatograf se skládá z několika základních částí - chromatografické kolony pro
separaci analytů, zdroje mobilní fáze a zařízení pro kontrolu průtoku nosného plynu
systémem, dávkovače pro nanesení analytu (nebo chemicky derivatizovaného analytu) na
kolonu, termostatu (pece) pro regulaci teploty kolony, on-line detektoru pro detekci
separovaných analytů vycházejících z kolony a PC pro kontrolu systému a vyhodnocení dat.
Obr.56: Plynový chromatograf Obr.57: GC kapilární kolona
Chromatografická kolona
Pro GC se používají dva hlavní typy kolon - náplňové a kapilární. Starším typem jsou
náplňové kolony. Mají podobu trubice naplněné nosnými částicemi, které jsou samy o sobě
stacionární fází (GSC - modifikovaný silikagel, aktivní uhlí, alumina, molekulové síto) nebo
75
jsou stacionární fází potaženy (GLC). Vnitřní průměr náplňových kolon je 1 - 4 mm, délka 1
m a více, jsou vyrobeny ze skla nebo nerez oceli. Užší kolony jsou účinnější, mají však menší
kapacitu pro vzorek. Účinnost kolony se zvyšuje i s její délkou; delší kolony však vyžadují
zvýšené tlaky nosného plynu. V dnešní době je používání náplňových kolon téměř minulostí a
přednost dostávají kolony kapilární.
Kapilární kolony známé i jako WCOT (wall-coated open tubular column) jsou připraveny
potažením vnitřního povrchu kapiláry z křemenného skla tenkým filmem stacionární fáze.
Kapiláry čistě z křemenného skla by byly velmi křehké, proto jsou na povrchu potaženy
polyimidem, což jim dodává pevnost a pružnost (je možné je svinout do cívky). Vnitřní
průměr kapilárních kolon je obvykle 0,1 - 0,5 mm, délka 10 - 150 m. Kapilární kolony jsou
velmi účinné, mají však malou kapacitu vzorku. Dostupné jsou i GC mikrokolony na bázi
silikonového čipu (např. firma Agilent). Existuje velký výběr stacionárních fází pro GLC methylsilikonové
polymery, substituované silikonové polymery, silikonové polyestery apod.
Tyto materiály jsou naneseny nebo chemicky navázány na vnitřním povrchu kapilární kolony.
Zdroj nosného plynu a systém kontroly průtoku
Jako nosný plyn může sloužit např. helium, argon, dusík, vodík. Volba nosného plynu závisí
na typu kolony a detektoru; např. pro kapilární kolony ve spojení s hmotnostním detektorem
se dává přednost heliu, pro náplňové kolony a starší typy detektorů (plamenově ionizační,
termovodivostní atd.) se často používal dusík. Nosný plyn musí být velmi čistý a suchý,
protože nečistoty poškozují kolonu a snižují citlivost některých detektorů. Z tohoto důvodu se
za zdroj plynu umísťují trubice plněné molekulovým sítem pro odstranění vlhkosti,
uhlovodíků a kyslíku z nosného plynu.
Pro získání reprodukovatelných retenčních časů je nutná řízená rychlost průtoku nosného
plynu. Regulace průtoku plynu z tlakové nádoby se provádí různými způsoby, od
jednoduchých zařízení typu jehlového ventilu u starších přístrojů po programovatelné
elektronické regulační systémy. Analýzy mohou probíhat za konstantního průtoku nebo
konstantního tlaku. Rychlost průtoku nosného plynu závisí na typu kolony (náplňové kolony
využívají průtok 10 - 60 ml/min, kapilární kolony pouze 1 - 2 ml/min s velkými nároky na
stabilitu)
Dávkovač
Úkolem dávkovacího zařízení je vnést alikvot vzorku (objem řádově v µl) do kolony tak, aby
byl co nejméně narušen průtok nosného plynu kolonou. V praxi jsou vzorky rozpuštěny v
organickém rozpouštědle a dávkovány injekční jehlou přes tzv. septum (těsnění, které slouží
jako interface mezi dávkovačem a chromatografickým systémem). Injekční jehla propíchne
septum a pronikne do vyhřívaného prostoru, kde jsou těkavé analyty i rozpouštědlo ihned
převedeny do plynné fáze a vneseny do kolony nosným plynem.
Pro kapilární kolony, které mají na rozdíl od náplňových kolon nízkou kapacitu pro vzorek, se
používá split - splitless technika dávkování vzorku na kolonu. Při split módu vstupuje do
kolony pouze malá část zplyněného vzorku, zatímco při splitless módu vstupuje do kolony
většina vzorku. Split mód se používá pro vzorky, které obsahují relativně vysoké koncentrace
sledovaných analytů.
Kontrola teploty
Náplňové i kapilární kolony vyžadují přesnou regulaci teploty; té se dosahuje umístěním
kolony do pece s odporovým vyhříváním. Kolona může mít během celé analýzy konstantní
nastavenou teplotu, nebo teplota může programovatelně stoupat v závislosti na čase. Pro
většinu klinických aplikací se používá druhý způsob, což výrazně zkracuje dobu analýzy.
76
Detektory
Pro GC je možné použít řadu detektorů, od univerzálních, které detegují většinu analytů, po
detektory selektivní, často se kombinují dva a více detektorů.
Plamenově ionizační detektor (flame ionization
detector, FID) je univerzálním detektorem pro GC.
Efluent z kolony je smísen s vodíkem a vzduchem a
eluované analyty jsou spáleny v plameni. V plameni
dochází k ionizaci a vzniklé ionty zvyšují vodivost
plamene. Velikost produkovaného signálu je úměrná
množství organické látky procházející detektorem.
Obr.58: Schema plamenově ionizačního detektoru
NPD (nitrogen – phosphorus detector) je modifikací FID, kdy je nad plamen umístěna
elektricky vyhřívaná kulička soli alkalického kovu (Rb nebo Cs). Přítomnost iontů
alkalického kovu v plameni zvyšuje signál pro analyty obsahující dusík a fosfor.
Fotoionizační detektor (photoionization detector, PID) je rovněž modifikací FID, kdy
ionizace je namísto plamene dosahováno intenzivním UV zářením. Detektor má nízké meze
detekce pro UV absorbující látky.
Termovodivostní detektor (thermal conductivity detector, TCD) je založen na tom, že
v přítomnosti analytu v nosném plynu se zvyšuje tepelná vodivost plynu. Jedná se o
univerzální jednoduchý detektor, ovšem s horší citlivostí.
Detektor elektronového záchytu (electron capture detector, ECD) je selektivní detektor pro
organické sloučeniny obsahující elektronegativní skupiny. Dochází v něm ke snížení ionizace
nosného plynu (radioaktivním β-zářičem) v důsledku vychytávání elektronů z β-zářiče
elekronegativními skupinami.
Před uvedenými detektory se v současné době pro klinické analýzy dává přednost detekci
hmotnostní spektrometrií, které bude věnována následující kapitola.
Počítač
Celý chromatografický proces (složení a průtok mobilní fáze, tlak, teplota jednotlivých
kompartmentů, dávkování) je řízen počítačem, který zároveň monitoruje signál generovaný
detektorem, ukládá data, vyhodnocuje koncentrace analytů na základě plochy (výšky)
odpovídajících píků na chromatogramu, případně vytváří reporty chromatografických analýz.
Pozn.: Mezi největší výrobce přístrojů pro GC patří např. Agilent Technologies, Thermo
Fischer, Perkin-Elmer, Shimadzu, Analytical Science, Sigma-Aldrich Supelco, SRI
Instruments, DANI Instrument a další.
4.4.2.2. Příprava vzorků pro GC analýzu
Před GC analýzou je často nutné sledované analyty ze vzorku biologického materiálu
vyextrahovat do organického rozpouštědla a poté chemicky derivatizovat - mnoho klinicky
významných látek je totiž netěkavých a chemická modifikace nebo derivatizace zvýší jejich
těkavost pro GC analýzu. Zvýšení jejich těkavosti lze dosáhnout acylací, silylací, esterifikací
nebo oximací.
77
4.4.3. Kapalinová chromatografie
Separace při LC je založena na rozdělení látek mezi kapalnou mobilní fázi a fázi stacionární.
Pokud jsou jako nosič použity částice malého průměru (5 µm), technika se nazývá high
perfomance liquid chromatography (HPLC). Protože tato technika vyžaduje relativně vysoké
tlaky v systému kvůli zajištění dostatečného průtoku mobilní fáze kolonou naplněnou malými
částicemi, někdy se o HPLC mluví jako o vysokotlaké chromatografii (high pressure liquid
chromatography). HPLC je v klinické laboratoři nejrozšířenější formou LC.
4.4.3.1. Kapalinový chromatograf
Kapalinový chromatograf obsahuje několik základních částí: kolonu pro separaci analytů,
zásobníky rozpouštědel (mobilní fáze), čerpadla pro zajištění průtoku mobilní fáze systémem,
dávkovač pro nanesení vzorku na kolonu, on-line detektor pro detekci separovaných analytů
eluovaných z kolony, PC pro kontrolu systému, sběr a vyhodnocení dat.
Obr.59: Schema kapalinového chromatografu
Obr.60 : HPLC
Na rozdíl od přístrojů pro GC mohou být HPLC přístroje nejen kompletně integrované, ale i
modulární (viz obr. 60), kdy uživatel může kombinovat jednotlivé moduly, a to i od různých
výrobců, pokud jsou kompatibilní a je možné je ovládat softwarově jako jednotný systém.
78
Chromatografické kolony:
Pro HPLC se používají náplňové i kapilární kolony.
Moderní náplňové kolony se vyrábějí v různých rozměrech, s tendencí ke kolonám s malým
vnitřním průměrem a malým vnitřním objemem, protože tyto mají vyšší účinnost, nižší limit
detekce a vyžadují malé objemy mobilní fáze. Analytické HPLC kolony pro klinické aplikace
jsou většinou trubice z nerez oceli s vnitřním průměrem 0,1 - 5 mm o délce 50 - 250 mm,
vrstva náplně (částice kulovitého tvaru o různé velikosti a pórovitosti) je na obou koncích
udržována vloženou fritou. Vyrábí se i tzv. nanobore kolony s vnitřními průměry 25 - 100 µm
nebo open-tubular kolony s průměry pod 25 µm, dostupné jsou i analytické HPLC čipy.
Částice náplně mají průměr 1,8 - 10 µm; obecně čím menší jsou částice náplně, tím větší je
účinnost kolony (ale tím větší je i odpor vrstvy náplně proti pohybu mobilní fáze - zpětný tlak
LC kolony je nepřímo úměrný druhé mocnině průměru částic náplně). Pro dosažení
dostatečného průtoku mobilní fáze takovou kolonou jsou třeba relativně vysoké tlaky v
systému, proto se používají spíše kratší kolony, u nichž se nedosahuje kritických hodnot
zpětných tlaků.
Částicových náplní LC kolon je několik typů: náplně s navázanou fází, polymerní, chirální
nebo tzv. restricted access.
U náplní s navázanou fází (bonded phase packing) je stacionární fáze chemicky navázána na
povrch částic silikagelu. Tento typ náplně je dostupný pro IEC a pro HPLC s normální i
obrácenou (reverzní) fází. Pro HPLC s normální fází jsou funkční skupiny stacionární fáze
relativně polární (např. silanol-, amino- nebo nitrilové skupiny), mobilní fáze je nepolární
rozpouštědlo (typicky hexan). Častěji používaná HPLC s reverzní fází vyžaduje nepolární
stacionární fázi. Nejpoužívanější je tzv. C18 fáze (oktadecylsilanové skupiny navázané na
částicích silikagelu), mobilní fází jsou často vodné pufry ve směsi s polárním organickým
rozpouštědlem (metanol, acetonitril). Náplně na bázi silikagelu mají nižší pH odolnost (pH 2
– 8).
Dalším typem náplní jsou polymerní náplně, kdy jsou na povrchu částic grafitizovaného
uhlíku nebo smíšeného kopolymeru (polystyren - divinylbenzen) navázány skupiny C4, C8,
C18 (uhlovodíkové zbytky) nebo ionexové skupiny. Chromatografické charakteristiky
polymerních náplní jsou zcela srovnatelné s náplněmi na bázi silikagelu, jsou však odolnější
v širším rozmezí pH (pH 2 - 13).
Chirální náplně se používají pro separaci enantiomerů (dvojic optických izomerů se
zrcadlovým uspořádáním molekuly), např. enantiomerů léků.
Restricted-access náplně (s omezeným přístupem) umožňují přímou analýzu biologických
směsí s vysokým obsahem proteinů, což výrazně usnadňuje přípravu vzorku. Vnější povrch
nosných částic náplní je opatřen hydrofilní vrstvou, kterou mohou pronikat menší molekuly
(např. léky) do pórů částice. Póry jsou potaženy hydrofobní stacionární fází, na které probíhá
vlastní dělení. Velké molekuly proteinů neprocházejí do vnitřních pórů a obtékají částice
náplně.
Kromě kolon s částicovou náplní existují i tzv. monolitické kolony. Taková kolona je zcela
vyplněna polymerem o definované pórovitosti organického původu (styren - divinylbenzen,
metakrylát aj.), nebo anorganického původu (na bázi silikagelu). Materiál kolony je zpravidla
vytvořen polymerací přímo v trubici (monomer + porogenní složka + iniciátor polymerace),
obsahuje dva typy pórů - mikropóry pro zajištění permeability kolony a větší póry tvořící
velký povrch pro interakci s analyty. Monolitické kolony mají vysokou účinnost a nízké
zpětné tlaky.
Kapilární kolony pro LC se připravují jako kapiláry z křemičitého skla s vnějším povrchem
potaženým polyimidem (pro dostatečnou pevnost a pružnost kolony) a tenkým filmem
79
stacionární fáze na jejich vnitřním povrchu. Jejich rozměry se pohybují mezi 0,1 - 1 mm
vnitřního průměru a 10 - 50 cm délky.
K ochraně kolony před ireverzibilní adsorpcí proteinů ze vzorku, která snižuje rozlišení a
životnost kolony, se mezi dávkovač a kolonu vřazuje předkolona. Předkolona je naplněna
stejnou nebo podobnou stacionární fází jako analytická kolona, váže na sebe proteiny a tak
prodlužuje životnost analytické kolony. Po určitém počtu analýz se předkolona vyměňuje.
Zásobníky s mobilními fází
Jako zásobník mobilní fáze slouží v nejjednodušší formě skleněné lahve s přívodními
hadičkami k čerpadlům, opatřené filtry pro odstranění nečistot.
Mobilní fáze musí být připraveny z čistých rozpouštědel určených pro chromatografii (HPLC
grade) a před použitím musí být přefiltrovány přes membránový filtr pro odstranění
případných pevných částic. Mobilní fáze musí být také zbaveny rozpuštěných plynů, neboť
tyto by se uvolňovaly při přechodu mobilní fáze z natlakované kolony do prostředí
s normálním tlakem za kolonou a působily nestabilní signál detektoru. Za zásobníky fází
v přístrojích jsou za tímto účelem vřazeny vakuové degassery (odplyňovače).
Čerpadla
Čerpadla zajišťují reprodukovatelný konstantní a bezpulzní průtok mobilní fáze
chromatografickým systémem. Pro dosažení optimálních průtoků (0,5 – 2 ml/min pro běžné
náplňové kolony) je nutno v systému vyvinout vysoké tlaky 200 – 250 bar (1 bar = 105
Pa =
1,02 atm = 14,5 psi), protože kolony s velikostí částic 10 μm a menší kladou velký odpor.
Pro malé průtoky lze použít tzv. lineární dávkovač – bezpulzní čerpadlo, které pracuje
podobně jako velká rovnoměrně vyprazdňovaná injekční stříkačka. Nejčastěji se však
používají pulzní pístová dvojúčinná (reciproká) čerpadla, jejichž činnost je fázově posunutá
pro minimalizaci pulzů. Příslušenstvím těchto pulzních čerpadel je tlumič pulzů na principu
svinuté odporové kapiláry nebo jsou pulzy redukovány změnou rychlosti pohybu pístů
čerpadla v počáteční a závěrečné fázi sání a výtlaku.
HPLC čerpadla mohou pracovat v módu izokratickém (složení mobilní fáze zůstává
konstantní během celé analýzy) nebo gradientovém (složení mobilní fáze se s časem mění),
kdy jsou až čtyři složky mobilní fáze programovatelně směšovány pomocí gradientového
dávkovacího ventilu.
Dávkovací zařízení
Nejčastěji používaným dávkovacím zařízením je šesticestný ventil s vyměnitelnou smyčkou,
která může mít objem od desítek nanolitrů po mililitry. V plnící pozici (poloha A) se nasaje
vzorek ze vzorkové nádobky (tzv. vialky) dávkovací injekční stříkačkou do smyčky, otočením
ventilu do polohy B je obsah smyčky vnesen do proudu mobilní fáze. Dávkovací ventil je
přesný, pracuje při vysokých tlacích a jeho činnost je možné programovat při použití
v samplerech automatických systémů.
Používají se i dávkovače s děličem (obdoba splitovacího zařízení v GC) nebo dávkovače
s možností smísení vzorku s derivatizačním činidlem před nadávkováním na kolonu.
80
Obr. 61, 62: Šesticestný dávkovací ventil
Detektory
Pro HPLC se používají detektory pracující na různých principech. Každý typ detektoru (s
výjimkou hmotnostního, jehož princip bude uveden v kapitole o hmotnostní spektrometrii)
obsahuje průtokovou celu, kterou protéká eluát z kolony. Separované analyty obsažené
v eluátu jsou zde detegovány a generovaný elektronický signál je zaznamenán ve formě
chromatogramu.
Fotometry a spektrofotometry měří absorbanci UV a VIS zářeni látkami vycházejícími
z kolony. Jsou široce využívané, protože většina organických látek vykazuje absorpci UV
záření (některé absorbují dokonce i ve viditelné oblasti).
Detektory s fixní vlnovou délkou využívají intenzivní linii rtuťové výbojky o vlnové délce
254 nm, tyto detektory jsou velmi citlivé. U fotometrů se dvěma vlnovými délkami (254 nm a
280 nm) se mezi Hg výbojku a průtokovou komoru vkládá fosforová destička, která po
excitaci světlem 254 nm emituje fluorescenční záření s vlnovou délkou 280 nm jako druhý
zdroj světla.
Detektory s variabilní vlnovou délkou mohou měřit při zvolené vlnové délce z rozmezí již
od 190 nm do 400 nm (případně 600 nm). V krátkovlnné oblasti spektra absorbuje i mnoho
rozpouštědel, které tedy nelze použít jako mobilní fázi. V HPLC s reverzní fází často
používaná rozpouštědla acetonitril a metanol však absorbují při 200 nm pouze minimálně.
Detektory diodového pole jsou schopné měřit v celé oblasti 190 – 600 nm. U tohoto typu
detektoru prochází průtokovou kyvetou polychromatické světlo. Prošlé světlo je za kyvetou
rozděleno difrakční mřížkou a nasměrováno na diodové pole, které registruje intenzitu světla
všech vlnových délek (každá dioda registruje jednu vlnovou délku.
Fluorometry se používají pro detekci fluorescenčních látek. Pro vznik fluorescenčních
sloučenin je často nutná před- nebo postkolonová derivatizace stanovovaných analytů (např.
předkolonová derivatizace aminokyselin a jiných primárních aminů). HPLC fluorometry jsou
přístroje poměrně jednoduché, ale citlivé a selektivní. Jako zdroje excitačního záření se
využívají deuteriové nebo xenonové lampy nebo lasery.
Elektrochemické detektory: V amperometrických el.-chem. detektorech prochází
elektroaktivní analyt průtokovou celou, kde je oxidován nebo redukován na povrchu
elektrody s konstantním potenciálem a je zaznamenám vzniklý elektrický proud. Příkladem
využití je analýza katecholaminů v moči. Podobně pracují coulometrické detektory (měření
elektrického náboje), v klinické laboratoři požívané pro stanovení metanefrinů,
vanilmandlové kyseliny, homovanilové kyseliny nebo 5-hydroxy-indoloctové kyseliny
v moči.
Refraktometrický detektor měří změny indexu lomu eluátu v závislosti na koncentraci
analytu.
81
Počítač
Podobně jako u GC je celá analýza, sběr a zpracování dat řízeny počítačem.
K největším světovým výrobcům HPLC systémů patří např. firmy Waters, Agilent
Technologies, Thermo, PerkinElmer, Shimadzu, Varian, Amersham Pharmacia, Dionex,
Jasco, Gilson, Hitachi, BioRad a další.
Současným trendem je nejen zmenšování vnitřního průměru a délky kolon nebo zmenšování
velikosti částic náplně, ale i využívání ultravysokých tlaků v chromatografii (100 MPa).
Technika se nazývá UPLC nebo UHPLC (ultra high-perfomance liquid chromatography), má
vyšší separační účinnost než klasická HPLC. UHPLC využívá chromatografické kolony s
částicemi <2µm v přístrojích schopných pracovat s vysokými tlaky, což umožňuje práci s
širokým rozsahem průtoků a významně zkracuje dobu analýzy. Přístroje pro UPLC dodává
např. firma Waters, Thermo, Perkin-Elmer, Dionex, BioRad a další.
4.4.3.2. Příprava vzorků pro HPLC analýzu
Příprava vzorku je důležitým krokem, který předchází chromatografické analýze a zahrnuje
např. zakoncentrování analytu, jeho purifikaci nebo derivatizaci.
Zakoncentrování analytů a čištění vzorku se provádí extrakčními technikami. Často používaná
je technika extrakce na pevné fázi (solid phase extraction, SPE), která přípravu vzorku
podstatně zjednodušuje a je možné ji automatizovat.
Derivatizace analytů se provádí z důvodů umožnění nebo usnadnění jejich detekce. Například
u analyzátorů aminokyselin jsou eluované aminokyseliny postkolonově derivatizovány
ninhydrinem a výsledné barevné sloučeniny jsou detegovány fotometricky. Jiným příkladem
je předkolonová derivatizace aminokyselin a jiných primárních aminů za vzniku
fluorescenčních sloučenin a následná detekce fluorometrem.
4.4.4. Kvantitativní analýza
Pro kvantitativní chromatografickou analýzu se používá kalibrační technika s vnějším nebo
vnitřním standardem.
Při externí kalibraci se provádí analýza referenčních vzorků se známým obsahem analytů. Pro
každý analyt se sestaví kalibrační závislost jako velikost ploch píků (výšky píků) v závislosti
na koncentraci analytu a tato závislost se používá pro vyhodnocení koncentrací analytů
v reálných vzorcích.
Při vnitřní kalibraci se do referenčních vzorků se známým obsahem analytů přidává
konstantní množství vnitřního standardu. Vnitřní standard je sloučenina, která má podobné
vlastnosti jako stanovované analyty, ale nevyskytuje se v reálných vzorcích (např. syntetická
aminokyselina norleucin nebo norvalin pro stanovení aminokyselin v biologickém materiálu).
Do kalibrační křivky se pak vynáší poměr plochy (výšky) píku analytu a plochy (výšky) píku
vnitřního standardu v závislosti na koncentraci analytu. Do reálných vzorků se přidává interní
standard ve stejném množství jako byl přidán do referenčních roztoků a koncentrace analytu
se vyhodnocuje na základě poměru plochy (výšky) odpovídajícího píku a píku vnitřního
standardu.
4.5. Příklady praktických aplikací chromatografických technik v klinické biochemii
V klinické biochemii mají chromatografické techniky velmi široké využití, uplatňují se hlavně
TLC, HPLC a GC; obě poslední zvláště ve spojení s hmotnostní spektrometrií (MS).
82
4.5.1. Planární techniky
Obr. 63 ukazuje využití jednoduché, dnes již málo používané techniky papírové
chromatografie pro screening aminokyselin v moči: Analýza je provedena na
chromatografickém papíře Whatman, skvrny aminokyselin se po sestupném vyvíjení
chromatogramu a usušení detegují ninhydrinem a srovnávají se standardem (1.dráha vlevo).
Tenkovrstvá chromatografie se používá pro kvalitativní, případně semikvantitativní
analýzu. Přestože metoda TLC se dá ve spojení s denzitometrem použít i ke kvantitativní
analýze, je přesnější toto provést metodou HPLC, GC.
Tenkovrstvá chromatografie jako velmi flexibilní levná separační matoda, umožňující
souběžně analyzovat více vzorků bez náročné přípravy a bez potřeby sofistikovaných
nástrojů, nachází velmi časté využití v toxikologii pro cílené průkazy nejrůznějších nox a pro
orientační screening léků a drog. Konfirmace pozitivních výsledků z toxikologického
screeningu se provádí dalšími chromatografickými metodami (př. HPLC, často ve spojení
s hmotnostní spektrometrií).
Obr. 64 prezentuje jiné využití TLC – analýzu mono- a disacharidů v močových vzorcích na
tenké vrstvě silikagelu pro účely diagnostiky dědičných metabolických poruch. Skvrny
odpovídající jednotlivým mono- a disacharidům jsou po vyvinutí chromatogramu a usušení
vizualizovány barvotvorným činidlem a srovnávány se standardem na krajních drahách
chromatogramu (na 5. a 8. dráze zleva pozitivní výsledek pro galaktózu).
Obr.63: Papírová chromatografie aminokyselin
Obr.64: TLC analýza sacharidů
v moči na silikagelové vrstvě
(komerčně dodávané - Merck)
4.5.2. Ionexová chromatografie
IEC se uplatňuje např. při analýze aminokyselin. Vzorek (deproteinovaná plazma) představuje
směs aminokyselin, které jsou svými vlastnostmi navzájem velmi podobné. Jsou vneseny na
chromatografickou kolonu s katexem ve formě kationtů (při nízkém pH) pak postupně
eluovány z kolony pufry o zvyšující se eluční síle (rostoucí pH a iontová síla). Eluát z kolony
se mísí s roztokem ninhydrinu (postkolonová derivatizace), který dává s primárními
aminokyselinami modré zbarvení, se sekundárními aminokyselinami žluté zbarvení. Signál
fotometrického detektoru (570 a 440 nm) se zaznamenává jako chromatogram (Obr.č. 65),
jehož vyhodnocením se zjistí koncentrace jednotlivých aminokyselin ve vzorku na základě
83
vyhodnocení ploch píků. Kvantitativní vyhodnocení se provádí pomocí vnitřního standardu
(syntetické aminokyseliny norleucinu), který se přidává do standardní kalibrační směsi
aminokyselin při kalibraci přístroje i do každého analyzovaného vzorku.
Obr.65: IEC aminokyselin na automatickém analyzátoru Biochrom (PerkinElmer)
4.5.3. HPLC
HPLC má z chromatografických metod v klinické biochemii nejširší uplatnění, lze ji aplikovat
na široké spektrum analytů v závislosti na způsobu detekce – sacharidy, karboxylové
kyseliny, aminokyseliny, lipidy, steroidy, katecholaminy, léky, drogy, homocystein, pteriny,
atd.
HPLC se uplatňuje jako standardní metoda v toxikologii, hlavně v kombinaci s hmotnostní
spektrometrií. (Praktické aplikace LC/MS nebo LC/MS/MS budou diskutovány v další
kapitole).
Na chromatografickou kolonu často nelze přímo dávkovat biologický materiál a je tedy nutné
vzorek nejprve upravit. V klinické biochemii se používají hlavně techniky extrakční a
ultrafiltrační.
Ultrafiltrace je metoda úpravy roztoků pomocí polopropustných membrán. Hustota
membrány limituje velikost molekul, které jsou separovány. Technika je vhodná pro
deproteinaci vzorků.
Kapalinovou extrakcí analytů do organického rozpouštědla nemísitelného s vodou lze
vzorek přečistit i zakoncentrovat: organický extrakt se zpravidla odpařuje v proudu inertního
plynu (dusíku) a odparek se rozpustí před aplikací na chromatografickou kolonu v nezbytném
objemu mobilní fáze (Obr. 66).
Extrakce pevnou látkou (solid phase extraction, SPE) je technika izolace, čištění nebo
obohacování stanovované složky na malých kolonkách (např. velikosti injekční stříkačky)
naplněných sorbentem, iontoměničem, gelem nebo jiným dělícím médiem dle charakteru
izolované látky. Vzorek v roztoku se touto kolonkou prolévá podtlakem, zachycené složky se
po promytí uvolní vhodným rozpouštědlem (Obr.č. 67).
84
Obr.66: Odpařování org. extraktů Obr.67: SPE extrakce
ve vyhřívaném termobloku pod proudem dusíku
Obr.67: Příklad záznamu HPLC analýzy purinů a pyrimidinů v moči: Detekce při jedné
vlnové délce ve srovnání se záznamem analýzy z PDA - detektoru diodového pole - ve
zvoleném rozmezí vlnových délek na HPLC s PDA detektorem – Waters)
Obr. 31: Integrovaný separační modul Alliance s PDA detektorem – Waters
Obr. 68: Integrovaný separační modul Alliance s PDA detektorem – Waters
85
Obr. 69, 70: Záznam analýzy katecholaminů v moči z HPLC Agilent série 1200,
elektrochemický detektor Coulochem
Pozn.: Separační modul Alliance - Waters je plně integrovaný, HPLC Agilent série 1200 je
příklad systému modulárního.
4.5.4. Plynová chromatografie
GC je nepostradatelná technika v kvalitativních i kvantitativních analýzách v toxikologii.
Plynové chromatografy v toxikologických laboratořích bývají vybaveny různými detektory a
tak určeny k různým typům analýz, např. GC s plamenovým ionizačním detektorem se
používá pro stanovení alkoholu a těkavých látek v krvi, NPD detektor je díky zvýšené
citlivosti k látkám obsahujícím dusík ideálním pro screening většiny léčiv či drog, detektor
elektronového záchytu se uplatňuje v analýze benzodiazepinů nebo halogenovaných látek.
Nejširší využití má plynová chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií, ať už
v toxikologii pro cílený průkaz a stanovení noxy, nebo při diagnostice dědičných
metabolických poruch (viz kapitola Hmotnostní spektrometrie).
86
5. Hmotnostní spektrometrie (MASS SPECTROMETRY, MS)
5.1. Definice hmotnostní spektrometrie
Hmotnostní spektrometrie je fyzikálně-chemická metoda pro kvalitativní i kvantitativní
analýzu širokého spektra klinicky významných analytů, případně pro stanovení elementárního
složení a struktury molekul, využívá separace urychlených ionizovaných částic ve vakuu
podle jejich hmotnosti při jejich průchodu magnetickými a elektrickými poli.
MS byla vyvinuta počátkem 20.století, v klinické biochemii se užívá již několik desetiletí pro
identifikaci a stanovení nízkomolekulárních látek na základě měření hmotnosti jejich molekul
(detekce látek ve spojení s plynovou chromatografií). V první polovině 90. let 20.století byly
vyvinuty nové techniky, které umožnily využívat metodu ve spojení s LC a to i pro
vysokomolekulární látky.
MS se stala vedle metod molekulové genetiky nejdynamičtěji se rozvíjející metodikou
současné biochemie.
5.2. Hmotnostní spektrum
Výstupem MS je hmotnostní spektrum – čarový diagram, na jehož vodorovné ose je hodnota
m/z (hmotnost / náboj iontu) a na svislé ose odezva detektoru nebo relativní zastoupení
daného iontu (ion má obvykle náboj z = 1, potom poměr m/z je roven přímo hmotnosti iontu).
Obr. 71,72: Příklady hmotnostního spektra jako závislost odezvy detektoru resp. relativního
zastoupení na m/z (užitím relativních zastoupení fragmentů se minimalizuje variabilita
výsledků získaných na různých přístrojích a spektra z různých přístrojů lze srovnávat)
5.3. Hmotnostní spektrometr
Hmotnostní spektrometr je analytický přístroj, který
nejprve ionizuje molekuly sledovaného analytu a po
separaci měří hmotnost této molekuly nebo jejích
fragmentů. Pokud je spojen s kapalinovým či
plynovým chromatografem, stává se univerzálním
detektorem, poskytujícím informace o struktuře
analytů eluovaných z kolony. Přístroj obsahuje tří
funkční celky:
Obr.73: Schema hmotnostního spektrometru
87
Iontový zdroj – v iontovém zdroji dochází k ionizaci neutrálních molekul měřené směsi;
molekula analytu je převedena do plynné fáze (do vysokého vakua), přičemž získává
charakteristický náboj.
Iontový separátor – v separátoru probíhá rozdělení iontů různých hmotností. Ion je urychlen
a z charakteru jeho pohybu vakuovaným prostorem lze vypočítat poměr jeho hmotnosti a
náboje m/z.
Detektor je nutný pro detekci iontů po jejich separaci podle hodnoty m/z a určení relativní
intenzity (četnosti) jednotlivých iontů.
Protože vzniklé ionty musí od zdroje do detektoru urazit poměrně dlouhé dráhy, je prostor
iontového separátoru, detektoru a případně i iontového zdroje hluboce evakuován, aby
nedocházelo ke kolizím analyzovaných iontů s molekulami plynu. Vakuum v hmotnostních
spektrometrech se pohybuje v hodnotách 10-3
až 10-9
torr podle typu iontového separátoru,
těchto hodnot se dosahuje kombinací rotační olejové pumpy a turbomolekulární pumpy.
5.3.1. Iontový zdroj a základní ionizační techniky
Pro MS byla vyvinuta celá řada ionizačních technik; cílem je vždy vytvořit nabitou částici,
která je následně analyzována. Použitá ionizační technika záleží na charakteru analyzovaných
látek a také na tom, zda a na jakou separační techniku je hmotnostní spektrometr napojen zda
se jedná o kombinaci GC/MS (plynová chromatografie - MS), LC/MS (kapalinová
chromatografie - MS), CE/MS (kapilární elektroforéza – MS) nebo o MS bez napojení na
jakoukoli separační techniku.
Pro GC/MS připadá v úvahu technika elektronové ionizace (electron ionization, EI) nebo
chemické ionizace (chemical ionization, CI).
Pro LC/MS, CE/MS nebo MS s přímým nástřikem vzorku je vhodná ionizace elektrosprejem
(electrospray ionization, ESI), chemická ionizace za atmosférického tlaku (atmospheric
pressure chemical ionization, APCI) nebo fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI,
atmospheric pressure photoionization).
Z dalších možností jsou to technika MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization),
příp. technika indukčně vázané plazmy (inductively coupled plazma, ICP),
5.3.1.1. Elektronová ionizace, EI
V iontovém zdroji tohoto typu dochází k ionizaci molekul analytu v plynném stavu (přímo z
plynového chromatografu) pomocí proudu elektronů ze žhaveného vlákna ve vakuu: Z
molekuly je při srážce s paprskem rychlých elektronů odtržen elektron (molekula získává
kladný náboj - stává se kation-radikálem), následně dochází k fragmentaci (rozpadu)
molekuly přebytkem energie. EI je tzv. tvrdá ionizační technika, protože při ní dochází
k fragmentaci. Vzniklé fragmenty jsou z ionizační komory přitaženy elektrickým polem,
elektrostaticky fokuzovány a vstupují do další části spektrometru – iontového separátoru.
Tento typ ionizace je vhodný pouze pro teplotně stálé nízkomolekulární látky o hmotnosti
molekuly 50 – 800 Da, tedy takové, které je možno analyzovat plynovou chromatografií.
Pozn.: Da = Dalton – jednotka molekulové hmotnosti, nazývaná též amu (atomic mass unit)
Příklad: Schema fragmentace při elektronové ionizaci a vznik hmotnostního spektra
metanolu:
88
CH3OH + 1 elektron → CH3OH+∙
+ 2 elektrony
CH3OH+∙
→ CH2OH+
+ H∙
CH2OH+
→ CH2O+∙
+ H∙
CH3OH+∙
→ CH3
+
+ OH∙
Ve zdroji vzniká nefragmentovaný ion CH3OH+∙
o hmotnosti 32 Da, který částečně
fragmentuje na ionty o hmotnosti 31 (H2C=OH+
), 29 (HC=O+
) a 15 (H3C+
) Daltonů. Všechny
ionty se objeví v hmotnostním spektru. Nefragmentovaný ion původní molekuly se nazývá
molekulový ion, iontu s nejvyšším zastoupením v hmotnostním spektru je přiřazena relativní
hodnota 100 % a nazývá se základní ion.
Obr.74: Hmotnostní spektrum metanolu Obr.75: Schema EI zdroje
5.3.1.2. Chemická ionizace CI
Chemická ionizace je „měkčí“ variantou elektronové ionizace: Do iontového zdroje je
přiváděn reakční plyn, nejčastěji metan, amoniak, izobutan případně oxid uhličitý pro
negativní CI. Proud rychlých elektronů ionizuje nejdříve molekuly reakčního plynu, protože
jsou v iontovém zdroji v nadbytku vzhledem k molekulám vzorku. Ionizované molekuly spolu
reagují navzájem, ale také předávají energii molekule analytu a ionizují ji. Takováto ionizace
analytu je podstatně šetrnější, nedochází k tak rozsáhlé fragmentaci a v hmotnostním spektru
se vyskytuje molekulový ion s vysokým zastoupením, což je výhodné pro stanovení
hmotnosti molekuly a kvantifikaci analytu. Podle charakteru analytu se používá pozitivní
nebo negativní chemická ionizace. Elektronovou i chemickou ionizaci je možné provádět po
malé úpravě na jednom přístroji.
Při pozitivní chemické ionizaci (PCI) se jako reakční plyn nejčastěji používá metan. V
iontovém zdroji probíhají následujíci reakce:
CH4 + e→
CH4
+.
+ 2e-
thermal
CH4
+.
+ CH4 → CH5
+
+ CH3
.
(vznikají i další ionty, př. C2H5
+
)
Ionty CH5
+
, CH4
+.
reagují s molekulami analytů M a vzniklé kationty jsou pak dále
analyzovány iontovým separátorem:
CH5
+
+ M → CH4 + MH+
CH4
+.
+ M → CH4 + M+.
nebo př. CH5
+
+ C10H22 → CH4 + C10H21
+
+ H2 pro látky s nízkou afinitou k protonu (př.
alkany)
89
V hmotnostním spektru se pak podle charakteru látky vyskytují píky odpovídající
hmotnostem M+1, M-1, případně hmotnosti odpovídající aduktům MC2H5
+
a další.
Při negativní chemické ionizaci (NCI) se na rozdíl od EI nebo PCI sledují záporně nabité
ionty; hmotnostní spektrometr pracuje v záporném módu, což znamená, že musí dojít k
přepólování celého hmotnostního spektrometru. V iontovém zdroji probíhají následujíci
reakce:
CH4 + e→
CH4
+.
+ 2e-
thermal
Elektrony produkované touto reakcí mají nižší energii než elektrony z vlákna zdroje a pokud
interagují s molekulami analytů, nepůsobí výraznou fragmentaci; dochází pouze k záchytu
elektronu případně jednoduché disociaci. Záporně nabité ionty pak dále pokračují do
iontového separátoru.
MX + ethermal
→ MX-.
MX + ethermal
→ M.
+ XMX
+ ethermal
→ M+
+ X+
eBěhem
těchto reakcí nevznikají žádné záporně nabité ionty reakčního plynu a kladně nabité
ionty reakčního plynu se v důsledku přepólování přístroje dál do analyzátoru nedostanou. Tím
se výrazně snižuje šum (na rozdíl od PCI) a NCI má proto velkou citlivost a nízké meze
detekce analytů.
Negativní chemická ionizace lze použít pro látky obsahující elektronegativní substituent
(zvláště halogen) nebo heterocyklus s elektronegativním atomem. NCI se používá např. pro
analýzu benzodiazepinů, mastných kyselin po derivatizaci pentafluoro-benzyl-bromidem atd.
Obr.76: Srovnání hmotnostního spektra získaného elektronovou ionizací a chemickou ionizací
5.3.1.3. Elektrosprej ionizace, ESI
Ionizace elektrosprejem probíhá při atmosférickém tlaku. Roztok vzorku (typicky eluát z
HPLC kolony) protéká kovovou nebo křemennou kapilárou, na niž je vloženo vysoké napětí,
čímž se za pomoci zmlžujícího plynu vytváří sprej vysoce nabitých kapiček. Odpařováním
rozpouštědla z kapiček dochází k jejich zmenšování a tím ke zvýšení hustoty povrchového
náboje, až při dosažení kritické hodnoty dochází k tzv. coulombické explozi, tj. rozpadu na
90
ještě menší kapičky s rozdělením původních nábojů; opakování tohoto procesu vede až k
uvolnění molekulových iontů. Vznikají ionty (i vícenásobně nabité), které jsou dále
separovány iontovým analyzátorem (Obr.č. 77).
Objev ESI znamenal revoluci v hmotnostní spektrometrii, protože umožnil analýzu polárních
netěkavých látek, i vysokomolekulárních, např. proteinů, nukleových kyselin, peptidů,
sacharidů)
Analýza vysokomolekulárních látek je umožněna právě tvorbou vícenásobně nabitých iontů,
protože iontové separátory dělí ionty podle hodnoty m/z (např. i velká molekula o hmotnosti
20 000 může nést 20 nábojů a tím být detegována už při hodnotě m/z = 1000), což obrovským
způsobem zvyšuje rozsah měřitelných hmot přístroje.
ESI je měkká ionizační technika (tj. bez následné fragmentace vzniklých molekulových
iontů). vhodná pro nízkomolekulární i vysokomolekulární látky.
5.3.1.4. Chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI)
APCI je obdobná technika jako ESI, využívá podobné uspořádání, rozdíl je však ve způsobu
ionizace. Vysoké napětí se vkládá nikoli na ústí kapiláry, ale na výbojovou elektrodu (jehlu),
čímž vzniká koronový výboj, kterým jsou nejdříve ionizovány molekuly mobilní fáze
(protože jsou v obrovském přebytku) a následně jsou ion-molekulárními reakcemi
ionizovaných molekul mobilní fáze ionizovány molekuly analytu. Vzniklé ionty jsou
elektrodami usměrněny do analyzátoru, protiproud sušícího plynu (dusík) slouží k rozbití
případných nekovalentních klastrů (aduktů analytu s rozpouštědlem) Obr.č. 78.
APCI je rovněž měkká ionizační technika, kombinuje se s HPLC, na rozdíl od ESI však není
vhodná na iontové nebo vysokomolekulární látky.
Obr.77: Schema ESI Obr.78: Schema APCI Obr.79: Schema APPI
5.3.1.5. Fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI)
APPI je technika velmi podobná APCI, ale lze ji použít i pro velmi nepolární nebo labilní
sloučeniny. Koronová jehla je zde nahrazena zdrojem UV záření (kryptonová výbojka).
Energie záření je menší než ionizační energie složek mobilní fáze (metanol, acetonitril, voda),
proto se do zdroje přidává reakční snadno ionizovatelný plyn, zpravidla toluen. Primární ionty
vznikají fotoionizací z toluenu a tyto následně ion-molekulárními reakcemi ionizují molekuly
analytu (Obr.č. 79).
Pozn: Porovnání ESI, APCI a APPI:
91
ESI je vhodná pro středně polární až iontové sloučeniny, pro biopolymery, je to nejšetrnější
ionizační technika. ESI je méně vhodná pro bezvodé mobilní fáze a systémy s normálními
fázemi. APCI se používá pro málo až středně polární sloučeniny cca do hmotnosti 1000 až
1500, má větší toleranci k obsahu solí v eluentu a méně aduktových iontů. APPI umožňuje
analyzovat i zcela nepolární látky nebo labilní látky (např. cukry), použití vhodného typu
reakčního plynu (dopantu) umožňuje selektivní analýzu, je ideální pro systém s normálními
fázemi.
5.3.1.6. MALDI - Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization
MALDI je spolu s ESI nejvhodnější ionizací pro analýzu biopolymerů a syntetických
polymerů (desítky až stovky tisíc Da, existují aplikace i přes milión Daltonů).
Vzorek je v roztoku smíchán s vhodnou matricí, která může absorbovat energii laserového
záření ve viditelné nebo blízké ultrafialové oblasti, je nakápnut a vysušen (vykrystalizován)
na MALDI destičce ve formě spotu. Spot na destičce je vystaven krátkému laserovému pulzu.
Energie laseru je absorbována matricí, látky se prudce odpaří do vakua a ionizovaná matrice s
sebou strhne molekulu analytu. Následně dojde k ion-molekulárním reakcím analytů ze
vzorku s ionizovanou matricí a tím k šetrné ionizaci molekul analytu (obr.č. 80). Ionty
studovaných analytů (nejčastěji kladné ionty [M+H]+
, [M+2H]2+
),se pak již pohybují
samostatně, urychleny stejnosměrným elektrickým polem do analyzátoru, kterým bývá téměř
výhradně TOF analyzátor, schopný separovat pulzně produkované ionty.
Pro analýzu je důležitá správná příprava vzorku, volba vhodné matrice a rozpouštědla vzorku.
Jako matrice se používají deriváty nízkomolekulárních aromatických kyselin (obr.č. 81).
Pozn.: Technika SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption / Ionization) využívá
kombinace afinitního principu a ionizace MALDI (více v kapitole týkající se praktických
aplikací MS).
Obr.80: Schema MALDI
Obr.81: Matrice
92
Obr.82, 83: Čistá MALDI destička a destička se spoty
Obr.84: Zvětšený spot na obrazovce monitoru přístroje (kurzor ukazuje místo dopadu
laserového paprsku
5.3.1.7. Porovnání EI a šetrnějších ionizačních technik:
Ionizační techniky lze orientačně seřadit podle přebytku vnitřní energie ionizované molekuly
analytu vedoucí k její fragmentaci (hovorově řečeno podle jejich „tvrdosti“). Pořadí je
orientační, může se lišit pro různé třídy látek a také silně závisí na experimentálních
podmínkách: ESI (nejšetrnější) < MALDI ~ APPI < APCI < CI < EI.
5.3.1.8. Indukčně vázaná plazma (ICP)
ICP je ionizační technika za atmosferického tlaku. Vzorek je dodáván pomocí zmlžovače do
zdroje, ve kterém je vysokoteplotní plazma generovaná působením vysokofrekvenčního
elektromagnetického pole na argon. V plazmatu pak dojde k ionizaci analytu a jeho
kompletní atomizaci. Tato velmi tvrdá ionizační technika může být v klinické laboratoři
částečně využita pro analýzu stopových prvků nebo těžkých kovů e vzorcích tělních tekutin
nebo tkání.
5.3.2. Iontové separátory
V iontovém separátoru (iontovém analyzátoru) probíhá rozdělení iontů podle hodnoty m/z.
Ionty jsou urychleny a z charakteru jejich pohybu evakuovaným prostorem lze vypočítat
poměr jejich hmotnosti a náboje m/z.
Iontové analyzátory mohou být paprskové, kdy ionty během mikrosekund až milisekund
prolétají přístrojem a dopadají na detektor (k takovým analyzátorům patří magnetický
sektorový analyzátor, kvadrupól a TOF) nebo analyzátory typu iontové pasti, ve kterých se
ionty vlivem kombinace elektrických a magnetických pohybují v určitém prostoru po určitý
čas (řádově sekundy) po drahách, které dovolují určit jejich hodnotu m/z.
5.3.2.1. Magnetický sektorový analyzátor
Magnetický sektor je historicky prvním iontovým analyzátorem, využívá skutečnosti, že
dráha nabité částice se v magnetickém poli zakřivuje tím více, čím má vyšší náboj a nižší
hmotnost (obr.č. 85). Analyzátor je velmi přesný s vysokým rozlišením, stále se vyvíjí ale ve
své moderní verzi je velmi nákladný, objemný, v klinických laboratořích se nepoužívá (obr.č.
86).
93
Obr.85, 86: Magnetický sektorový analyzátor
5.3.2.2. Kvadrupól
Kvadrupóly známé i jako kvadrupólové hmotnostní filtry jsou nejpoužívanějším typem
iontového analyzátoru. Nedosahují sice takové citlivosti, přesnosti a rozlišení jako
magnetický sektor, ale jsou flexibilní, levné a prostorově nenáročné. Konstrukčně se jedná o 4
rovnoběžné kovové tyče kruhového nebo hyperbolického průřezu připojené ke zdrojům
stejnosměrného a střídavého napětí. Ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, začnou
oscilovat Při vhodné kombinaci obou složek napětí projdou kvadrupolem pouze ionty o
určitém poměru m/z. Plynulou změnou vkládaných napětí je možné během krátkého
okamžiku nechat projít kvadrupolem postupně ionty v celém rozsahu m/z, (tzn. přístroj
pracuje v tzv. skenovacím módu - scan mode), ale je možné pracovat i v tzv. SIM modu
(selected ion mode), kdy přístroj sleduje pouze jeden nebo několik vybraných iontů, což
výrazně zvýší citlivost pro tyto vybrané ionty.
Kvadrupóly mají rozlišení řádově několik tisíc (rozlišení je míra schopnosti analyzátoru
rozlišit blízké hodnoty m/z. Podrobněji bude popsáno v dalším textu), což postačuje pro
rozlišení izotopů a využívá se pro kvantifikaci analytů tzv. izotopovou dilucí.
Kvadrupóly se používají pro GC/MS i LC/MS (v kombinaci s EI, CI, ESI, APCI, APPI).
Obr.87,88: Schema kvadrupólu a reálný pohled na kvadrupól v kombinaci s EI zdrojem a
detektorem
94
5.3.2.3. TOF – analyzátor „Time of Flight“ (průletový)
TOF analyzátor deteguje hmotnosti ionizovaných molekul na základě doby jejich letu
evakuovanou trubicí - rychlosti letu závisí na hodnotách efektivní hmotnosti m/z, kdy lehčí
molekula letí rychleji. TOF analyzátory mají téměř neomezený rozsah hodnot m/z, vysokou
citlivost, dobré rozlišení a dokáží pracovat s pulzním iontovým zdrojem, proto se používají v
aplikacích zvláště v kombinaci s MALDI a podobnými technikami.
Analyzátor má tvar evakuované trubice. Ionty ze zdrojové části trubice jsou elektricky
urychleny a dopadají na detektor na opačném konci, měří se čas průletu analyzátorem.
1/2
2E
m
Lt 






t...čas, L...délka dráhy, m...hmotnost iontu, E...kinetická energie
Pro dobré rozlišení musí analyzátor měřit čas s přesností 1 nanosekunda. Pro další zlepšení
rozlišení se používá reflektronový mód, kdy ion nedopadá na lineární detektor na konci
trubice, ale dráha jeho letu je obrácena reflektorem a ion pak dopadá na reflektorový detektor.
Při tomto způsobu se prodlouží dráha a čas letu (obr.č. 89;90).
MALDI - TOF (SELDI - TOF) hmotnostní spektrometry se používají hlavně pro analýzu
proteinů, mohou analyzovat molekuly s hmotností přesahující až 100 000 Da. TOF v
kombinaci s EI nebo ESI lze použít i pro menší molekuly, ovšem v poněkud jiném provedení
- TOF analyzátory bývají zpravidla "jednoúčelové".
Obr.89,90: Schema TOF analyzátoru a MS firmy Agilent (TOF analyzátory mohou být díky
dlouhé svisle nebo vodorovně uložené letové trubici poněkud prostorově náročnější)
5.3.2.4. Iontové pasti
Iontové pasti jsou trojrozměrnou obdobou kvadrupólu, pracují na stejných fyzikálních
principech jako kvadrupól - oba typy analyzátorů používají elektrická pole pro regulaci
pohybu iontu v určitém prostoru.
Sférická iontová past se používá jako alternativa kvadrupólu v GC a LC detektorech. Na
rozdíl od kvadrupólu, který omezuje pohyb iontu ve dvou směrech, je past navržená tak, že
omezuje pohyb iontu ve všech třech směrech. Ionty se tak pohybují po určitou dobu v
prostoru iontové pasti a mohou z ní být vypuzovány selektivně podle hodnoty m/z (obr.č.
91;92).
95
Obr.91,92
Sférická iontová past a průřez sférickou iontovou pastí: na středovou prstencovou (ring)
elektrodu je vkládáno vysokofrekvenční napětí s proměnnou amplitudou Krajní elektrody jsou
uzemněny. Ionty jsou nuceny pohybovat se uvnitř iontové pasti po uzavřených kruhových
drahách.
Lineární iontová past má podobný tvar jako kvadrupól, pouze na oba její konce je vkládáno
elektrostatické pole, které zabraňuje iontům opustit vnitřní prostor. Výhodou lineární pasti
oproti sférické je větší pracovní rozsah.
Obr.93: Lineární iontová past
Iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací (FT - ICR) je založena na
principu pohybu iontu v magnetickém poli: jestliže se ion dostane do silného magnetického
pole, začne se pohybovat po kruhové trajektorii s frekvencí ω:
ω = B. z / m B...intenzita magnetického pole
Každá hodnota m/z má tedy charakteristickou frekvenci, Fourierovou transformací se
přepočtou tyto frekvence do škály m/z a tím se získá hmotnostní spektrum. ICR se vyznačuje
extrémně vysokým rozlišením a velmi přesným měřením hmotnosti (obr.č. 94).
Orbitrap je nejnovějším iontovým analyzátorem, který se rovněž vyznačuje vysokým
rozlišením. V Orbitrapu ionty vlivem elektrických polí obíhají okolo centrální elektrody a
současně oscilují podél této elektrody s frekvencí závislou na jejich m/z. Oscilace snímají
vnější detekční elektrody. Fourierovou transformací jsou získány frekvence iontů o různé m/z
a tyto frekvence jsou následně překonvertovány na klasické hmotnostní spektrum (obr.č. 95).
Obě poslední techniky by díky vysokému rozlišení mohly najít uplatnění při analýzách
složitých matric - biologických vzorků bez náročných úprav.
96
Obr.94: FT-ICR - do hlubokého vakua a magnetického pole je umístěna cela ze šesti elektrod,
které tvoří stěny krychle, ionty se v cele pohybují po cyklických drahách.
Obr.95: Orbitrap - ionty rotují a zároveň oscilují kolem centrální elektrody
5.3.3. Detektor
Poslední částí hmotnostního spektrometru je zařízení, které deteguje ionty po jejich separaci
podle hodnoty m/z a určuje relativní intenzitu (četnost) jednotlivých iontů. Data jsou
počítačově zpracována.
Elektronový násobič obsahuje sérii dynod se vzrůstajícím potenciálem. Ion narazí na povrch
první dynody, dojde k emisi elektronu. Po jeho dopadu na další dynodu dojde k vícenásobné
emisi. Kaskádovitým efektem vznikne velké množství elektronů, které jsou detekovány
(obr.č. 96).
Fotonásobič: Před vlastním fotonásobičem je umístěna fosforová destička, na ni dopadají
částice z konverzní dynody a dochází k emisi fotonů. Fotony dopadají na fotokatodu, kde
fotoelektrickým jevem dojde k emisi elektronů. Ty jsou dále zmnoženy stejně jako v
elektronovém násobiči (obr.č. 97).
97
Obr.97: Fotonásobič
Obr.96. Elektronový násobič
5.4. Parametry hmotnostního analyzátoru
Základním parametrem hmotnostního analyzátoru je rozlišení R, které vyjadřuje schopnost
analyzátoru rozlišit blízké hodnoty m/z. Jeho reciproká hodnota 1/R může být 103
- 106
.
Může být vyjádřeno jako RP (resolving power) - rozlišení pro 2 ionty, které mají 10% překryv
při stejné výšce:
RP = m1 / (m1 - m2) m1, m2...hmotnosti 1. a 2. iontu (náboje z1, z2 se rovnají jedné)
Pro 1 ion může být rozlišení vyjádřeno jako FWHM (full width at half maximum):
FWHM = m/Δm nebo t/2Δt (pro TOF) m...hmotnost iontu, t...doba letu (pro TOF)
98
Obr.99: Konkrétní hodnoty RP - modelový příklad
Obr.98: Vysvětlení rozlišení
Analyzátor
RP
(FVHM)
Rozsah
m/z
Rychlost
skenu
Cena
(mil.Kč)
Magnetický sektor 105
104
Nízká 10 - 15
Kvadrupol - přímý 103
103
Střední 2 - 4
Kvadrupol - past 103
104
Vysoká 3 - 6
Průletový 104
103
- 106
Velmi vysoká 6 - 8
FT - ICR 106
108
Vysoká 30
Tab.6: Srovnání iontových analyzátorů
5.5. Tandemová hmotnostní spektrometrie, MS/MS, MSn
Tandemová hmotnostní spektrometrie je citlivá a vysoce selektivní metoda, která umožňuje
rychlou analýzu i ve složité matrici ve spojení se separační metodou (GC, LC), nebo i bez
použití separační metody. Při MS/MS jsou ionty podrobeny dvěma (nebo více) hmotnostním
analýzám. V tandemových hmotnostních spektrometrech jsou v sérii zapojeny dva (nebo více)
iontových separátorů v tandemu, mezi ně je zařazena kolizní cela. První analyzátor vybírá
ionty s určitou hodnotou m/z (prekurzorové ionty nebo též mateřské ionty). Prekurzorové
ionty přechází do kolizní cely, kde probíhá jejich fragmentace kolizí s atomy inertního plynu.
Vzniklé produktové (dceřinné) ionty vstupují do druhého iontového analyzátoru, kde jsou
zaznamenány jako spektrum.
U tandemové hmotnostní spektrometrie se využívají různé režimy práce. Například při skenu
produktových iontů je první hmotnostní analyzátor MS1 nastaven tak, aby vybíral pouze ion s
danou hodnotou m/z a druhý analyzátor skenuje celé spektrum produktových iontů - tento
režim se často používá pro charakterizaci struktury látky. Při skenu prekurzorových iontů je
vztah obrácený - MS1 skenuje celé spektrum a MS2 vybírá specifický produktový ion (pro
vybraný fragmentový ion se tedy zjišťuje původní prekurzorový ion, ze kterého vznikl) režim
se často používá pro analýzu určitých skupin látek.
Nejčastější používanou kombinací iontových analyzátorů je tzv. trojitý kvadrupól QqQ, kdy
první kvadrupól slouží jako MS1, třetí kvadrupól jako MS2 a mezi ně je vřazen kvadrupól,
který funguje jako kolizní cela. Další možností je např. tandemový TOF/TOF hmotnostní
99
spektrometr, který je ve spojení s MALDI účinným nástrojem pro proteomiku. Tzv. hybridní
analyzátory jsou kombinací dvou různých typů analyzátorů, např. Q/TOF.
Pozn.: Mezi známé výrobce MS patří například Agilent Technologies (GC/MS, LC/MS,
MS/MS, EI, CI, ESI, Q, TOF), Bruker Daltonic (FT-ICR, MALDI-TOF, iontové pasti, ESITOF,
ESI-QTOF), Ciphergen Biosystems (MALDI-TOF, SELDI-TOF), Thermo Fischer
Scientific (kvadrupólové GC/MS a LC/MS, magnetické sektory, kvadrupoly, iontové pasti,
OrbitrapTM
, FT-ICR, ICP/MS), Varian (GC/MS, MS/MS a MSn
s iontovými pastmi), Waters
(HPLC/MS, kvadrupóly, TOF, magnetické sektory, MS/MS, ICP/MS) a mnozí další.
5.6. Kvantita v hmotnostní spektrometrii
Pro kvantifikaci látek v MS se převážně používá metoda vnitřního (interního) standardu:
Interní standard (IST) pro stanovení určité látky je analogická sloučenina nebo homolog, aby
IST měl co nejpodobnější chemicko-fyzikální vlastnosti jako stanovovaná látka, ale musí to
být látka, která se ve zkoumaném vzorku nevyskytuje (např. pro analýzu mastných kyselin lze
použít kyselinu pentadekanovou - má lichý počet atomů uhlíku, tedy nevyskytuje se v
biologických vzorcích).
IST se přidává do vzorku již na začátku zpracování - pro potlačení vlivu matrice či
kontaminace na účinnost ionizace analytu - do všech vzorků ve stejné známé koncentraci. Z
MS spektra se po analýze vyhodnocuje poměr intenzit fragmentů typických pro stanovovanou
látku a IST.
Pozn.: Pro kvantifikaci je vhodné použití selektivního záznamu iontů (SIM – Selection Ion
Monitoring) – způsob, kdy přístroj registruje pouze několik zvolených fragmentů, což má za
následek výrazné zvýšení citlivosti.
Nejpřesnějším postupem je metoda izotopového zřeďování (isotopic dilution MS, ID/MS),
kde IST je izotopicky značený standard stanovované látky - má identické chemicko-fyzikální
vlastnosti jako stanovovaná látka. Izotopický standard bývá nejčastěji deuterovaný.
Obr.100, 101:Příklad analýzy methylbromidu s IST (izotopově značený methylbromid). Z MS
spektra se po analýze vyhodnocuje poměr intenzit odpovídajících fragmentů (79-81 a 94-96).
5.7. Praktické aplikace MS, MS/MS v klinické biochemii
5.7.1. Plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC/MS)
Hmotnostní spektrometrie se využívá např. pro analýzu neznámých složek směsi: složitá směs
analytů je separována plynovou chromatografíí a pro každou složku směsi (tj. pro každý pík
chromatogramu) se získá hmotnostní spektrum v reálném čase. Identifikace složek (píků
chromatogramu) se provádí na základě porovnání s databází spekter v počítači (k dispozici je
100
několik komerčně dostupných PC "knihoven" hmotnostních spekter, pro účel detekce
neznámé složky směsi např. Wiley Registry of Mass Spectral Data).
GC/MS může dále sloužit k potvrzení či vyloučení určitých metabolitů, které svědčí pro určité
metabolické onemocnění, případně jejich kvantifikaci. GC/MS techniky se staly standardem
ve vyhledávání a potvrzování nox v toxikologické praxi (léky, drogy, anabolické steroidy),
opět s využitím databází spekter (př. Pfleger Drug Library).
Obr.102, 103: Příklad analýzy organických kyseli v moči: Organické kyseliny byly ze vzorku
moči extrahovány do ethylacetátu a po odpaření rozpouštědla derivatizovány silylací. Analýza
byla provedena na GC/MS Agilent. Na obr.102 je plynový chromatogram, na obr. 103 je
hmotnostní spektrum šipkou označeného píku na chromatogramu. Podle spektra byl pík
identifikován jako citrát (s použitím Wiley databáze).
5.7.2. Kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC/MS, LC/MS/MS)
LC/MS, případně LC/MS/MS jsou považovány za toxikologický standard nejen při
screeningu neznámých nox, ale i při potvrzení a kvantifikaci speciálních nox termolabilních a
polárních látek nebo látek o vyšší molekulové hmotnosti (látky, které není možné analyzovat
technikou GC/MS).
V klinické laboratoři se uvedené techniky uplatňují při stanovení léků, farmakokinetických
studiích. Techniky LC/MS/MS umožnily rozvoj proteomiky a metabolomiky.
Na obrázku č.104 je příklad stanovení léků LC/MS (LC/MS/MS): jak je vidět z
chromatogramu, analyzovaná imunosupresiva nelze za daných podmínek kapalinovou
chromatografií dobře rozdělit - píky jednotlivých léčiv by se vzájemně překrývaly. Při
napojení separace na hmotnostní spektrometrii je přístroj schopen registrovat fragmenty
typické pro dané léčivo a tak rozlišit a stanovit i koeluované látky.
101
Obr. 104: Stanovení léků LC/MS (LC/MS/MS)
Obr. 105: LC/MS/MS - TSQ Quantum Access MAX firmy Thermo, uspořádání ESI - QqQ
5.7.3. Tandemová hmotnostní spektrometrie MS/MS (bez separační techniky)
5.7.3.1. Novorozenecký screening dědičných poruch metabolismu
Tandemová hmotnostní spektrometrie jako samostatná metoda bez separační techniky se
využívá např. při novorozeneckém screeningu dědičných metabolických poruch při stanovení
koncentrací aminokyselin a acylkarnitinů ve výluhu ze suché krevní kapky na filtračním
papíře (v ČR se touto metodou provádí screening 10-ti různých metabolických poruch, mezi
nimi např. fenylketonurie).
Sledované látky jsou vyextrahovány do metanolu, derivatizovány butylací a analyzovány
MS/MS na přístroji s uspořádáním ESI - trojitý kvadrupól (ESI-QqQ). Kvantifikace se
provádí pomocí deuterovaných vnitřních standardů.
QqQ tandemové hmotnostní spektrometry by do budoucna měly umožnit multikomponentní
analýzu - profily sacharidů, lipidů, fosfolipidů, organických kyselin a aminokyselin, stanovení
skupin léků v jedné analýze, stanovení nízkomolekulárních markerů na úrovni referenčních
metod (př. glukóza, kreatinin, kyselina močová)
5.7.3.2. MALDI - TOF/TOF
Technika MALDI - TOF/TOF se používá pro proteinovou analýzu, např. analýzu neznámého
proteinu: Protein (vyseparovaný ze směsi např. dvourozměrnou elektroforézou) se rozštěpí
enzymem (např. trypsinem) na směs peptidů. Tato směs peptidů se nechá vykrystalizovat s
matricí na MALDI destičce a je podrobena analýze na přístroji s uspořádáním MALDI - TOF
- kolizní cela - TOF. První TOF analyzátor vybírá prekursorový ion (peptid), který vstupuje
do kolizní cely. V kolizní cele dojde k fragmentaci iontu - peptidu na jednotlivé
aminokyseliny (srážkou iontu s atomy inertního plynu) a spektrum fragmentů je měřeno
druhým TOF analyzátorem.
Obr.106: Spektrum
peptidů z TOF/TOF
Obr.107: MALDI-
TOF/TOF
analyzátor
5.7.4. SELDI – Surface Enhanced Laser Desorption Ionization
102
SELDI je technika analýzy proteinů pomocí vazby na předpřipravený povrch pevné fáze
proteinového čipu, kombinuje afinitní princip a MALDI. Povrch proteinového čipu může být
tvořený protilátkou, receptorem, ligandem, může být chemickým způsobem upravený, takže
po nanesení vzorku na čip se proteiny ze vzorku (sérum, moč, mozkomíšní mok) navážou k
povrchu adsorpcí, elektrostatickou interakcí, na afinitním principu apod. Nenavázané složky
směsi se odstraní promytím čipu a následuje stejná analýza jako v případě MALDI-TOF. Čipy
mohou být vyrobeny dle požadavku zákazníka (Ciphergen Biosystems)
Vzorek komplexní směsi proteinů může být analyzován současně na několika různých typech
povrchů tak, aby byly navázány a analyzovány veškeré proteiny ve vzorku. Výsledkem
analýzy pak není stanovení pouze jednoho proteinového markeru určité choroby, ale celý
proteinový profil související s určitou chorobou.
Obr.108: Princip SELDI
Obr.109: SELDI - TOF (Ciphergen)
5.7.5. Indukčně vázaná plazma (ICP-MS)
ICP-MS se používá pro analýzy stopových prvků nebo těžkých kovů. Toxicita nebo
biologické účinky těchto prvků však závisí na formě, ve které jsou prvky v organismu
přítomny a je důležité znát spíše koncentraci toxických forem těchto prvků, nikoli jejich
celkovou koncentraci. Za tímto účelem se ICP-MS kombinuje s GC nebo LC za účelem
separace sloučenin obsahujících daný prvek před MS analýzou.
103
6. Atomová absorpční
6.1. Historie AAS
První pozorování a objevy směřující k AAS pocházejí z počátku 19. století.
Původ tmavých čar nalezených při pozorování slunečního spektra (Fraunhofer 1815) byl
vysvětlen absorpcí ze spojitého záření sluneční atmosférou (Brewster 1820). Vztah mezi
emisí a absorpcí vyjádřil Kirchhoffův zákon, podle kterého atom emitující určité záření
může při téže vlnové délce toto záření absorbovat. Objev AAS jako analytické metody se
přisuzuje Walshovi , který v roce 1955 vystavoval poprvé atomový absorpční spektrometr
v Melbourne.
U nás se komerční přístroje začaly používat v roce 1962 (Techtron). Ke zdokonalování a
vývoji systémů AAS významným způsobem přispěl ruský vědec L´vov. Největší přínos pro
vývoj a praktickou aplikaci AAS s ETA je spojen se jménem Hans Massmann.
6.2. Atomová spektra
Atomy mohou elektromagnetické záření určité energie pohlcovat (absorbovat) nebo vysílat
(emitovat). Energie atomů v různých stavech jsou určeny především výskytem elektronů
v určitých energetických hladinách. Při absorpci nebo emisi záření dochází k přechodu
elektronů mezi energetickými hladinami. Jednotlivé stavy atomů se liší energií podle toho, na
kterou hladinu byl elektron excitován. Při přechodu mezi jednotlivými stavy atomu může
atom absorbovat nebo emitovat foton, jehož energie je rovna úbytku nebo přírustku energie
atomu E podle Planckova vztahu
ΔE=E2 - E1 = h . ν
kde: E2 ; E1 jsou energie atomu ve vyšším a nižším energetickém stavu
h Planckova konstanta (6,626-34
. 10 J s)
ν frekvence vyzářeného nebo absorbovaného záření
K excitaci může dojít buď absorpcí elektromagnetického záření, předáním energie
elektrickýcm výbojem nebo zahřátím na vysokou teplotu apod. V excitovaném stavu zůstává
atom jen velmi krátce; 10-8
s.
Při termické excitaci za teploty pod 2700°C a pro λ<500 nm je počet excitovaných atomů
zanedbatelný k počtu atomů v základním stavu. Pro AAS z toho vyplývá, že počet atomů
v základním stavu je téměř identický s celkovým počtem volných atomů. Za teplot
využívaných v AAS je tedy hlavním stavem atomů základní stav.
6.3. Měření absorpce; Lambertův-Beerův zákon
Různé atomy absorbují záření ve velmi úzkém spektrálním intervalu. V tomto intervalu
0,0005-0,005 musí primární zdroj záření emitovat vysokou zářivou energii. Proto se používá
emitovaného záření téhož prvku, který stanovujeme.
Mezi původním (primárním) tokem záření Φ0 a absorpcí atomů oslabeným zářením Φ platí
Lambertův-Beerův zákon
Φ = Φ0 . e –κ . N . l
kde κ je atomový absorpční koeficient; l délka absorpčního prostředí a N počet atomů
v základním stavu v jednotce objemu
Po úpravě
A = log Φ0 / Φ = 0,434 κ . N . l
kde A je absorbance.
AAS je metodou relativní. Hodnoty absorbance pro vzorek jsou porovnávány s hodnotami
absorbance standardů formou kalibrační křivky.
104
Důležitými parametry pro hodnocení metody AAS jsou citlivost, mez detekce a mez
stanovitelnosti.
6.3.1. Citlivost
se posuzuje podle směrnice kalibrační křivky. V AAS se navíc udává „charakteristická
koncentrace“, což je koncentrace vyvolávající absorbanci 0,0044. Chrakteristická koncentrace
je jednou z cenných ukazatelů správné funkce a nastavení spektrometru i správné přípravy
kalibračních roztoků.
6.3.2. Mez detekce
určuje nejmenší koncentrace analytu ve vzorku, kterou můžeme detekovat. Mezi detekce
odpovídá signál rovný trojnásobku směrodatné odchylky (3 . SD0) signálu nulového vzorku
(blanku).
6.3.3. Mez stanovitelnosti
se používá pro reálné vzorky, které odpovídá signál rovný desetinásobku směrodatné
odchylky (10 . SD0) signálu nulového vzorku (blanku).
6.4. Atomový absorpční spektrometr
Atomový absorpční spektrometr je přístroj, který měří absorpci primárního záření volnými
atomy v základním stavu. Rozlišujeme jednopaprskové a dvoupaprskové přístroje.
Jednopaprskový systém (a) má větší optickou propustnost a tím i nižší šum signálu a lepší
meze detekce. Má však nižší stabilitu systému a nelze eliminovat kolísání intenzity
primárního zdroje záření (obr. .
Dvoupaprskový systém (b) má naopak vysokou stabilitu, avšak dochází k větší ztrátě
primárního záření . Paprsek z primárního zdroje se střídavě propouští přes atomizér
(absorpční prostředí) a mimo (referenční paprsek) a to pomocí dalších optických prvků,
zrcadlových přerušovačů nebo děličů.
105
Vedle těchto klasických systémů byly také vyvinuty systémy s dvoupaprskovou
charakteristikou. Např. s využitím tzv. Stockdalovy optiky, t.j. vychýlení měrného paprsku
pohyblivými vychylovacími zrcadly před měřící periodou mimo absorpční prostředí ke
změření referenčního signálu. Během vlastního měření se pracuje v jednopaprskovém režimu.
Obr. č. 110
Obdobný systém používá pohyblivého hořáku a jeho vysunutí nebo zasunutí do optické dráhy
jednopaprskového spektrometru.
Obr. č. 111
106
6.5. Zdroje primárního záření
Primární záření, které má být atomy sledovaného prvku absorbováno, musí mít vysokou
zářivou energii soustředěnou do úzkého spektrálního intervalu, dlouhodobě stabilní zářivý tok
Φ0 , čáry nesmí být deformovány samoabsorpcí a pozadí musí být minimální.
Toto nejlépe splňují čarové zdroje realizované spektrálními výbojkami s parami kovů a
zejmény výbojky s dutou (HCL) katodou nebo vysokofrekvenční bezelektrodové výbojky
(EDL).
Použití zdroje spojitého spektra ve spojení s monochromátorem s vysokou rozlišovací
schopností je rovněž možné,ale méně běžné.
Lasery zejména laditelné, mají řadu přesností, jejich vysoká zářivá energie pak nachází
uplatnění v AFS.
6.5.1. Výbojky s dutou katodou (Halow Catode Lamp…HCL)
Výbojky s dutou katodou jsou nejpoužívanějšími zdroji primárního záření, emitují čarové
spektrum s pološířkou čar obvykle <0,002 nm (obr.1). Výstupníokénka jsou z optického
křemene pro λ < 240 nm, z UV skla pro λ = 240-300 nm a z optického skla pro λ > 300 nm.
Dutá katoda je buď vyrobena přímo z vysoce čistého sledovaného prvku, nebo je na nosné
katodě, vyrobené z kovu s relativně chudým emisním spektrem (Al, Cu) upevněna fólie ze
stanovovaného prvku.
obr.112
Výbojka s dutou katodou
Anoda je vyrobena z kovu s vysokou teplotou
tání (Zr, Ti, Ta).
Výbojky jsou plněny čistým monoatomickým
plynem (neon, argon) na tlak 100-500 Pa.
Mezi katodu a anodu je vložen
potenciálový rozdíl stovek voltů (200-
600 V) a výbojka je napájena proudem
jednotek miliampérů (3-10 mA). Ve
výbojce probíhá nízkotlaký doutnavý
výboj, při kterém dochází k ionizaci
vzácného plynu srážkami s urychlenými
elektrony. Kladně nabité ionty vzácného plynu bombardují povrch katody a vyrážejí odtud
atomy kovu. Dochází tak ke katodickému rozprašování materiálu katody. Atomy kovu jsou
excitovány srážkami s ionty a elektrony plazmatu a vyzářením fotonů se vracejí do základního
stavu.
U výbojek s vysokou zářivou energií (např. Superlampy f. Photron) se využívá zvýšení
intenzity jejich záření dalším výbojem mezi dvěma pomocnými elektrodami před ústím
katody. Tyto výbojky se vyznačují vyšší intenzitou záření a tedy lepším poměrem signál/šum
a tím i nižší hodnotou dosaženého detekčního limitu.
dutá
katod
a
107
6.5.2. Bezelektrodové výbojky (EDL)
Jsou opět skleněné baňky s křemenným výstupním okénkem plněné vhodným množstvím
prvku ve směsi jako kov a těkavá sloučenina (např. halogenid kovu) s inertním plynem.
Výbojky jsou umístěny v cívce radiofrekvenčního generátoru nebo v rezonanční dutině
mikrovlnného generátoru; oba tyto generátory dodávají energii k vytvoření stabilního
elektrického výboje. Bezelektrodové výbojky emitují velmi úzké čáry s intenzitou až o řád
vyšší než výbojky s dutou katodou. Toto zvýšení intenzity záření je důležité především u
prvků, které mají rezonanční linie pod 200 nm (As, Se, Pb..), kdy se podstatně uplatňuje
absorpce záření okolní atmosférou, plamenem a optickým systémem.
6.5.3. Laditelný barvivový laser.
Je ideálním zdrojem primárního záření pro vlnové délky nad 300 nm. Jeho záření je vysoce
monochromatické, dokonale koherentní (umožňuje velmi dlouhé optické dráhy) a dosahuje
vysoké hustoty zářivého toku. Nevýhodou jsou vysoké pořizovací náklady.
6.5.4. Speciální zdroje.
Vysokovýkonné zdroje kontinuálního primárního záření, jako vysokotlaké xenonové
obloukové výbojky a polovodičové laserové diody. Výbojky mohou být využity jen ve
spojení s vysokorozlišovacím optickým systémem, např. Echelle polychromátorem.
6.6. Atomizátor
Atomizátor je zařízení schopné s dostatečnou účinností přeměnit stanovovaný prvek (analyt)
na atomovou páru atomů v základním stavu.
Základním požadavkem na atomizér je, aby poskytoval co nejvyšší koncentraci volných
atomů v základním energetickém stavu, a aby byla zajištěna úměrnost mezi touto koncentrací
atomu a koncentrací stanovovaného prvku ve vzorku.
Atomizaci je možné provádět v plameni, elektricky nebo v křemenných atomizátorech.
Jednotlivé způsoby se liší jak povedením, tak citlivostí a časovou závislostí měřeného signálu.
6.6.1. Plamenová technika
Při plamenové technice se používá plamenů realizovaných směsí paliva a okysličovadla.
Palivem je nejčastěji acetylén a oxidovadlem vzduch (Tmax =2500° K) nebo oxid dusný (Tmax
=2900° K).
V AAS se převážně používá laminárních předmíchaných plamenů; tzn. že do hořáku je
vedena předem promíchaná směs paliva a okysličovadla. Používá-li se místo okysličovadla
inertní plyn, označují se plameny jako difuzní (k hoření dochází difuzí kyslíku z okolní
atmosféry). Zavádění kapalného vzorku do plamene se provádí nejčastěji pomocí
pneumatických zmlžovačů, kde dochází k vytvoření aerosolu drobných kapének zkoumaného
roztoku.
108
Obr. 113 Nebulizér s nasávací kapilárou, přívody plynů a hořákem
Vzorek je přiváděn nasávací kapilárou do mlžné (míchací) komory, kde dochází na tříštivé
kuličce k roztřištění větších kapiček na menší. Jemný aerosol (velikost částic 2 až 5 μm) se
v proudu oxidantu smísí s topným plynem a je unášen do ústí hořáku. Účinnost
pneumatických zmlžovačů je velmi nízká (okolo 10 %), pouze malá část vzorku se zmlží na
aerosol, velká část vzorku odkape do odpadu. Účinnost zmlžovače závisí na rychlosti
proudění oxidantu, který strhává roztok od ústí kapiláry a je ovlivněna i fyzikálními
vlastnostmi použitého rozpouštědla (vyskozita, povrchové napětí). Nevýhodou
pneumatických zmlžovačů je také poměrně značná spotřeba vzorku (~ 5 ml/min).
Tuto spotřebu lze značně snížit, pracujeme-li technikou průtokové injekční analýzy,kdy je do
proudu nosného rozpouštědla (voda, kyselina) dávkován pomocí ventilu malý objem vzorku
(100μl), signál pak není konstantní v čase, ale má tvar píku.
Účinnost zmlžování je možné zvýšit pouze použitím jiného typu zmlžovače . V technice AAS
nachází uplatnění vysokotlaký hydraulický nebulizér. Jedná se o velmi tenkou kapiláru,
kterou proudí nosný proud (voda, kyselina), do které je dávkován vzorek. Nosný proud je
čerpán HPLC pumpou. Linearní rychlost proudění v této úzké kapiláře, je natolik veliká, že na
jejím konci se ve styku s tříšticí kuličkou přímo tvoří velmi jemná mlha aerosolu s velmi
malým průměrem částic. Účinnost tohoto typu zmlžovače může dosáhnout až 90 %.
6.6.1.1. Hořák
Přívod acetylénu
Přívod vzduchu
Nasávací
kapilára
Hořák
Nebulizér
109
Hořáky se používají štěrbinové (délka absorpčního prostředí 5-10 cm), šířka štěrbiny 0,5 mm;
materiál ocel a titan, nebo s řadou otvorů umístěných v několika řadách.
Po vstupu aerosolu do plamene dochází k řadě pochodů. V řadě případů atomizace neprobíhá
úplně, protože některé sloučeniny kovů tvoří disociující molekuly (např. křemičitany, oxidy).
Schopnost disociace sloučenin je posuzována podle hodnoty jejich disociační energie, je-li
nižší než asi 3,5 eV, stačí pro atomizaci použití plamene o nižší teplotě (směs acetylénvzduch).
Disociace řady prvků lze též podpořit přídavky tzv. uvolňovacích činidel
(spektrochemických pufrů).
Obr. 114 Atomizér s hořákem
Koncentrace volných atomů není ve všech částech plamene stejná. Proto je nutné znát
tzv.plamenový profil, což představuje rozložení velikosti měřeného signálu prvku ( za jinak
konstatních experimentálních podmínek) v závislosti na výšce měření nad hořákem.
6.6.1.2. Struktura plamane
Nejdůležitější oblastí plamene využívanou pro měření je oblast nad primární reakční zónou a
mezireakční zóna, kde je dosahováno nejvyšší koncentrace volných atomů. Touto částí
plamene pak musí procházet optická dráha spektrometru (obr.č. 115)
V zóně předehřívání se topné plyny
zahřívají na zápalnou teplotu (šířka 0,01-
0,1 mm). Na tuto zónu navazuje primární
reakční zóny v níž se velmi složitými
reakcemi tvoří silně reaktivní radikály,
které jsou základem procesu hoření. Tato
zóna je zdrojem intenzivního
molekulárního záření, je velmi tenká (0,1
mm) a její velikost lze ovlivnit změnou
průtoku paliva. Nad touto zónou se pak
nachází sekundární reakční zóna, kde
dochází k difuznímu hoření. V redukčních
plamenech se mezi primární a sekundární
reakční zónou vyskytuje mezireakční
110
zóna, která vykazuje velmi nízkou koncentraci kyslíku, a která je zvlášť patrná u plamene
acetylén-oxid dusný.
Obr. 115 Struktura plamene-acetlén/vzduch
Hlavním nedostatkem plamenových atomizátorů je fakt, že se vzorek silně naředí spalnými
plyny (200-400 tisíckrát), a že se pouze nepatrný podíl analyzovaného vzorku skutečně
využije pro analýzu.
Plamenové analyzátory se používají při analýzách větších obsahu analytu ve vzorku, kdy se
využije vysoká rychlost měření (integrační čas odečtu ustáleného signálu bývá 5s) a menší
vliv interferencí matrice vzorku na rozdíl od ETA. Konstrukční uspořádání s plamenovým
atomizátorem je také jednodušší a tedy levnější.
6.6.2. Elektrotermické atomizátory ….ETA
Při ETA se dávkuje velmi malé množství vzorku (3-20 μl) do speciální miniaturní odporově
vyhřívané kyvety. (obr. 116)
Hlavní výhodou bezplamenových atomizátorů
je fakt, že se celé nadávkované množství
vzorku podílí na absorpci primárního záření;
dosáhneme tedy mnohem vyšší okamžitou
koncentraci volných atomů v plynné fázi ve
velmi malém objemu atomizátoru. Kyvety
musí být vyrobeny z elektricky a teplotně
vodivého materiálu, který musí být
mechanicky odolný a chemicky netečný i při
vysokých teplotách. Ze všech dostupných
materiálů se těmto požadavkům nejvíce
přibližuje grafit. Tzv. elektrografický uhlík
má však některá nevýhody. Největší nevýhodou je jeho pórovitost a reaktivita, která se
projevuje tvorbou karbidů s některými prvky. Tyto nevýhody byly z největší části odstraněny
vytvořením povlaku pyrolytického grafitu na stěnách kyvety. Tento postup je nyní používán
všemi významnými výrobci grafitových kyvet.
Vzorek můžeme dávkovat (obr. č. 117)
a) na stěnu kyvety
b) na platformu
c) na
sond
u
111
K atomizaci nadávkovaného vzorku dochází postupným ohřevem kyvety průchodem
elktrického proudu (kyveta se chová jako elektrický odpor). Grafitová kyveta je umístěna
v absorpčním spektrometru. Elektrotermický ohřev kyvety probíhá v atmosféře velmi čistého
argonu (zevně i uvnitř kyvety), aby se zabránilo přístupu kyslíku ze vzduchu k rozžhavenému
grafitu a volným atomům analytu. Druhou funkcí proudícího inertního plynu je usnadnění
odvětrání vnitřního prostoru kyvety (horním dávkovacím otvorem) od rozpouštědla ve fázi
sušení a zplodin mineralizace ve fázi zpopelnění.
Vzorek je do kyvety dávkován buď pomocí mikrodávkovače nebo dnes již standardně
programovým dávkovačem, který je příslušenstvím elektrotermického atomizátoru.
Autosampler řízený mikroprocesorem umožňuje naprogramovat a standardně provádět
pipetování mikrolitrových objemů vzorku, diluentu a modifikátorů. Jednotlivé komponenty
jsou postupně nasávány do teflonové kapiláry odděleny vzduchovými bublinkami, aby ke
smíchání došlo až při jejich vydávkování na stěnu kyvety nebo na platformu. Zásadně nutným
požadavkem je správné vycentrování dávkovací kapiláry a její výška nade dnem kyvety
s ohledem na dávkovaný objem. Adjustaci kapiláry usnadňuje u některých přístrojů
mikrokamera zavedená do kyvety. Ta umožňuje rovněž sledování průběhu dávkování, sušení
a mineralizace uvnitř kyvety (obr.118)
Obr. 118 Centrování dávkovací kapiláry v kyvetě; sledování procesu dávkování na stěnu
kyvety
112
6.6.2.1. Teplotní program kyvety (ETA)
Po nadávkování vzorku je teplota kyvety zvyšována v několika krocích – podle teplotního
programu (Tab. 7).
Tento program je složen z několika stupňů,
1) ohřev kyvety pod teplotu varu rozpouštědla - dojde k vysušení vzorku
2) ohřev kyvety na teplotu pyrolýzy - v této fázi dojde k odstranění co největší části
matrice vzorku, anorganických solí a nerozložených organických zbytků matrice
3) ohřev kyvety na teplotu atomizace - v této fázi dochází k vytvoření oblaku plynných
atomů sledovaného analytu v základním energetickém stavu a absorpci primárního
záření těmito atomy
4) krátkodobé zahřátí kyvety nad teplotu atomizace - v této fázi dojde k vyčištění kyvety
5) ochlazení kyvety na hodnotu počáteční teploty a kyveta je připravena pro nový cyklus
Fáze teplota
[°C]
čas
[s]
rampa
[°C/s)]
inert.plyn
průtok [l/min]
sušení
1 95 45 10 0,2
2 110 20 5 0,2
3 130 15 10 0,2
mineralizace 4 1100 20 150 0,2
atomizace 5 2300 3 0 0
vypálení kyvety 6 2700 3 0 0,2
Tab 7.
Příklad teplotního programu; rampa vyjadřuje rychlost nárostu teploty k dosažení teploty
dalšího stupně
Pro mechanismus atomizace v ETA platí v podstatě analogické úvahy i procesy, jako při
atomizaci v plameni. Analytický signál registrujeme ve třetí fázi teplotního programu – po
dobu ohřevu na teplotu atomizace a vlastní atomizace ( asi 5 s). Teplotní program pro
stanovení daného prvku v dané matrici vzorku je individuální a musí být vždy pro daný
přístroj optimalizován. K tomu slouží konstrukce tzv. rozkladné atomizační křivky, která určí
optimální rozkladnou a atomizační teplotu s ohledem na stanovovaný prvek a charkter vzorku
(matrici).
6.6.2.2. Monitorování a řízení teploty v kyvetě
Exaktně stanovený optimální teplotní program kyvety při ETA je rozhodující pro správný
analytický výsledek. Z toho důvodu je nutné nastavené teplotní průběhy monitorovat. Do
600°C je teplota v kyvetě odvozována od procházejícího proudu. Pro teplotní rozsah 600-
3000°C se používá optický pyrometr realizovaný křemíkovou fotodiodou, která má extrémně
rychlou odezvu a je schopna zpětnovazebně regulovat hodnotu procházejícího proudu a tím i
teplotu kyvety. Schematické znázornění tohoto systému je na obr. 119.
Obr. 119
113
Radiace z grafitové kyvety (červený až bílý žár) se fokusuje čočkou umístěnou pod kyvetou na
jeden konec optického vlákna. Optické vlákno je vedeno ke křemíkové fotodiodě.
Výsledný signál má tvar píku; kvantitu posuzujeme měřením výšky nebo plochy píku.
Vzestupná část absorpčního píku je funkcí vstupu plynného analytu z podložky do objemu
analyzátoru a sestupná část je funkcí výstupu plynného analytu z kyvety. Aby bylo dosaženo
co největší citlivosti, probíhá atomizace (a tím i měřeního píku) v modu zastavení průtoku
inertního plynu. V tomto případě není uvolněný plynný analyt ihned odnášen inertním plynem
mimo malý objem měřící kyvety. Ze stejného důvodu je také nutné, aby k uvolňovaní analytu
z podložky ve fázi atomizace došlo až tehdy, kdy se již nemění teplota plynné fáze a tedy, kdy
již nedochází k rozpínání plynů. Při splnění těchto podmínek mluvíme o tzv. izotermické
atomizaci. Podmínek izotermické atomizace můžeme nejlépe dosáhnout atomizací analytu
z platformy.
6.6.2.3. Izotermické podmínky.
Platforma je malá tenká destička, která je vložena do kyvety a její styčná plocha se stěnami
kyvety je velmi malá (pouze bodová). Energetický přenos z vnitřní stěny kyvety na platformu
se děje především zářením; tím je aktuální teplota platformy nižší ve srovnání s aktuální
teplotou kyvety a analyt přechází do plynné fáze později (a za izotermických podmínek) než
při atomizaci ze stěny kyvety (Obr. 120)
Obr. 120
Časový posun nárustu a maxima atomizační
teploty s použitím platformy; b).
Na napájecí zdroj elektrotermického
atomizátoru jsou kladeny značné nároky.
Grafitovou kyvetou prochází ve fázi ohřevu na
atomizační teplotu (nárust teploty až 2000 °C.s
-1
) proud 500-1500 A při napětí mezi grafitovými elektrodami 3 -10 V.
Dnes je celý proces dávkování vzorku, nárust teploty a monitorování signálu řízen
počítačovým softwarem obr. 121.
114
Obr. 121
Obrazovka řídícího počítače.
V horní polovině grafický záznam měřeného signálu a monitorování probíhajícího teplotního
programu.
V dolní části číselné výsledky měření a video-pohled do nitra grafitové kyvety
Hlavní výhodou Elektrotermického atomizátoru ve srovnání s plamenový atomizátorem je
značné zvýšení citlivosti měření a snížení detekčního limitu. S ETA můžeme pro daný prvek
dosáhnout ž o 3 řády nižší detekční limit. Při práci s grafitovou kyvetou se však na rozdíl od
plamene mnohem více projeví možné interference matrice a nutnost kompenzace pozadí.
6.6.3. Hydridová technika
Při technice generování a atomizace těkavých sloučenin se nejdříve chemickou reakcí
převede stanovovaný analyt na těkavou sloučeninu. Tato sloučenina, nejčastěji hydrid, se
oddělí od matrice vzorku a je atomizována ve speciálním křemenném atomizátoru, který je
umístěn v optické ose AAS. Generace těkavých hydridů je omezena jen na hydridotvorné
prvky (As, Se, Te, Ge, Bi, Sn, SB, Pb). Pro převedení analytu na hydrid je nejčastěji
používáno redukční činidlo tetrahydridoboritan sodný NaBH4 (stabilizovaný roztokem NaOH
v prostředí různé koncentrované kyseliny (nejčastěji HCl).
6.7. Disperzní systém
6.7.1. Reflexní difrakční mřížka
Jako monochromátoru, sloužícího k izolaci spektrálního intervalu, ve kterém se nachází
příslušná absorpční rezonanční čára sledovaného prvku, se většinou užívá interferometricky
zhotovených (holografických) mřížek pro rozsah vlnových délek 190 až 900 nm. Mřížkové
monochromátory se v AAS užívají téměř výhradně konstrukce Czerny-Turner
Nároky na jejich rozlišovací schopnost nejsou příliš veliké, protože zdroj primárního záření
emituje dostatečně úzké čára.
6.7.2. Optický hranol
Nejstarší disperzní prvek, optický hranol, využívající rozdílného lomu různých vlnových
délek se pro svoji malou účinnost již nepoužívá. Svoje uplatnění však nachází v současné
době v tzv. Echelleho uspořádání, které kombinuje optický hranol jako vstupní člen a za něj
se umísťuje optická mřížka, která primárně rozložené světlo ještě dále jemně disperguje.
Štěrbiny (vstupní a výstupní ) monochromátoru jsou zpravidla zpřažené. Spektrální interval je
nutné volit tak, aby byl zajištěn dostatečně velký tok záření a současně, aby na detektor
neprocházelo záření blízkých (neabsorbovaných) čar spektra z primárního zdroje. Volba
spektrálního intervalu je u přístroje pro AAS zpravidla v rozmezí 0,1-2,0 nm.
6.8. Detektory; fotonásobič
Pro detekci záření se využívá především fotonásobič. Výhodou fotonásobiče je vysoká
citlivost a velmi nízká čásová konstanta (10-8
- 10-8
s). Závislost výstupního proudu na
intenzitě zářivého toku je lineární přes 5-6 řádů. Celkový registrovaný proud fotonásobiče je
součtem těchto složek
a) temného proudu fotonásobiče;
115
b) proudu odpovídajícího záření emitovaného atomizátorem (plamen, stěny kyvety);
c) vlastního proudu vyvolaného dopadem primárního záření.
Užitečnou informaci nese pouze třetí složka a je proto snaha oddělit ji od ostatních. Z toho
důvodu se primární záření moduluje obdélníkovými pulsy (moduluje se napájecí proud
výbojek – frekvence cca 500 Hz); střídavá složka je pak oddělena v synchronním
demodulátoru, který je ovládán řídícími signály modulátoru. Řídící signály ovládají tyto
demodulační obvody tak, že jsou zesíleny pouze signály s frekvencí shodnou s modulační
správnou fází.Tak se dosáhne odlišení signálů nesoucích potřebnou informaci od parazitních
stejnosměrných signálů a zároveň se potlačí veškeré složky šumu, kromě šumu o frekvenci
shodné s modulační. Výsledný signál je registrován buď analogovým zařízením nebo se
převádí na digitální formu umožňující další matematické zpracování.
6.9. Korekce pozadí
Primární záření může být při průchodu absorpčním prostředím zeslabeno nejen volnými
atomy sledovaného prvku, ale i nespecifickou absorpcí (absorpcí pozadí).Absorpce pozadí je
způsobena rozptylem světla na nevypařených pevných částicích a molekulární
absorpcí.Rozptyl světla je velmi závislý na vlnové délce a projevuje se především v oblasti
krátkých vlnových délek; molekulární absorpce se projevuje v celém rozsahu používaných
vlnových délek.Molekulární absorpce je způsobena hlavně přítomností nedisociovaných
molekul anorganických solí z rozloženého vzorku v optické cestě. Nespecifická absorpce se
při měření přičítá k signálu analytu a vyvolává tak vždy pozitivní chybu, která může být
značná zvláště při práci s ETA a malou koncentrací analytu ve vzorku. Vzhledem k aditivním
vlastnostem absorbance můžeme pro získání správného výsledku odečíst od celkové
absorbance signál pozadí.
Korekci pozadí můžeme provádět sekvenčně nebo simultánně.
6.9.1. Sekvenční korekce pozadí
Sekvenční korekce pozadí se provádí dvojím odečtem absorbance; při prvním měření se zjistí
celková absorbance na vlnové délce analytu; při druhém měření se zjistí absorpce pozadí na
jiné vlnové délce blízké čáře analytu (třeba i pomocí výbojky pro jiný prvek).
6.9.2. Simultánní korekce pozadí
Simultánní korekce pozadí se u dnešních přístrojů provádí třemi způsoby:
a) pomocí kontinuálního záření s deuteriovou D2 výbojkou
b) použití Zeemanova jevu přímého a inverzního
c) metodou Smith-Hieftje
116
Schematické vysvětlení uvedených způsobů korekce pozadí je na obr. 123
6.9.2.1. Systém s deuteriovou výbojkou
Kompenzace pozadí se zdrojem kontinuálního záření je nejdéle používanou metodou a stále
patří k nejpoužívanějším. Měření je prováděno tak, že absorpční prostředí je střídavě
ozařováno (přes polopropustné zrcadlo s posunutím fáze modulace napájecího proudu obou
117
výbojek) výbojkou s dutou katodou a deuteriovou výbojkou. Na detektoru je registrován
rozdílový absorpční signál, který odpovídá absorpci čistého analytu.
Na obr. Je také vysvětlen princip „deuteriové korekce“. Výstupní štěrbinou monochromátoru
je izolován spektrální inetrval Δλ=0,5, kterým je z emisního spektra výbojky s dutou katodou
vybrána rezonanční čára analytu λ a z kontinuální spektra deuteriové výbojky je izolován pás,
odpovídající šířce spektrálního intervalu. Na počátku měření je upravena intenzita záření
výbojky s dutou katodou a D2 výbojky na stejnou hodnotu.
Měříme-li signál analytu bez pozadí, pomocí výbojky s dutou katodou naměříme absorbanci
A=0,600, která odpovídá skutečné koncentraci analytu. Měříme-li nyní signál tohoto analytu
pomocí deuteriové výbojky naměříme pouze zanedbatelnou absorbanci A=0,005 (tj.
0,6*0,004/0,5) . Získaná absorbance je menší než 1 % absorbance získané pomocí výbojky
s dutou katodou a můžeme ji tedy zanedbat.
Měříme-li signál analytu s pozadím, pomocí výbojky s dutou katodou naměříme absorbanci
A=1,000, která odpovídá součtu absorbance analytu 0,600 a absorbance pozadí A=0,400.
Měříme-li nyní tento signál deuteriovou výbojkou, naměříme absorbanci A=0,405..A=0,400,
tedy pouze absorpci pozadí. Rozdílový signál těchto absorbancí dává výslednou absorbanci
čistého analytu A=1,000-0,400=0,600.
Deuteriová korekce pozadí je použitelná pouze pro vlnové délky λ<350 nm, pro větší λ je
potřeba použít halogenovou výbojku. Korekce pozadí s D2 výbojkou dává správné výsledky
pouze tehdy, není-li pozadí výrazně strukturální (není výskyt ostrých pásů odpovídající
rotačním nebo vybračním přechodům).
6.9.2.2. Systém Zeeman
Kompenzace pozadí „systému Zeeman“ je založena na Zeemanově jevu, kdy v silném
magnetickém poli dochází ke štěpení energetických hladin atomu.
Přístroj má umístěn v poli elektromagnetu buď zdroj primárního záření (přímý Zeeman) nebo
atomizátor (inverzní Zeeman); zároveň přístroj obsahuje polarizátor (pevný nebo rotační).
Měření je prováděno tak, že absorbance je střídavě odečítána při vypnutém a zapnutém
magnetickém poli. Na detektoru je registrován rozdílový absorpční signál, který odpovídá
absorpci čistého analytu.
Čára odpovídající přechodu singletové série 1s0 - 1p1 se v silném magnetickém poli štěpí na
tři komponenty. Složka polarizovaná rovnoběžně s magnetickým polem je označována jako
komponenta π a má zachovanou stejnou frekvenci a tedy i vlnovou délku λ odpovídající
118
spektrální čáře a zůstává neposunuta. Dvě složky polarizované ve směru kolmém
k magnetickému poli jsou označovány jako komponenty σ a jsou posunuty o – Δλ a + Δλ od
původní vlnové délky. Posun těchto složek je úměrný síle magnetického pole. Neposunuté π
komponenty použijeme pro měření celkové absorbance a posunuté σ komponenty
použijeme pro měření pozadí. K rozlišení složek π a σ se využívá jejich rozdílné polarizace.
Konkrétní způsob měření závisí na konstrukci přístroje. Nejčastěji je v komerčních přístrojích
používán elektromagnet s magnetickým polem modulovaným střídavým proudem a kolmým
k optické ose a pevný polarizátor. Při vypnutém magnetickém poli je změřena celková
absorbance odpovídající absorpci analytu a pozadí. Při zapnutém magnetickém poli je pak
měřena pouze absorpce pozadí pomocí σ komponent, které projdou polarizátorem. Rozdílem
těchto signálů získáme korigovaných signál odpovídající stanovovanému prvku obr. 124.
Výhodou tohoto způsobu kompenzace pozadí je nejlepší korekce strukturního pozadí a
korekce v celém spektrálním intervalu. Nevýhodou je výskyt maxim na kalibračních křivkách,
částečný pokles citlivosti a instrumentální a cenová náročnost.
6.9.2.3. Systém Smith-Hieftje
Kompenzace pozadí „systémem Smith-Hieftje“ je založena na rozšíření profylu čáry výbojky
s dutou katodou. Při zvyšování napájecího proudu výbojky dochází totiž k silnému rozšíření
emitované čáry, která přejde až k samozvratu. Měření je prováděno tak, že výbojka s dutou
katodou je napájena v určitém cyklu. Tento cyklus se skládá z pulzu normálního napájecího
proudu, z krátkého pulzu vysokého napájecího proudu a z relaxačního pulzu o velmi malém
proudu. Použitím tohoto cyklu nedojde prakticky ke snížení životnosti výbojky.
Absorbance, kterou odečteme při normálním napájecím proudu odpovídá součtu absorpce
analytu a pozadí.Absorbance při vysokoproudovém pulzu pak odpovídá pouze absorpci
pozadí. Rozdílový signál pak odpovídá absorpci záření atomy analytu.
Výhodou tohoto způsobu korekce je lepší kompenzace strukturního pozadí (ve srovnání s D2
výbojkou), jediný zdroj záření a kompenzace v celém intervalu používaných vlnových délek.
Nevýhodou je snížení citlivosti (40 %).
6.10. Interference
O tom, jak se bude chovat signál měřeného vzorku a standardu o stejné koncentraci může
rozhodovat řada různých tzv. interferencí, rušivých vlivů, které mohou velmi zásadně ovlivnit
výsledek a správnost měření. Interferencí v AAS obecně rozumíme vliv, který způsobí
systematické odchylky velikosti signálu při analýze.
celková absorbance
absorbance pozadí
korigovaná absorbance
119
Lze rozlišovat spektrální a nespektrální interference.
6.10.1. Spektrální interference
Spektrálním interferencí, které jsou způsobeny nedokonalou izolací měřené spektrální čáry od
záření, absorbovaného ostatními složkami vzorku nebo absorpcí pozadí, se lze vyhnout
volbou jiných čar pro analýzu a korekci pozadí.
6.10.2. Nespektrální interference
Nespektrální interference lze zpravidla přisoudit vlastnostem vzorku a přítomnosti
doprovodných složek, tj. rušivých prvků matrice. Ve svých důsledcích se poněkud liší pro
plamenovou atomizaci a ETA.
V plameni se mohou uplatnit rušivé vlivy transportu, které souvisejí se změnami rychlosti
sání vzorku, účinností zmlžování a množstvím desolvatovaného podílu. Dále jsou to rušivé
vlivy vypařování, které jsou ovlivněny rychlostí vypařování (tzn. že méně těkavé sloučeniny
prvku snižují signál proti těkavějším sloučeninám téhož prvku). Rozptýlením sledované
složky v těkavější rušící složce se signál prvku sledované složky zvyšuje; vázáním prvku
např. do komplexu se signál prvku snižuje aj).Interference v plynné fázi ovlivňují disociaci
nebo ionizaci (např. u alkalických kovů v plameni acetylén-vzduch), případně se týkají
prostorového rozložení volných atomů v plameni. Odstranění rušivých vlivů vypařování lze
dosáhnou shodou těkavosti měřených roztoků, častěji se však využívá tzv. uvolňovacího
efektu: přidá se další složka, která rušivou složku přednostně převede na těžko těkavou
sloučeninu. Ionizačním interferencím v plynné fázi lze zabránit přídavkem snadno
ionizovatelného prvku, tzv. ionizačního pufru, např. roztok cesia.
Při použití ETA může docházet k interferencím ztrátami ve fázi tepelného zpracování vzorku
při nevhodném teplotním režimu, interference v plynné fázi lze přičíst změnám v disociaci či
ionizaci nebo kinetice procesu atomizace. Při použití ETA jsou v pracovních návodech údaje
o teplotním režimu zpravidla jen přibližné, protože velmi záleží na složení analyzovaného
vzorku. Proto je potřeba podmínky pro různé materiály znovu ověřit.
Při přípravě vhodných srovnávacích roztoků je nutné vliv interferencí posoudit a případně
zahrnout do kalibračního procesu. Podle přípravy použitých srovnávacích roztoků pak lze
rozlišovat kalibraci na čisté roztoky stanovovaného prvku obsahující prvek stejné sloučeniny
ve stejném rozpouštědle, a za přítomnosti stejných kyselin, solí atd.; na pufrované srovnávací
roztoky, které podobně jako roztok vzorku obsahuje stejné množství uvolňovacího nebo
ionizačního pufru a na modelové srovnávací roztoky, které se chemickým složením co nejvíce
blíží složením roztoku vzorku.
6.11. Analytické aplikace
Pomocí techniky AAS lze analyzovat velice různorové vzorky, její výhodou je vysoká
specifičnost stanovení a to jak kovů, tak některých nekovů (celkem asi 70prvků). Lze proto
stanovovat prvky bez předcházející separace. Řada prvků, které se snadno atomizují, se
stanovuje v plameni přibližně od 0,1 µg.ml-1
. Při ultrastopové analýze s ETA se pak tato mez
snižuje o 3 řády. Citlivost stanovení, zpravidla vyjadřovaná jako směrnice závislosti
absorbance na koncentraci prvku v roztoku, se v AAS u jednotlivých prvků častěji vyjadřuje
jako koncentrace prvku v měřeném roztoku, která za uvedených podmínek způsobí signál
velikosti 1 % absorpce (0,0044jednotek absorbance) a nazývá se charakteristická koncentrace
( v jdenotkách µg.ml-1
, rozměr ppm/1 % absorpce). Pro daný prvek se zjišťuje při zvolené
rezonanční čáře za optimálních podmínek atomizace čistých standardních roztoků prvku.
120
AAS jako analytická metoda je metodou relativní, srovnávací, tzn. Že výsledek získáme
porovnáním signálu rozotku vzorku se signálem roztoku standardů, které se musí složením
blížit analyzovanému vzorku (zejména pro eliminaci rušivých vlivů transportu).
V medicínské laboratoři se nejčastěji používá pro stanovení koncentrace esenciálních
stopových prvků (zinek, měď, selen) v séru a moči a železa v moči. Z toxických stopových
prvků je rozšířené použití AAS při stanovení olova, rtuti a hliníku.
Při analýze se příprava roztoků vzorků neomezuje jenom na vodné roztoky, ale lze použít i
nevodných rozpouštědel; např při extrakčním zakoncentrování analytu. Podobně je možné při
ETA dávkovat do kyvety suspenze pevných látek nebo přímo pevný vzorek.
Literatura:
Welz B., Sperling M: Atomis Absorption Spectrometry. Third, Compl. Revised Edition.
WILEY-VCH Verlag GmbH, 2005
Němcová I., Čermáková L., Rychlovský P.: Spektrometrické analytické metody I. Vydala
Univerzita Karlova, Praha 1997, ISBN 80-7184-365-2
Komárek J.: Atomová absorpční spektrometrie. Masarykova Univerzita 2000, ISBN 802-102-
500X
Atomová absorpční spektrometrie; UNICAME; Manuál metod; Chromspec s r.o.; 1991
An Introduction to Background Correction in Atomic Absorption Spektrometry; Sigurds
Skujins; Varian AG; 1992
Dastych M.: Instrumentální technika obor Zdravotní laborant. Masarykova univerzita 2007,
ISBN 978-80-210-4226-1
121
7. Imunoanalytické metody
Imunoanalytické metody jsou založeny na reakci antigenu a specifické protilátky za vzniku
imunokomplexu. U typické imunoanalytické metody antigen tvoří stanovovaný analyt a jako
protilátka je využívána reagencie.
7.1. Antigeny
Antigeny jsou markomolekuly přirozeného nebo umělého původu. Po chemické stránce se
jedná o proteiny, karbohydráty, nukleové kyseliny, lipidy aj. Na vlastní reakci antigenu s
protilátkou se neúčastní celá molekula antigenu, pouze některé její povrchové skupiny, tzv.
determinantní skupiny neboli epitopy. Antigenní determinantu představuje určitá skupina
atomů (část struktury, funkční skupiny) na povrchu molekuly antigenu a charakterizuje jeho
specifitu a schopnost reagovat s vazebným místem protilátky. Antigenní molekula musí mít
dostatečně velkou molekulovou hmotnost (Mr > 5000 Da) - velikost a musí mít kompletní
strukturu. Jedna molekula antigenu může na svém povrchu nést různé množství antigenních
determinant. Počet epitopů reagujících s vazebným místem protilátek udává valenci
antigenů.
Antigeny vyvolávají v živém organismu tvorbu specifických protilátek. Imunitní odpověď
může vyvolat pouze kompletní antigen. Nekompletní antigen – hapten (např. léky,
nízkomolekulární peptidy, hormony aj.) – vyvolá tvorbu protilátek pouze tehdy, je-li navázán
na bílkovinný nosič.
Obr. 125 Antigeny – hapten, nosič, determinanty
7.2. Protilátky
Protilátky jsou bílkoviny vznikající v organizmu jako jeho odpověď na přítomnost antigenů.
Vykazují specifickou vazebnou aktivitu k antigenu, proti kterému byly připraveny. Jsou to
imunoglobuliny, v laboratorní praxi jsou obsaženy v tzv. antisérech. Z analytického pohledu
je převládající imunochemickou reagencií imunoglobin G. Specificita a senzitivita
imunoanalytických metod je ovlivněna používanou protilátkou. Polyklonální protilátky (viz
obr.126) se připravují imunizací zvířat, obvykle opakovaným intravenózním podáváním
antigenu (nejčastěji lidské sérum). Potom je odebrána krev a získáno sérum bohaté na
protilátky, které nazýváme antisérum. Jsou vždy směsí různých protilátek proti jednotlivým
vazebným místům nebo epitopům antigenu. Komerční antiséra proti lidským sérovým
bílkovinám jsou buď monovalentní (obsahují protilátky proti jedné stanovované bílkovině)
nebo polyvalentní (obsahují protilátky proti mnoha bílkovinám).
Monoklonální protilátky (viz obr.126) jsou produkovány technologií buněčných hybridomů,
vytvořených z lymfocytů a nádorových buněk, které po vyčištění a selekci produkují stejné
imunoglobulinové molekuly protilátky. Představují homogenní směs protilátek proti jedné
122
antigenní determinantě (jednomu epitopu multivalentního antigenu). S monoklonální
protilátkou se dosahuje vyšší specificity stanovení.
Ob. 126 Polyklonální a monoklonální protilátky
7.3. Interakce antigen – protilátka
Síla interakce mezi protilátkou a antigenem je popsána jako afinita a avidita.
Afinita vyjadřuje intenzitu s jakou se uskutečňuje interakce mezi vazebným místem protilátky
a epitopem antigenu. Antigeny obsahují několik epitopů, proto byl zaveden pojem avidita.
Avidita je síla, se kterou polyvalentní protilátka interaguje s polyvalentním antigenem. Avidita
vzrůstá s afinitou jednoho vazebného místa pro jeden antigen a s počtem simultánně se
uplatňujících vazebných míst (suma všech interakcí mezi protilátkou a antigenem). Avidita
zahrnuje afinitu, která je dána příspěvky všech vzniklých vazeb mezi antigenem a protilátkou
a další nespecifické faktory, které ovlivňují vazbu mezi antigenem a protilátkou. Na vazbě
antigen – protilátka se podílí několik vazebných sil. Jedná se o nekovalentní interakce jako
elektrostatická interakce, vodíkové můstky,Van der Waalsovy síly, hydrofobní síly a iontové
interakce hlavně mezi COOa
NH4
+
skupinami antigenu a protilátky.
7.4. Rozdělení imunoanalytických metod z různých hledisek
Podle uspořádání reakce
 Kompetitivní (soutěživá) imunoanalýza
 Nekompetitivní (nesoutěživá, sendvičová) imunoanalýza
Podle prostředí
 Homogenní imunoanalýza
 Heterogenní imunoanalýza
Podle techniky použité k měření signálu
 Luminiscenční imunoanalýza
 Fluoroimunoanalýza
 Enzymoimunoanalýza
 Radioimunoanalýza
Podle použité značky
 Luminofory
 Fluorofory
 Enzymy
 Substráty
 Radioizotopy
123
Bez značení
 Imunoturbidimetrie
 Imunonefelometrie
Podle způsobu provedení
 Automatizované analýzy
 Manuální analýzy
7.5. Kompetitivní (soutěživé) metody
Stanovovaný antigen soutěží se stejným značeným antigenem, ve vazbě na specifickou
protilátku proti stanovovanému antigenu, která je v limitovaném množství. Vzniknou
imunokomplexy obsahující značku a imunokomplexy bez značky. Čím je koncentrace
stanovovaného antigenu vyšší, tím více vznikne imunokomplexů bez značky.
Po ukončené reakci měříme signál u imunokoplexů se značkou. Velikost odezvy je nepřímo
závislá na koncentraci stanovovaného analytu. Dle typu značky měříme luminiscenci,
fluorescenci, případně další veličiny.
Kalibrační křivka má hyperbolický tvar.
Metoda je vhodná pro nízkomolekulární analyty s malou molekulou, které mají pouze jednu
antigenní determinantu (např. T3, steroidní hormony, vitamín B12, folát, teofylin, fenytoin).
7.6. Nekompetitivní (nesoutěživé) metody (sendvičová technika)
Stanovovaný antigen ze vzorku reaguje se dvěma protilátkami, které jsou v reakční směsi
v přebytku. Jedna protilátka bývá značená, funkce druhé protilátky závisí na použité
technologii (u heterogenní imunoanalýzy je navázána na pevnou fázi a umožňuje separaci
imunokomplexu). Ve vzniklém imunokomplexu je analyt (antigen) vázán mezi dvěma
protilátkami (sendvič).
Velikost měřeného signálu je přímo úměrná koncentraci stanovovaného antigenu (parabolický
tvar kalibrační křivky).
Metoda se používá pro větší molekuly (molekuly s vyšší molekulovou hmotností), které
umožňují vazbu protilátek na dvě determinanty - např. TSH, ferritin, nádorové antigeny, PSA,
S100, srdeční troponiny, osteomarkery aj. Používají se dvě monoklonální nebo jedna
monoklonální a jedna polyklonální protilátka.
Jestliže se při reakci využívají monoklonální protilátky specifické pro určitý epitop, je možné
provádět simultánní inkubaci vzorku a konjugátu s ukotvenou protilátkou, což stanovení
zjednodušuje. Nekompetitivní imunostanovení se provádí jak v simultánním tak v sekvenčním
módu. Je-li při simultánní analýze přítomna vysoká koncentrace stanovovaného analytu, může
tento reagovat současně se značenou i ukotvenou protilátkou. Koncentrace tvořeného
komplexu je pak falešně snížena – projeví se tzv. Hook – efekt. U automatizovaných metod je
však tomuto problému softwarově zabráněno pomocí chybového hlášení.
124
Obr. 127 Kalibrační závislosti u kompetitivního a nekompetitivního uspořádání
7.7. Heterogenní imunoanalýza
U této techniky se z reakční směsi odstraňují různými způsoby (např. magnetickou separací
nebo ukotvením na pevném nosiči a promytím) nepotřebné reaktanty nebo imunokomplexy.
Separuje se značka volná od značky vázané. Reakce s detekcí proběhne až po této separaci.
Stanovení obecně probíhá v následujících krocích – smíchání komponent, inkubace (vznik
komplexu antigen-protilátka), separace a detekce.
7.8. Homogenní imunoanalýza
Homogenní stanovení nevyžadují separaci vázané a volné značené protilátky nebo antigenu.
U této techniky není tedy třeba odstraňovat reaktanty, stanovení a detekce probíhá přímo
v reakční směsi. V těchto případech je aktivita značky navázané na antigen modulovaná
přímo navázáním protilátky. Reakční postupy jsou tak jednodušší a rychlejší. (O
neznačených imunoanalytických metodách je pojednáno v kapitole Analytická a
perianalytická automatizace a robotizace.)
Literatura:
16. Bishop M.L., Fody E.P., Schoeff L.E.: Clinical Chemistry Techniques, Principles,
Correlation. 2010, ISBN 978-0-7817-9045-1.
17. Burtis C:A:, ASHWOOD E:R:, Bruns D.E.: Tietz Fundamentals of Clinical
Chemistry. 2008, ISBN 978-0-7216-3865-2.
18. Dastych M., Breinek P. a kol.: Klinická biochemie. 2008, ISBN 978-80-210-4572-9.
125
8. Využití luminiscence v imunoanalýze
8.1. Luminiscence
je jev představující vyzařování přebytečné energie ve formě fotonů, ke kterému dochází při
návratu excitovaných elektronů na základní hladiny. Tato produkce (emise) světla vzniká
následně po excitaci atomů působením jiného záření, elektronů nebo při chemické reakci
apod. a po jejich návratu do základního stavu.
Lze také říci, že luminiscence je děj, při němž záření o kratší vlnové délce (větší frekvenci)
vyvolává v látce určitého složení vznik záření o delší vlnové délce (nižší frekvenci) a část
energie se vyzáří ve formě tepla (nesvítivé deexcitační procesy).
Existují excitované energetické hladiny, na nichž může atom setrvávat relativně dlouho (10-8
s
a déle). Tyto hladiny se nazývají metastabilní hladiny. Nahromadí-li se na takové hladině
atomy a pak postupně, nahodile, spontánně vyzařují, pozorujeme jev zvaný luminiscence.
8.1.1. Druhy luminiscence
Ke vzniku luminiscence je třeba dodat látce energii v různé podobě. Podle druhu energie,
která se přeměňuje na „studené světlo“, rozlišujeme několik druhů luminiscence:
 Fotoluminiscence – luminiscence je vyvolána elektromagnetickým zářením (zářivky) - do
této kategorie patří fluorescence a fosforescence.
 Chemiluminiscence – luminiscence je vyvolána chemickou reakcí (sem patří také
bioluminiscence, kdy je emise světelného záření vytvořena živými organizmy – světlušky,
medúzy).
 Elektroluminiscence – luminiscence je vyvolána elektrickým polem (reklamní panely,
nouzové osvětlení).
 Katodoluminiscence – luminiscence je vyvolána dopadajícími elektrony (stínítko
televizní obrazovky).
 Termoluminiscence – luminiscence je vyvolána vzrůstem teploty po předchozím dodání
energie.
 Radioluminiscence – luminiscence je vyvolána působením radioaktivního záření.
 Triboluminiscence – luminiscence je vyvolána působením tlaku (při deformaci tělesa).
 Sonoluminiscence - vyvolána dopadem ultrazvuku.
V laboratorní medicíně je využívaná chemiluminiscence a fluorescence.
8.2. Fotoluminiscence
Fotoluminiscence se dělí podle délky trvání na fluorescenci a fosforescenci. Dochází k ní
vlivem absorpce energie dopadajícího světelného záření. Pokud po odstranění zdroje
ozařování látky luminiscence rychle vymizí, hovoříme o fluorescenci. Pokud luminiscence
přetrvává (doznívá) i po odstranění zdroje ozařování, jedná se o fosforescenci.
126
Proces fotoluminiscence může být vyjádřen vztahem:
kde X a X*
je základní a excitovaný stav molekuly, hν a hν´
vyjadřuje dopadající a
emitovanou světelnou energii.
Emitovaná energie záření je nižší než energie dopadajícího (primárního) záření, proto má
emitované (sekundární) záření nižší frekvenci a tudíž i delší vlnovou délku než světelné
záření primární.
Rozdíl mezi vlnovou délkou excitačního a emitujícího záření se označuje jako Stokesův
posun.
8.2.1. Fluorescence
Fluorescence je přechod mezi tzv. povolenými stavy atomu a k vyzáření fotonů dojde již za
pár nanosekund (krátkodobé světélkování - 10-8
až 10-5
s). Fluorescence tedy představuje
sekundární záření po absorpci elektromagnetického záření. Od fosforescence se liší dobou,
po kterou trvá sekundární záření, když přestalo působit záření primární, tzv. dosvitem.
U anorganických látek se fluorescence projevuje poměrně zřídka (např. u solí vzácných
zemin, uranu, thallia). U organických látek se fluorescence objevuje častěji. Nejintenzivnější a
analyticky nejvíce využitelná je u sloučenin s aromatickými cykly. Intenzita emitovaného
fluorescenčního záření je proporcionální počtu fluoreskujících molekul, tj. jejich koncentrací.
Tento vztah však platí pouze pro zředěné roztoky.
Fluorescenční spektrum je posunuto k delším vlnovým délkám než původní absorpční
spektrum (Stokesův posun) a zaujímá zrcadlovou pozici – viz obr.128.
λ →
← ν
Obr.128 Absorpční a fluorescenční spektrum
X + hν  X*
 X + hν´
127
Fluorimetr
Fluorimetr má mnohé společné součásti s UV/VIS spektrofotometrem - viz obr. 129.
 zdroj světelného záření
 monochromátor pro
výběr excitačního záření
 kyveta/vzorek
 monochromátor pro
sekundární (emisní)
záření
 detektor
Obr.129 Schéma a hlavní součásti spektrofluorimetru
Jako zdroj světelného záření se většinou používá xenonová nebo xenonová-rtuťová oblouková
výbojka.
Kyvety jsou vyrobeny z křemenného skla nebo z čistého křemene.
Detektor, většinou fotonásobič, je umístěn v pravém úhlu, kolmo ke směru dopadajícího
primárního světelného záření.
8.2.2. Fosforescence
Fosforescence proti tomu je přechod tzv. zakázaný. Také při fosforescenci se fotony vyzáří,
ale trvá to déle, často několik minut (dlouhodobé světélkování - 10-2
s až několik dní).
Fosforescence nemá v klinické laboratoři praktické využití.
8.3. Chemiluminiscence
Chemiluminiscence je druh luminiscence vyvolaný energií chemické reakce. Vzniká
vyzářením fotonu z molekuly luminoforu po jeho chemické oxidaci působením oxidantů
(H2O2, O2,…). Při chemiluminiscenci dochází k produkci světelného záření exitovanými
molekulami v průběhu chemické reakce. Přirozenou formou chemiluminiscence v přírodě je
bioluminiscence označující chemiluminiscenci v živých organismech.
Chemiluminiscence může být vyjádřena vztahem:
A + B  X*
 P + hν
Kde A a B jsou reaktanty, X*
je excitovaný meziprodukt, P je produkt v základním stavu a hν
je energie emitovaného světelného záření. Chemiluminiscenční reakce většinou zahrnuje
oxidaci organické sloučeniny produkující nestabilní excitovaný meziprodukt. Některé
chemiluminiscenční reaktanty produkují světlo v podobě záblesků („flash“) jiné vyzařují
světlo po delší dobu („glow“).
Jako chemiluminiscenční značka se často používá akridinium ester. Akridinium ester je při
chemiluminiscenční reakci v alkalickém prostředí oxidován peroxidem vodíku.
Luminometr
☼ Mexct
t
Vzorek
Memis
D
128
Zařízení pro měření chemiluminiscence je poměrně jednoduché. Skládá se z měrné komůrky a
detektoru, nejčastěji fotonásobiče. Měrná komůrka se vzorkem a ostatními reaktanty obsahuje
systém zrcadel, která soustřeďují co nejvíce světelného záření na detektor. Jestliže při
chemiluminiscenční reakci vznikají záblesky světla, využívá se počítání fotonů. Počet fotonů
zachycený citlivým fotonásobičem s velmi rychlou odezvou je proporcionální produktu
chemiluminiscenční reakce.
Hlavní výhodou chemiluminiscence je její extrémní citlivost. Množství produkovaného světla
je úměrné počtu molekul, které emitují světelné záblesky.
8.4. Luminofory, Fluorofory
Látky, u nichž dochází k luminiscenci, se označují jako luminofory.
Z organických látek jsou to převážně pevné látky s příměsí vytvářející tzv. luminiscenční
centra (např. ZnS, CdS s příměsí Ag, Cu, Mg aj.).
Většina fluoreskujících organických molekul obsahuje konjugované dvojné vazby. Spontánně
fluoreskuje jen málo biologických molekul - např. tryptofan a některé porfyriny. Spontánně
nefluoreskující molekuly mohou být převedeny na fluoreskující produkty. Lze také využít
látky, které při určitých chemických reakcích produkují chemiluminiscenční záření.
Při imunoanalytických reakcích jsou fluorofory a luminofory navázány jako značka na
protilátky či antigeny nebo tvoří substrát, eventuelně vznikají až po jeho rozštěpení.
Využívají se následující látky:
 Akridin a jeho estery
 Adamantyl dioxetan
 Methylumbelliferon (MU)
 Cheláty platinových kovů (ruténium)
 Cheláty lanthanidů (europium)
 Luminol, isoluminol
 Fluorescein
8.5. Využití luminiscence
Luminiscence nalezla široké využití zejména v optoelektronice (luminiscenční diody, stínítka
obrazovek apod.), v lékařství (luminiscenční značky, luminiscenční sondy), v chemii (ke
kvantitativnímu a kvalitativnímu stanovení látek).
Imunoanalytické metody s fluorescenční nebo luminiscenční detekcí jsou citlivější a
specifičtější než absorpční nebo turbidimetrické metody, zvláště v případě velmi nízkých
koncentrací.
U fluorometrických metod při nízké koncentraci stanovovaného analytu je zaznamenána
nízká absorbance, tj. velmi malý rozdíl mezi dopadajícím a vycházejícím zářením (I je téměř
stejně vysoké jako I0). Při fluorimetrickém měření se zaznamenává pouze emitované záření
proti velmi slabému pozadí, proto je měření mnohem přesnější. Fluorescence je také
129
specifičtější, protože existuje jen málo přirozených fluoroforů, které by mohly působit
interferenci.
8.6. Využití luminiscence na automatických imunochemických analyzátorech
Spojení luminiscenčních technik a imunoanalýzy představují automatické imunochemické
analyzátory, na kterých se v současnosti provádí většina imunoanalytických metod
v laboratorní medicíně. Takové analyzátory jsou na trhu značně rozšířené. Vyznačují se
vysokou citlivostí, takže jsou pro stanovení analytů obsažených v biologických materiálech
v nízkých koncentracích velmi vhodné. Nejrozšířenější jsou analyzátory využívající detekci
na principu chemiluminiscence případně fluorescence. Luminofory používané ke značení
nemají interference v biologických materiálech (sérum, plasma), které se na
imunochemických analyzátorech analyzují.
Velkou výhodou automatizace v klinické biochemii je možnost provedení klinických a
imunoanalytických metod z jedné zkumavky. Imunochemické analyzátory našly uplatnění
také v sérologických laboratořích a na transfuzních stanicích.
8.6.1. Imunochemické analyzátory
Automatické imunochemické analyzátory se na trhu objevily koncem 80. let. Uplatňují se pro
analyty přítomné v biologických materiálech v nízké koncentraci (nmol/l, pmol/l), jako jsou
hormony, vitamíny, tumormarkery, kardiomarkery apod.
Analyzátory využívají reakce antigen – protilátka založené jak na kompetitivním tak i
nekompetitivním principu. Rozšířenější než homogenní je heterogenní imunoanalýza, která
pracuje se značenou protilátkou či antigenem.
Detekce využívá vysoce citlivých reakcí jako chemiluminiscence, elektrochemiluminiscence,
fluorescence..
Doba analýzy se nejčastěji pohybuje mezi 15 – 30 minutami.
Přístroje využívají výhradně plastové reakční nádobky na jedno použití.
Analyzátory jsou opatřeny čtečkou čárového kódu, umožňují tak jednoznačnou identifikaci
pacienta. Požadavky pro jednotlivé analýzy jsou přijímány z laboratorního informačního
systému (LIS) a analýza pak probíhá automaticky bez zásahu obsluhy.
Jedná se výhradně o uzavřené systémy, tzn. mohou pracovat výhradně s reagenciemi výrobce
(dodavatele) přístroje a v naprosté většině případů jsou dodávány reagencie kazetové. Detekce
sraženiny, kapaliny a pěny patří ke standardní výbavě.
Cena imunoanalytických vyšetření je poměrně vysoká. Pohybuje se mezi 50 – 200
Kč/vyšetření, ale nové testy na trhu mohou stát až 1000 Kč.
Principy využívané jednotlivými firmami se liší typem značky, separace a detekce.
Oddělení komplexu antigen - protilátka se nejčastěji provádí separací na paramagnetických
mikročásticích. Jedná se o oxidy železa, které vykazují magnetické vlastnosti. Na svém
povrchu, který je mnohonásobně větší než stěny reakční nádobky, mají mikročástice vazebná
místa pro navázání stanovovaných a značených analytů. Po proběhlé imunoanalytické reakci
je třeba z reakční směsi odstranit pro detekci nepotřebné součásti. Působením magnetu se
mikročástice s navázaným imunokomplexem během promývání přidrží na stěně reakční
nádobky.
Kalibrace
130
K výpočtu koncentrace stanovovaných analytů na imunoanalytických analyzátorech slouží
nelineární kalibrační závislosti využívající kubické polynomy. Výrobce většinou dodává tzv.
master křivku a zákazník ji při kalibraci pouze koriguje na aktuální podmínky.
Detekční limit
Chemiluminiscenční a fluorescenční techniky patří k nejcitlivějším metodikám. Detekční
limit se pohybuje v řádech fento až zeptomolů (10-15
až 10-21
molu).
8.7. Chemiluminiscenční techniky na imunochemických analyzátorech – heterogenní
imunoanalýza
8.7.1. Chemiluminiscence s využitím akridinium esteru
Princip měření: systém měří kvantitativní množství světla emitované během
chemiluminiscenční reakce, pevnou fázi tvoří paramagnetické částice, značkou je
akridinium ester - chemiluminiscenční látka, která emituje světlo při oxidaci H2O2 v
alkalickém prostředí v přítomnosti detergentu (Triton X-100). Reakce probíhá během jedné
sekundy a je velice citlivá (10-15
).
Obr. 130 Advia Centaur, firma Siemens
Přístroj pracující na tomto principu je Advia Centaur (obr.6) od firmy Siemens (doba analýzy
15 minut, výměna reagencií za chodu) nebo imunochemický modul Architect i2000SR firmy
Abbott (technologie ChemiFlex CMIA, velikost reagenčních souprav 100 a 500 testů).
Příklad: Stanovení hCG sendvičovou metodou
Používá se konstantní množství dvou protilátek. První je polyklonální kozí protilátka proti
hCG, označená akridinium esterem. Druhá, monoklonální myší protilátka proti hCG je
kovalentně vázaná na paramagnetické částice. Tyto dvě protilátky jsou specifické pro odlišné
přítomné epitopy, free beta subjednotku a beta subjednotku intaktní molekuly. Po smíchání
složek reakce probíhá inkubace a tvorba imunokomplexu – viz obr.131.
131
Obr. 131 Tvorba imunokomplexu na systému Advia Centaur
Po inkubaci systém magneticky odseparuje komplex antigen – protilátky s paramagnetickými
částicemi a promyje částice – viz obr.132.
Obr. 132 Magnetická separace komplexu na systému Advia Centaur
Po separaci, odsátí a promytí se přidá peroxid vodíku a v luminometru NaOH, který
inicializuje chemiluminiscenční reakci.
8.7.2. Enzymově zesílená chemiluminiscence
Princip měření: Ke konjugátu navázanému na reakční kuličce nebo paramagnetických
mikročásticích a značenému alkalickou fosfatázou je přidán luminogenní substrát dioxetan
fosfát. Účinkem alkalické fosfatázy se odštěpí fosfát a dioxetanfosfát se přemění na dioxetan.
Ze substrátu vzniká nestabilní anion, při jehož rozkladu dojde k emisi fotonů
(chemiluminiscenční reakce) – viz obr.133.
132
Obr.133 Vznik chemiluminiscence při rozkladu dioxetan fosfátu
Na tomto principu pracují přístroje Immulite 2000 (Immulite 2500) od firmy Siemens
(velmi obsáhlá nabídka stanovení, dlouhá doba inkubace – 35 nebo 70 minut, pevnou fázi
tvoří jedna velká kulička) nebo Beckman Coulter Unicel Dxl 800 (obr.134), firma
Danaher (vysoký výkon – 400 testů/hodinu, doplňování reagencií a spotřebního materiálu
za plného provozu).
Obr.134 Unicel Dxl 800, firma Danaher
8.7.3. Elektrochemiluminiscence
Princip měření: Metodika využívá protilátky (případně antigeny) značené ruténium(II) trisbipyridylovým
komplexem a další protilátky či antigen s navázaným biotinem.
Paramagnetické kuličky jsou potažené streptavidinem. Afinita biotin-avidin je extrémně
vysoká, takže dojde k navázání imunochemického komplexu na mikročástice.
Elektrochemiluminiscence vzniká v průtokové měřící cele po reakci imunokomplexu
značeného chelátem ruthenia s tripropylaminem na povrchu elektrody a po vložení napětí na
platinovou elektrodu (oxidace na anodě). Magnetické kuličky zajistí zachycení
133
imunokomplexu na povrchu elektrody, nenavázané reagencie i značka jsou odstraněny
promytím.
Na tomto principu pracují imunochemické přístroje nebo imunochemické moduly firmy
Roche – např. modul e 601 systému Cobas 6000 nebo modul e602 systému Cobas 8000
(délka inkubace – 9 , 18 nebo 27 minut).
Příklad: Sendvičové uspořádání - viz obr.135
• Protilátky reagují s antigenem ve vzorku (např. TSH) za tvorby sendvičového
komplexu.
• Firma využívá většinou monoklonální protilátky.
• Po přidání mikročástic potažených streptavidinem se komplex váže na pevnou fázi
interakcí biotinu se streptavidinem.
• Mikročástice se zachycují magnetickým polem na povrchu elektrody.
• Po přidání substrátu tripropylaminu a přivedení napětí na elektrody vzniká
elektrochemiluminiscenční emise – ruthéniový komplex uvolní na elektrodě elektron
za vzniku Ru(bpy)3 3+ kationu.
• Ruthéniový marker se po luminiscenční reakci regeneruje.
Obr. 135 Elektroluminiscence, firma Roche – nekompetitivní princip – např. stanovení TSH
8.8. Chemiluminiscenční techniky na imunochemických analyzátorech – homogenní
imunoanalýza
8.8.1. Technologie LOCI
134
Jedná se o vysoce citlivou první homogenní imunoanalytickou metodu s chemiluminiscenční
detekcí, která je založena na přenosu kyslíku.
Princip měření: Technologie pracuje s dvěma latexovými kuličkami – jedna obsahuje
olefinové barvivo a protilátku specifickou pro analyzovanou metodu (chemibead), druhá je
potažená streptavidinem a obsahuje barvivo, které generuje singletový kyslík (sensibead). Do
reakce kromě stanovovaného analytu vstupuje také biotinylovaná protilátka specifická pro
analyt. Dojde k vytvoření imunokomplexu ze všech popsaných komponent. Po osvětlení
komplexu se z sensibead uvolní singletový kyslík, pronikne do chemibead a uvolní
chemiluminiscenční záření.
Technologie LOCI byla představena na přístroji Dimension Vista 1500 Intelligent Lab
Systém od firmy Siemens (integrovaný systém využívající mimo fotometrii, ISE a
chemiluminiscence také nefelometrii, první homogenní imunoanalýza s chemiluminiscenční
detekcí – na trhu od r. 2011).
8.9. Fluorescenční techniky na imunochemických analyzátorech - heterogenní
imunoanalýza
8.9.1. MEIA
(Enzymová imunoanalýza na mikročásticích - Microparticle Enzyme Immunoassay)
Princip měření: Tato technika patří mezi heterogenní enzymovou imunoanalýzu na
mikročásticích, ve které je imunokomplex značený enzymem alkalickou fosfatázou.
Jako fluorogenní substrát se používá 4-metylumbelliferylfosfát (MUP), s kterým reaguje
enzym alkalická fosfatáza z imunokomplexu. Při defosforylaci substrátu vzniká 4metylumbelliferon
(MU) a po jeho excitaci vzniká fluorescenční záření.
Jako světelný zdroj se používá Hg-výbojka ( = 365 nm), MU emituje fluorescenční záření
(= 448 nm).
Jedná se o jeden z principů, který využívá na trhu stále rozšířený analyzátor AxSYM od firmy
Abbott (robustnost, měřící principy – MEIA, FPIA) – viz obr.136.
Postup stanovení:
 Vzorek se dávkuje k reagencii s mikročásticemi a inkubuje se
 Separace od nepotřebné matrice a reagencií probíhá na válečku s inertními
skleněnými vlákny
 Přidá se konjugát s alkalickou fosfatázou
 Přidá se substrát 4-methylumbelliferylfosfát (MUP)
 Změří se fluorescenční záření
135
Obr.136 Axsym, firma Abbott
8.9.2. Technologie “Pegasus”
Princip měření: Heterogenní imunochemická technika, která jako pevou fázi využívá
mikročástice ze železitanu potaženého zirkoniem, které mají silnou vazebnou kapacitu k
biologicky aktivním molekulám. Metodika disponuje rychlou a efektivní separací a
fluorescenční detekcí při 450 nm.
Jedná se o technologii, kterou disponuje na trhu nepříliš rozšířený analyzátor Rad 120, firma
Radim.
8.10. Fluorescenční techniky na imunochemických analyzátorech - homogenní
imunoanalýza
8.10.1. TRACE (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) - Kryptor (Brahms)
Problémem fluoroimunoanalýzy bylo v minulosti fluorescenční pozadí vzorku. Problém
vyřešili time-resolved imunoanalytické techniky, které využívají chaláty vzácných zemin –
lantanidy. Jsou založeny na faktu, že fluorescenční záření chelátu lantanidu (např. europia)
vydrží déle ve srovnání s fluorescencí pozadí.
Princip měření: Metoda je založena na neradioaktivním přenosu energie z donoru
(kryptátová struktura s iontem europia v centru) na akceptor (chemicky modifikovaný
protein). Měření signálu emitovaného z imunokomplexu probíhá s časovým zpožděním.
Měřený vzorek je ozářen dusíkovým laserem, následně donor (kryptát) emituje fluorescenční
signál, po něm emituje signál akceptor.
Na principu TRACE technologie pracují přístroje řady Kryptor firmy Brahms (za
technologii s krátkou inkubační dobou, kde odpadají promývací a separační kroky, firma
získala Nobelovu cenu).
8.10.2. FPIA
(Fluorescenční polarizační imunoanalýza - Fluorescence Polarization Immunoassay)
Princip měření: Tato technika patří mezi homogenní kompetitivní immunoanalýzu, při které
136
soutěží stanovovaný analyt a analyt značený fluoresceinem o vazebná místa na specifické
protilátce. K excitaci se používá lineárně polarizované světlo ( = 485 nm - zdroj wolframová
lampa a polarizační filtr). Při návratu molekuly fluoroforu do základní stavu se měří emise
zeleného světla při 525-550 nm přes polarizační filtr a detekce se provádí fotonásobičem.
Měření se provádí ve dvou polarizačních rovinách vektikální a horizontální, výsledná
intenzita polarizovaného světla je nepřímo úměrná koncentraci stanovovaného antigenu.
Využívá se různé rychlosti rotace velkých a malých molekul (imunokomplexu a antigenu),
které vedou ke změně polarizace.
Malé molekuly (stanovovaný analyt a značený analyt) se otáčejí velkou rychlostí, po excitaci
polarizovaným světlem značený analyt emituje fluorescenční záření do mnoha směrů. Při
detekci polarizovaného světla se naměří pouze nízká intenzita tohoto záření. Je-li značený
analyt vázán na protilátku (imunokomplex: značený antigen-protilátka), dojde ke snížení
rychlosti rotace této velké molekuly, emitované světlo kmitá ve stejné rovině jako excitující –
při detekci se naměří vysoká intenzita záření. Čím vyšší koncentrace stanovovaného analytu,
tím více bude tohoto analytu navázáno na protilátku a tedy tím méně bude navázáno
značeného analytu, takže naměřené hodnoty fluorescence budou nízké a naopak při nízké
koncentraci naměříme hodnoty vysoké.
Stanovení je možné pouze v případě, že je významný rozdíl v rychlosti rotace malé molekuly
antigenu a velké molekuly imunokomplexu a lze použít pouze pro stanovení koncentrace
malých antigenů (např. léků) – viz obr.137.
Fluorescenční polarizace se měří na přístroji podobném fluorimetru. Navíc jsou do optické
osy přístroje mezi dopadající (primární, excitační) záření a vycházející (sekundární, emisní)
záření vloženy polarizátory. Excitační polarizátor musí být schopen velmi rychle měnit
polarizaci světla ve dvou na sebe kolmých osách. Tuto funkci zastává polarizátor z tekutých
krystalů.
Obr.137 FPIA – zjednodušené schéma měření
Jedná se o jeden z principů, který využívá na trhu stále rozšířený analyzátor AxSYM od firmy
Abbott.
Pozn.: Fluorescenční detekci využívají rovněž tzv. multiplexové metody popsané v kapitole o
flow cytometrii.
8.11. Diagnostický přínos
137
Diagnostický přínos imunoanalytických metod založených na principu chemiluminiscence a
fluorescence je vzhledem k velkému počtu takto stanovovaných analytů velmi různorodý.
Stanovení hormonů lze využít např. při monitorování funkce štítné žlázy (hormony TSH,
T4,T3); stanovení tumorových markerů při sledování vývoje, vlivu léčby a případné remise
nádorového onemocnění (např. PSA); stanovení kardiomarkerů (zejména troponinu T nebo I)
k potvrzení infarktu myokardu a zjištění jeho rozsahu; stanovení hladiny léků k ověření, že
aplikovaná dávka je pro daného pacienta v terapeutickém rozmezí atd.
Literatura:
19. Bishop M.L., Fody E.P., Schoeff L.E.: Clinical Chemistry Techniques, Principles,
Correlation. 2010, ISBN 978-0-7817-9045-1.
20. Burtis C:A:, ASHWOOD E:R:, Bruns D.E.: Tietz Fundamentals of Clinical
Chemistry. 2008, ISBN 978-0-7216-3865-2.
21. Dastych M.: Instrumentální technika. 2007, ISBN 978-80-210-4226-1.
22. www.abbott.com – převzato 16.2.2011.
23. www.beckmancoulter.eu – převzato 3.5.2011.
24. www.lacomed.cz – převzato 4.7.2011.
25. www.roche-diagnostic.cz – převzato 9.1.2011.
26. www.medical.siemens.com – převzato 6.7.2011.
138
9. ELISA - Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
ELISA je imunochemická analytická metoda určená ke kvantitativnímu stanovení analytu
v neznámém vzorku. Imunochemické reakce tvoří základ pro kvantitativní analýzu, která má
vysokou citlivost a specificitu. ELISA patří do skupiny metod EIA (enzyme immunoassay),
které používají enzym ke značení protilátky nebo antigenu. U ELISA stanovení, enzym po
přidání substrátu do reakční směsi katalyzuje reakci, na jejímž konci je barevný produkt
vhodný k fotometrické detekci.
9.1. ELISA stanovení
ELISA techniky patří mezi heterogenní imunochemické stanovení. ELISA používá ke
značkování komplexu antigen-protilátka enzymy. Stanovení probíhá na pevné fázi, kde buď
antigen nebo protilátky jsou absorbovány na povrch pevného nosiče.
Pro správné provedení ELISA techniky je nutné splnit řadu předpokladů:
antigen nebo protilátka musí být navázán na povrch nosiče bez ztráty imunoreaktivity.
stabilita enzymů a také imunologická reaktivita konjugátu (komplex AbAg*) musí být během
reakce stabilní.
aktivita enzymů, které jsou použity při značkování, se nemůže přirozeně vyskytovat v
analyzovaných biologických tekutinách.
použité enzymy musí mít vysokou specifickou aktivitu, tj. přeměňují velká množství substrátu
na detekovaný produkt.
Protilátky
Protilátky používané při ELISA metodách mohou být monoklonální i polyklonální. Mohou
být použity ve formě roztoku nebo imobilizované na pevném nosiči. Při technikách ELISA
mohou protilátky vystupovat v neznačené podobě nebo ve formě konjugátů (značené
enzymem).
Antigeny
Antigeny jsou získávány purifikací z přírodního materiálu nebo rekombinantní technologií.
Jsou používány jako enzymové konjugáty (značené enzymem) buď v rozpustné nebo
imobilizované formě.
Enzymové konjugáty
Enzymové konjugáty jsou buď antigeny nebo protilátky kovalentně navázané na vybraný
enzym. Při přípravě konjugátu lze postupovat tak, že protilátky a enzymy jsou nekovalentně
značkovány biotinem a pak se využívá jeho silné vazebné afinity k streptavidinu. Streptavidin
má pro biotin čtyři vazebná místa a jen některé reagují s biotinylovanou protilátkou, zbylá
vazebná místa mohou sloužit jako receptory pro biotinem značený enzym. Celý postup tak
může být zkrácen použitím biotinem značené protilátky a enzymem značeného streptavidinu
(obrázek č.138).
139
Obrázek 138
Enzymy používané ke značení protilátky (antigenu)
Je nutné vybrat co nejvhodnější enzym pro účely značení protilátky nebo antigenu. Enzym
musí být stabilní, struktura enzymu musí umožnit vytvoření kovalentní vazby s protilátkou či
antigenem, nesmí dojít k výraznému ovlivnění katalytické aktivity enzymu. Enzym by měl
mít co nejnižší molekulovou hmotnost, aby velikost molekuly neovlivňovala imunochemické
reakce. Produkt enzymové reakce musí být snadno detekovatelný i ve velmi nízkých
koncentracích. Enzym by měl mít co nejvyšší katalytickou aktivitu a měl by být dostupný v
potřebné čistotě.
Pro značení se při ELISA metodách používají nejčastěji tyto enzymy a substráty (tab.č.1):
Enzym substrát produkt
Křenová
peroxidáza (HRP
– peroxidáse, EC
1.11.1.7)–
v přítomnosti
substrátu
peroxidu vodíku
oxiduje
chromogenní
látky
3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidin (TMB) Je možné měřit přímo
výsledný produkt, který
má modré zbarvení,
spektrofotometrická
detekce při 370 nm,
nebo lze reakci zastavit
pomocí stop činidla
(1M kys. sírová) , tím
se změní zbarvení na
žluté a detekce je při
450 nm
2,2´-azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát)
ABTS
Výsledný produkt
reakce má zelené
zbarvení, detekce při
405 nm
alkalická
fosfatáza (EC
3.1.3.1)
p-nitrofenylfosfát Výsledný produkt má
žluté zbarvení, detekce
při 405 (410) nm
β – D -
galaktosidáza(EC
3.2.1.23)
o-nitrofenyl – β – D –galaktopyranosid Výsledný
ortonitrofenolový
produkt má žluté
zbarvení, detekce při
420 nm
Tabulka 1
140
9.1.1. Rozdělení ELISA technik podle typu reakce antigen –protilátka
Kompetitivní heterogenní imunoanalýza
Protilátka je pevně vázána na stěnu jamky mikrotitrační destičky (obrázek č.139 A). Po
přidání stanovovaného vzorku probíhá inkubace, kdy o vazebné místo na protilátce soutěží
značený antigen a neznačený antigen (analyt) ze vzorku (C). Zastoupení obou forem antigenu
na protilátce odpovídá jejich relativním koncentracím. Přebytek nenavázaného antigenu
(značeného i neznačeného – tzv. volná frakce), který nezreagoval, se vymyje pomocí
promývacího roztoku (D). Po přidání substrátu se změří intenzita barevného zbarvení
vytvořeného barevného produktu (F). Platí zde nepřímá úměra: čím vyšší koncentrace analytu
(neznačeného antigenu), tím nižší intenzita zbarvení (tím méně navázaného značeného
antigenu).
A.Pevná fáze s navázaným B.smíchání značeného a C. kompetitivní reakce
limitovaným množstvým protilátky neznačeného Ag značeného a
neznačeného antigenu
o vazbu na protilátce
D. Separace volné a E.přídavek substrátu – F.
vázané frakce přeměna substrátu na
barevný produkt
Obrázek: 139 Schéma kompetitivní heterogenní ELISA metody
Spektrofotometrická
detekce barevného
produktu
141
Kompetitivní ELISA metodu lze použít i ke stanovení protilátek. Na povrchu jamky
mikrotitrační destičky je ukotven antigen a v tomto případě soutěží neznačené protilátky
z analyzovaného vzorku se značenými protilátkami (z reagencie, o známé koncentraci) o
vazbu na antigenu. Opět zde platí nepřímá úměra.
Nekompetitivní heterogenní imunoanalýza (sendvičová)
Je to nejvíce používaná ELISA metoda . Na první protilátku navázanou na stěně jamky
mikrotitrační destičky (obrázek č.140 A) se naváže antigen (analyt) ze vzorku (B,C).
Proběhne první inkubace. Po vytvoření imunokomplexu (antigen – 1. protilátka) se z reakční
směsi promytím odstraní nenavázaná frakce (D). Poté se přidá druhá protilátka značená
enzymen (tzv. konjugát), která je namířena proti druhé antigenní determinantě na stejném
antigenu (E). Po druhé inkubaci je vytvořen „sendvičový“ komplex (F). Dále je provedeno
druhé promytí, kdy dojde k separaci nadbytečného nenavázaného konjugátu (G). Po přidání
substrátu se změří intenzita barevného zbarvení vytvořeného barevného produktu (H,I). Platí
zde přímá úměra: čím vyšší koncentrace analytu, tím vyšší intenzita zbarvení.
A. pevná fáze B. přidání vzorku C. reakce antigenu s 1.
s navázanou 1. protilátkou obsahujíciho antigen protilátkou
v nadbytku
D.separace volné a E.přidání 2. protilátky F.vznik
vázané frakce značené enzymem v nadbytku „sendvičového“
komplexu
142
G.separace volné a H.přídavek substrátu – I.
vázané frakce přeměna substrátu na
barevný produkt
Obrázek 140 Schéma nekompetitivní heterogenní ELISA metody
9.1.2. Využití ELISA metod
Výhodou ELISA metod je, že jsou citlivé, specifické a mají nízké pořizovací náklady na
technickou instrumentaci. Nevýhodou je analýza vzorků pouze v sériích, časová náročnost
(doba jedné inkubace je více než 30 min., obvykle 1-2 hod. ),manuální pipetování. Vzorky
nelze ředit během analyzované série. ELISA metody lze použít pro stanovení
nízkomolekulárních látek, jako jsou proteiny, karbohydráty, nukleové kyseliny, lipidy aj.,
v různých typech biologického materiálu. Nejčastěji jsou analyzovány vzorky séra, plazmy,
moče, mozkomíšního moku, tkáně nebo lyzáty buněk. ELISA metody mají široké uplatnění
ve zdravotnických laboratořích hlavně v imunologii a mikrobiologii (méně v biochemii nebo
hematologii), kde se používají pro stanovení např. infekčních agens nebo protilátek.
9.1.3. Technická instrumentace
ELISA metody se provádí ve speciálních nádobkách uspořádaných do tzv. mikrotitračních
destiček. (obrázek č.141). Každá destička obsahuje 96 jamek uspořádaných ve 12 řadách po 8
jamkách.
Obrázek: 141 Mikrotitrační destička
Mikrotitrační destičky vyžadují při promývání použití speciálních osmikanálových pipet nebo
automatických ELISA promývaček. Pokud to metoda vyžaduje, lze během inkubace
mikrotitrační destičku umístit do třepačky s možností nastavení intenzity třepání a inkubační
teploty. Pro měření výsledného produktu detekční reakce se používají speciální vertikální
spektrofotometry - ELISA readry mikrotitračních destiček.
9.1.3.1. ELISA reader (vertikální spektrofotometr)
Spektrofotometr je uspořádán tak, že světelný paprsek prochází optickým prostředím ve
vertikálním směru. ELISA reader měří absorbanci světelného záření v jamkách
mikrotitračních destiček.
Princip
Spektrofotometrická
detekce barevného
produktu
143
Světelný paprsek ze zdroje prochází přes zvolený interferenční filtr (podle požadované vlnové
délky) do optických kabelů, které zabezpečují distribuci do 9 oddělených kanálů. 8 z nich
vedou přes jamky mikrotitrační destičky a dopadají na pole fotodiod, které detekují intenzitu
světla. Devátý optický kabel je použit na kontrolu intenzity záření vycházejícího ze zdroje
(obrázek č.142). Ve zlomku vteřiny se změří celá řada jamek (8), mikrotitrační destička se
posune a může se měřit řada následující.
Obrázek: 142 Uspořádání vertikálního spektrofotometru
Součásti vertikálního fotometru:
Jako zdroj záření se nejčastěji používá halogenová žárovka nebo xenonová
výbojka.Interferenční filtry jsou umístěny v posuvném držáku filtrů,obvykle se používá 6
filtrů (pro λ 400-800 nm).Optický systém se skládá 9 optických kabelů (světlovodiče), štěrbin
a zrcadel pro vedení světelného paprsku ze zdroje do optického prostředí (jamka mikrotitrační
destičky). Jako detektor se používají fotodiody.Rychlost měření je 5s (celá mikrotitrační
destička - 96 jamek).
Vztah mezi změřeným signálem (absorpcí) a koncentrací se určuje kalibrací. Obvykle se
změří absorbance 6-ti standardních roztoků o známé vzrůstající koncentraci a blank ( slepý
pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky) při určité vlnové délce. Při ELISA metodě se
vyžaduje měření všech vzorků v duplikátech. Poté software přístroje sestrojí kalibrační křivku
(naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y,hodnoty koncentrace na ose x), ze které
odečte hodnoty koncentrací neznámých vzorků.
Při vertikální fotometrii závisí dosažené výsledky měření pouze na přesnosti pipetování
kalibrátorů, kontrolních materiálů a vzorků. Jamka mikrotitrační destičky určená k měření má
vždy konstantní plochu kruhové základny a pro stejnou koncentraci je konstantní součin
absorbance a délky optické dráhy roztokem.
Lambertův-Beerův-Bougnerův zákon pro absorpční fotometrii ( A=εcl) :
c
A1l1 = A2l2 =
ε
kde: A = absorbance, l = délka optické dráhy, c = koncentrace analytu, ε = molární absorbční
koeficient pro danou vlnovou délku
Když napipetujeme např. ke stejnému množství vzorku méně činidla, zkrátí se optická dráha
roztokem (tj. tloušťka vrstvy roztoku), ale měřený roztok bude mít větší absorbanci a
výsledná koncentrace bude stejná jako v prvním případě. Tato výhoda vertikální fotometrie v
144
praxi znamená to, že i při poměrně krátké optické dráze (» 3 mm) a i s nepřesným ručním
pipetováním vzorků a reagencií, kde je běžná chyba 10 %, získáme solidní výsledky.
Kromě možnosti použití samostatného ELISA readeru, promývačky mikrotitrčních destiček a
třepačky laboratoře s velkým množstvím vzorků využívají ELISA automatické linky.
9.1.3.2. ELISA automatická linka
Automatická linka provádí automatické pipetování vzorků, reagencií, kalibrátorů a kontrol
pomocí pipetovacího systému (2, 4, 8 jehel). Má zabudovanou čtečku čárového kódu, což
umožňuje pozitivní identifikaci pacientských vzorků. Linka má obvykle 3-4 místa pro
umístění mikrotitračních destiček. Dále sestává z inkubátoru (místo pro inkubaci vzorků),
promývačky a readeru mikrotitračních destiček. Transport destiček mezi jednotlivými částmi
provádí pomocí robotického ramene. Systém provádí automatické ředění vzorků a je opatřen
softwarem pro automatické vyhodnocení měření.
Velkou výhodou automatické linky je použití čárových kódů, a tím zabránění záměny mezi
vzorky. Dále je to přesnost pipetování vzorků a reagencií, vysoká kapacita přístroje.
Nevýhodou je vyšší spotřeba používaných reagencií.
145
10. DELFIA
Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay
DELFIA patří mezi fluoroimunoanalytické metody, byla vyvinula finskou firmou Wallac Oy (nyní
Perkin-Elmer)
DELFIA je velmi citlivá a specifická metoda pro stanovení nízko- i vysokomolekulárních analytů,
využívá časově modulované měření fluorescence chelátu lanthanidů (europium, terbium, sammarium,
příp. dysprosium).
10.1. Princip metody:
Principem DELFIA je imunochemická reakce, v níž jsou buď protilátka nebo antigen označeny
fluorescenční sondou – stabilním chelátem lanthanidu, nejčastěji europia.
Po proběhlé imunochemické reakci je stabilní chelát, kterým je vzniklý komplex označen, přeměněn
na sloučeninu s intenzivní fluorescencí (opět chelát lanthanidu, ale s odlišnými vlastnostmi). Tato
fluorescence je dlouhodobá (řádově stovky mikrosekund) s velkým rozdílem mezi vlnovou délkou
excitace a fluorescence (tzv. Stokesův posun).
10.1.1. Chelátové značení protilátek Obr.: Chelát
Cheláty jsou komplexní (koordinační) sloučeniny centrálního atomu (v
tomto případě lanthanidu) a dvoj- nebo vícevazných ligandů, které
mohou s centrálním atomem uzavřít cyklická uspořádání (vykazují tzv.
chelátový efekt, tj. významné zvýšení stability komplexů ve srovnání
s jednovaznými ligandy).
Označení protilátky chelátem nesmí ovlivnit důležité vlastnosti protilátky
– afinitu, specificitu a rozpustnost; použitý chelát musí být hydrofilní,
stabilní a snadno navázatelný.
Pro značení protilátek nebo antigenů se používají nejčastěji cheláty
lanthanidu s polyaminopolyoctovými kyselinami jako vícevaznými
ligandy, obsahujícími i vhodnou funkční skupinu pro navázání na
protilátku nebo antigen.
Obr.: Příklady vhodných chelatačních činidel: izothiokyanátofenyl-deriváty kyselin
1) EDTA (etylendiamintetraoctová kyselina), 2) DTTA (dietylentriamintetraoctová kys.),
3) DTPA (dietylentriaminpentaoctová kys.) apod.
146
Značení protilátky chelátem – příklad reakce izothiokyanátové skupiny chelátu a aminoskupiny lysinu
v proteinovém řetězci protilátky při alkalickém pH uhličitanového pufru:
Po proběhlé reakci je značená protilátka od nadbytku nenavázaného chelátu oddělena gelovou filtrací
na koloně se Sephadexem: velké molekuly značené protilátky nepronikají do pórů v kuličkách gelu a
protékají tedy kolonou rychleji, malé molekuly chelátu jsou zadržovány v pórech. Eluát vytékající
z gelové kolony je monitorován při 280 nm a jímá se odpovídající frakce.
Obr. : Separace značené protilátky a volného chelátu gelovou filtrací
Vzniklý značený protein nevykazuje fluorescenci, je dostatečně termodynamicky stabilní, aby bylo
možné jej dlouhodobě skladovat a natolik kineticky stabilní, aby bylo možné jej použít i v prostředí
s nadbytkem jiných iontů a chelatačních činidel.
Pro malé molekuly (značené antigeny) se místo gelové filtrace používá technika HPLC.
10.1.2. Imunochemická reakce
Vlastní imunochemická reakce může mít kompetitivní i nekompetitivní uspořádání. V prvém případě
je fluorescenční sondou značen antigen, v druhém případě protilátka.
147
Obr.: Příklad reakce v kompetitivním uspořádání
(fluorescence nepřímo úměrná koncentraci analytu)
Obr..: Příklad imunoreakce v nekompetitivním
uspořádání (intenzita fluorescence přímo úměrná
koncentraci analytu ve vzorku)
Pozn.: Pracuje se většinou v mikrotitračních destičkách s jednou specifickou protilátkou (obvykle
monoklonální) vázanou na pevné fázi.
10.1.3. Disociace lanthanidu z komplexu, vznik fluorescenčních chelátů
Ion lanthanidu je z komplexu odtržen vlivem kyselého pH (hodnota pH méně než 4) a přeměněn na
vysoce fluorescenční chelát přidáním přebytku vhodného luminogenního ligandu (při kyselém pH
neinterferují původní ligandy).
Vhodnými ligandy jsou β-diketony obecného vzorce R1-C(=O)-CH2-C(=O)-R2 , kde R1 je nejčastěji
světlo absorbující aromatická skupina, např. naftyl-, benzofuryl-, furyl-, thienyl-, atd. a R2 je
fluorovaný uhlovodíkový zbytek, který v molekule zajišťuje optimální rozložení elektronové hustoty
pro tvorbu komplexu. Ligand se váže na koordinační místo lanthanidu svými dvěma ketoskupinami.
Výběr luminogenního ligandu závisí na energetických požadavcích konkrétního lanthanidu –
excitovaná energetická (tripletová) hladina ligandu musí ležet mírně výše než emisní hladina iontu,
aby mohlo dojít k optimálnímu přenosu energie z ligandu na centrální ion.
Obr.: Emisní energetické hladiny lanthanidů Sm, Eu, Tb
a Dy ve srovnání s excitovanou tripletovou hladinou
aromatického (naftoyltrifluoro-aceton) a alifatického
(hexafluoroacetyl-aceton) β-diketonu:
Je patrné, že v důsledku rozdílu emisních hladin Eu3+
a
Sm3+
ve srovnání s Tb3+
a Dy3+
je problematické najít
univerzální ligand, např. naftoyltrifluoro-aceton
optimální pro Eu3+
neexcituje Tb3+
a Dy3+
a naopak
hexafluoroacetyl-aceton optimální pro Tb3+
je méně
vhodný pro Eu3+
a Sm3+
.
Pozn.: Mezi energií a vlnovou délkou emitovaného záření je
nepřímá úměra: ΔE = (h . c) / λ h…Planckova konstanta, c…rychlost světla, λ…vlnová délka
Fluorescence chelátů Eu a Sm má větší vlnovou délku než je tomu v případě Tb a Dy.
148
Kyselý reakční roztok kromě luminogenních ligandů obsahuje detergent a pomocnou reagencii TOPO
(tri-n-oktylfosfinoxid), která spolu s detergentem udržuje výsledný chelát ve formě micel a tím jej
chrání před molekulami vody, které by zhášely fluorescenci.
10.1.4. Časově modulované měření fluorescence (time-resolved fluorometry), TRF:
Fluorescence nového chelátu je intenzivní a dlouhodobá - doba emise (decay time) je řádově stovky
mikrosekund, tedy mnohem delší než u běžných fluoroforů, což umožňuje využití časově
modulovaného měření fluorescence: Vzorek je pulzně excitován určitou vlnovou délkou světelného
záření (např. 340 nm) s frekvencí okolo 1 milisekundy. Detekce fluorescenčního záření se pomocí
složité elektroniky začne měřit se zpožděním stovek mikrosekund (v době, kdy už vyhasla
fluorescence pozadí, která je podstatně kratší – řádově nanosekundy) a vlastní měření trvá také řádově
stovky mikrosekund. Měření se provádí opakovaně a načítá se za vybraný časový interval 1000 a
vícekrát (za jednu sekundu se dá načítat 1000 měření při frekvenci excitace 1 milisekunda).
Pro praktické aplikace se dává přednost chelátům europia, protože jejich fluorescence přetrvává
nejdéle ve srovnání s ostatními lanthanidy (Eu – až 1 ms, Tb – stovky μs, Sm a Dy – desítky μs).
Flurescenční spektrum chelátů lanthanidů vykazuje intenzivní úzké emisní píky a velký Stokesův
posun: vzorek je excitován při 340 nm a fluorescence se měří v dlouhovlnné oblasti spektra, např.
v případě Eu v červené oblasti – 620 nm (zde už není interference pozadí).
Obr.: časový průběh fluorescence chelátu Eu Obr.: Stokesův posun
Převzato z http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73257FLY_DELFIAApplicationsOfTRF.pdf
Díky specifickým vlastnostem fluorescence chelátů lanthanidů, které umožňují spektrální i časové
odfiltrování pozadí, je DELFIA metodou velmi specifickou a citlivou - detekční limit 10 attomol (10-17
mol) europia v jamce mikrotitrační destičky, tj. koncentrace Eu 10-14
– 10-15
mol/l.
149
10.1.5. Současné stanovení více analytů:
Vlastnosti fluorescence umožňují i současné stanovení více analytů:
Obr.: Příklad současného stanovení více
analytů:
Protilátka proti AFP je označena
chelátem Eu, protilátka proti β-HCG je
označena chelátem Sm. Díky úzkým
emisním píkům při různých vlnových
délkách (Eu 613 nm, Sm 643 nm) a různé
době trvání fluorescence Eu a Sm se
nepřekrývají ani vlnové délky, ani časy
odečtu jejich fluorescence, je tedy možné
je měřit paralelně.
Pozn.: Obrázky převzaty z:
http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73257FLY_DELFIAApplicationsOfTRF.pdf
Značení protilátek cheláty lanthanidů umožňuje paralelní stanovení až čtyř různých analytů. Při
použití chelátu Tb a Dy jako třetí a čtvrté fluorescenční značky vedle Eu a Sm je nutno použít
v reakční směsi ještě další luminogenní ligand (viz Obr.).
Měření fluorescence při současném stanovení více analytů se provádí na velmi kvalitních citlivých
fluorometrech s možností TRF a automatickou korekcí překryvu pro zachování maximální citlivosti a
specifičnosti stanovení (např. EnVision, VICTOR, WiewLux Multilabel Counters – Perkin-Elmer),
přesto stanovení čtvrtého analytu (využívající cheláty dysprosia) má o několik řádů horší citlivost.
10.2. Praktické provedení metody DELFIA:
Pracuje se nejčastěji v mikrotitračních destičkách v uspořádání 8x12 jamek s navázanou specifickou
protilátkou (obvykle monoklonální). Imunochemická reakce probíhá přímo v jamce mikrotitrační
destičky, vzniká komplex značený chelátem lanthanidu. K promytému komplexu se přidává tzv.
Enhancement Solution (zesilovací roztok) obsahující luminogenní ligand v silně kyselém pufru s
přídavkem detergenčního činidla. Stabilní chelát lanthanidu je jím odtržen z komplexu a přeměněn na
nový intenzivně fluoreskující chelát. Fluorescence se proměřuje pomocí fluorometru umožňujícího
časově modulované měření. Do prvních jamek destičky se dávkují kalibrátory. Pomocí těchto
kalibrátorů se sestrojí kalibrační křivka, podle které se odečítají jednotlivé analyzované vzorky.
150
Obr.: Praktické provedení metody DELFIA
Celý postup lze provádět „manuálně“ na přístrojové lince, metodu však lze plně automatizovat:
Obr.: Přístrojová linka DELFIA:
Razička terčíků - pro práci se suchou krevní skvrnou (1),
dávkovač činidel (2), třepačka pro mikrotitrační destičky
(3), odsávačka (4), promývačka (5), TRF fluorometr (6)
Obr.: AutoDELFIA:
Zde v uspořádání pro práci se suchou
krevní skvrnou (bez dávkovacího
modulu kapalných vzorků)
Obr.: Softwarově zpracovaná kalibrační křivka DELFIA
kompetitivní uspořádání (17-OH-P):
osa x…koncentrace nmol/l (logaritmická stupnice)
osa y…odezva B/Bmax
B…počet záblesků za sekundu
Bmax…maximální počet záblesků za sekundu
6 kalibračních hladin, měřeno v dubletu
sendvičové uspořádání (TSH):
osa x…koncentrace mIU/l (logaritmická stupnice)
osa y…odezva B/1000 (logaritmická stupnice)
B…počet záblesků za sekundu
6 kalibračních hladin, měřeno v dubletu
151
10.3. Příklady využití metody DELFIA:
Metodu DELFIA lze použít pro široké spektrum analytů. V principu lze chelátem lanthanidu označit
každou stabilní sloučeninu obsahující amino- nebo karboxyskupinu, která není esenciální pro
následnou tvorbu imunokomplexu. Pokud daná molekula takovou skupinu nemá, je možné připravit
synteticky její vhodný derivát.
Chelátem lanthanidu lze označit proteiny, peptidy, hormony, oligonukleotidy i malé organické
molekuly (steroidy, aminokyseliny, léky,…). Analytické postupy je možné vypracovat přímo
v laboratoři (včetně přípravy mikrotitračních destiček nebo chelátového značení protilátek pomocí
materiálu a reagencií dodávaných firmou Perkin-Elmer), pro některé analyty jsou dostupné
diagnostické sety a automatizované uzavřené analytické systémy.
10.3.1. Proteiny, hormony
Ve formě komerčně dodávaných kitů je dostupný např. kompletní tyroidní panel (TSH, T3, T4, fT3,
fT4, TBG včetně kitu pro stanovení protilátek proti tyroidní peroxidáze a tyreoglobulinu), panel
reprodukčních hormonů (HCG, FSH, LH, estradiol, progesteron, prolaktin, testosteron, SHBG), panel
pro screening v těhotenství (free-βHCG, HCG, estriol, AFP, PAPP-A), PSA, inzulin, růstový hormon,
cytokiny a další.
10.3.2. Novorozenecký screening
DELFIA je metoda vhodná pro stanovení analytů nejen v kapalném materiálu (sérum, plazma), ale
díky její citlivosti je možno ji použít i pro práci se suchou krevní skvrnou.
Pozn.: Suchá krevní skvrna (suchá krevní kapka, dry blood spot) je alternativní způsob odběru biologického
materiálu, vhodný zvláště pro odběry novorozenců. Jedná se o malé množství kapilární krve nasáklé do odběrové
kartičky ze speciálního filtračního papíru. Ze suché krevní kapky se vyráží terčík (nejlépe ze středu skvrny), ze
kterého se krev může vyextrahovat vhodným rozpouštědlem nebo pufrem a extrakt použít k analýze. Kalibrační
152
a kontrolní materiály pro stanovení analytů metodou DELFIA jsou rovněž ve formě suché krevní skvrny.
Obr.: Odběrový systém pro novorozenecký screening
Obr.15: Krevní skvrna po vyražení terčíku
DELFIA ve spojení s technikou suché krevní skvrny se stala ideálním řešením pro zavedení
celoplošného novorozeneckého screeningu některých dědičných chorob. V ČR se touto technikou
provádí screening kongenitální hypotyreózy (stanovení TSH), kongenitální adrenální hyperplázie
(stanovení 17-hydroxy-progesteronu, 17-OH-P) a cystické fibrózy (stanovení IRT - imunoreaktivního
trypsinogenu).
Pozn.: Metodu DELFIA lze plně automatizovat při práci s kapalným materiálem (plasma, sérum). Při práci se
suchou krevní skvrnou není dosud běžná automatizace prvního kroku (vyrážení terčíků).
10.3.3. Další možné aplikace
Stanovení aktivity kináz: Enzymy proteinkinázy fosforylují určité aminokyseliny v peptidickém
řetězci. Pomocí Eu-značených protilátek proti fosforylovaným aminokyselinám lze posoudit úroveň
fosforylace.
Metody s Eu-značenými oligonukleotidy: Eu-oligonukleotidy mohou být využity pro detekci a
kvantifikaci amplifikačních produktů např. pro detekci genových mutací, virů atd.
Metody založené na sledování syntézy DNA (např. studium buněčné proliferace): Do nově
syntetizovaných řetězců DNA je místo thymidinu zabudován pyrimidinový analog 5-bromo-2’deoxyuridine,
který je detegován imunochemicky Eu-značenými monoklonálními protilátkami.
Sledování interakcí ligand – receptor, je-li jeden z dvojice pomocí streptavidinu – biotinu fixován
na mikrotitrační destičce.
153
11. Potenciometrie, konduktometrie , polarografie, coulometrie
11.1. Potenciometrie
Princip: Potenciometrie je elektrochemická metoda, při které se měří rozdíl potenciálů
(napětí) při nulovém proudu mezi dvěma elektrodami, ponořenými do analyzovaného
roztoku. Jedna elektroda je měrná (indikační) a druhá srovnávací (referentní). Potenciál měrné
elektrody závisí na aktivitě (koncentraci) měřeného analytu ve zkoumaném vzorku, potenciál
srovnávací elektrody je konstantní, nezávislý na složení analyzovaného vzorku. Rozdíl
potenciálů se měří voltmetrem v milivoltech (mV) s velmi vysokým vstupním odporem (více
jak 1012
Ω). Vysoký vstupní odpor je nutný pro zajištění nulového proudu.
Obr. Potenciometrie – schéma uspořádání měřícího systému
Druhy elektrod
11.1.1. Srovnávací (referenční) elektrody
a) Vodíková elektroda
Referenční elektroda s nulovým potenciálem je standardní vodíková elektroda (skládá se
z kovové platiny potažené elektrolyticky vyloučenou houbovitou platinou (platinová čerň)
nasycenou plynným vodíkem, který je přiváděn pod tlakem 101.325 Pa. Elektroda je
ponořená do roztoku s jednotkovou aktivitou vodíkových iontů). Práce s vodíkovou
elektrodou je velmi komplikovaná a nepohodlná. Proto bylo zavedeno používání referenčních
elektrod, které sice nemají nulový potenciál, ale jejich potenciál je konstantní a známý. Jsou
složeny z kovu, který je potažen tenkou vrstvičkou jejich vlastní nerozpustné sloučeniny.
b) Kalomelová elektroda
Je tvořena rtutí, která je pokryta málo rozpustným chloridem rtuťným Hg2Cl2 (kalomelem) a
je ponořena do nasyceného roztoku KCl. Elektroda je ponořená do zkoumaného roztoku. Na
konci elektrody je tzv. elektrolytický spoj, který neumožňuje míchání zkoumaného roztoku
s roztokem KCl, ale je vhodný pro přenesení elektrických nábojů. Z Nernstovy rovnice lze
odvodit, že potenciál kalomelové elektrody je závislý na aktivitě chloridových iontů. Jesliže je
koncentrace KCl uvnitř kalomelové elektrody stálá (např. nasycený roztok KCl) je i potenciál
kalomelové elektrody stálý (E = 0,2412 V při 25 °C), nezávisle na tom, do jakého měřeného
roztoku je elektroda ponořená.
154
c) Argentchloridová (chloridostříbrná) elektroda
Je tvořena stříbrným drátkem potaženým vrstvou nerozpustného AgCl v roztoku 3mol/l KCl.
Na elektrodě probíhají následující rovnovážné reakce:
AgCl ↔ Ag+
+ Cl-
Ag+
+ e↔
Ag
Potenciál argentchloridové elektrody je stálý (E = 0,2042 V při 25 °C),
11.1.2. Měrné (indikační) elektrody
a) Skleněná elektroda – viz také kapitola analyzátory ABR
Patří mezi elektrody se skleněnou membránou, je naplněna roztokem HCl nebo pufrem (tedy
prostředím o konstantním pH), do které zasahuje stříbrný drátek. Potenciál vzniká na povrchu
skleněné membrány, výměnou H+
iontů z roztoku, do kterého je elektroda ponořena, za sodné
ionty z povrchu skla. Tato elektroda je někdy součástí tzv. kombinované elektrody, která
kromě této měrné elektrody obsahuje i elektrodu srovnávací. Elektrody mají skleněnou
membránu a zabudovaný externí referentní systém. (Ag/AgCl nebo Hg2Cl2). Vnější referentní
elektroda je většinou plněna nasyceným roztokem KCl.
155
Skleněná (měrná) a kalomelová referentní elektroda
Kombinovaná elektroda
Před vlastním měřením se na měřícím přístroji (pH-metr) musí zjistit teplota měřeného
roztoku a provést kalibraci přístroje pomocí standardních pufrů při zjištěné teplotě.
Příklady standardních pufrů
Pufr pH(+25o
C)
Hydrogenvínan draselný, nasycený roztok 3,557
0,05 mol/kg hydrogenftalan draselný 4,008
0,025 mol/kg KH2O4 + 0,025 mol/kg Na2HPO4 6,865
0,01 mol/kg tetraboritan sodný 9,180
Následuje vlastní měření pH. Po měření se elektroda uchovává nejčastěji v pufru. V současné
době má v klinické biochemii praktické využití skleněná elektroda pouze pro výše uvedená
měření H+
a Na+
vzhledem k dostatečné selektivitě v přítomnosti ostatních interferujících
iontů.
Životnost pH a Na+
skleněných elektrod v analyzátorech dosahuje 12 i více měsíců.
156
b) Severinghausova elektroda (pCO2) – viz kapitola Analyzátory ABR
Elektroda je příkladem aplikace použití skleněné pH-elektrody. Aktivita H+
měřená pH
elektrodou je úměrná parciálnímu tlaku CO2 (pCO2) ve zkoumaném vzorku.
c) ISE elektrody – viz kapitola ISE a biosenzory
Názvem iontově selektivní elektrody (ISE) jsou obvykle označována elektrochemická čidla,
která umožňují potenciometrická měření aktivity iontů ve vodných nebo smíšených
prostředích, případně parciálních tlaků plynů rozpuštěných v kapalinách.
Poločlánek, který představuje ISE ponořená do zkoumaného roztoku, sestává obvykle z
iontově selektivní membrány, vnitřního elektrolytu a vnitřní referentní elektrody, může být
schematicky zapsán např. pro konstrukci čidla primárně reagujícího na změny aktivity iontu
Q+
ve zkoumaném roztoku:
Ag AgCl vnitřní elektrolyt (Q+
, Cl)
 membrána selektivní k iontům Q+
 vzorek
Druhým poločlánkem je vnější srovnávací elektroda (kalomelová, argentochloridová apod.).
Hlavním požadavkem je, aby iontově selektivní membrána měrné elektrody dokonale
oddělovala zkoumaný roztok od vnitřního elektrolytu čidla a aby byla co nejméně atakována
rozpouštědly, s nimiž při měření přichází do styku.
11.2. Konduktometrie
Konduktometrie je založena na měření vodivosti analyzovaného elektrolytu, tedy na
schopnosti roztoku elektrolytu vést elektrický proud. Vodivost roztoku závisí především na
koncentraci iontů v roztoku. Elektrická vodivost (G) je převrácená hodnota odporu (R).
G = 1/R
Jednotkou vodivosti je siemens (S), jednotkou elektrického odporu je 1 Ohm.
Podle Ohmova zákona je proud (I) přímo úměrný napětí (U)a nepřímo úměrný odporu (R)
I =U / R
Odpor vodiče je přímo úměrný jeho délce l (vzdálenost elektrod) a nepřímo úměrný průřezu q
(plocha elektrod), p je měrný nebo-li specifický odpor.
R = p . l / q
Převrácená hodnota měrného odporu se nazývá měrná vodivost. Jednotkou měrné vodivosti je
siemens/m (S.m-1
).
Měření vodivosti se provádí pomocí konduktometrů. Vzdálenost elektrod i jejich plocha jsou
konstantní.
Princip. Na rozdíl od kovů, kde proud vedou elektrony, vedou v roztocích proud ionty. Do
měřeného roztoku se ponoří dvě elektrody ve formě platinových plíšků. Elekrody jsou
obklopené skleněným válečkem, který je zespodu otevřený; toto uspořádání se nazývá
vodivostní nádobka. Vlivem elektrického pole migrují kationty ke katodě a anionty k anodě.
Aby nedocházelo k polarizaci elektrod a k elektrolýze (k narušení povrchu elektrod) používá
se při měření střídavé napětí. V přítomnosti iontů v roztoku klesá odpor a roste vodivost, tj.
větší proud probíhá mezi elektrodami. Elektrický proud je potom proporcionální vodivosti
roztoku.
Využití.
 V klinické biochemii se principu měření vodivosti používá především při sledování
kvality vody pro analytické účely. Vodivost vody, používané automatickými
biochemickými analyzátory nesmí překročit hodnotu 1µS.m-1
, pro potřeby HPLC
hodnotu 0,1µS.m-1
. Úpravny vody v laboratořích jsou vybaveny průtokovými
konduktometry, sloužící ke kontinuálnímu měření vodivosti protékající vody.
157
 Konduktometrii lze využít i v analytických metodách, pokud je výsledkem chemické
reakce vznik iontů, které vedou k proporcionálnímu zvýšení vodivosti. Příkladem je
enzymatické stanovení močoviny v séru. Ureáza v reakční směsi působí přeměnu
močoviny na ionty NH4
+
, které úměrně koncetraci močoviny zvýší vodivost (Urea
Analyser Beckman).
 Nižší vodivosti erytrocytů proti plazmě se využívá při konduktometrickém měření
hematokritu krve. Takto změřená hodnota hematokritu je jen orientační, protože ji
ovliňuje celá řada dalších okolností. Přes tato omezení je konduktometrické měření
hematokritu častou součástí analyzátorů ABR parametrů, iontů a krevních plynů pro
svoji jednoduchost.
 Dalším využitím konduktometrie je použití vodivostních detektorů u kapalinové nebo
plynové chromatografie(LC, GC).
Laboratorní konduktometr Průtokový konduktometr pro měření
vodivosti protékající vody v úpravnách vody
11.3. Polarografie (voltametrie)
Objevitelem polarografie je Prof.Jaroslav Heyrovský, který za svůj objev z roku 1922 obdržel
v roce 1959 jako dosud jediný český vědec Nobelovu cenu.
11.3.1. Klasická polarografie
Při polarografii sledujeme závislost proudu procházejícího analyzovaným roztokem na
plynule měnícím se stejnosměrném polarizačním napětí, vloženém na dvě rtuťové elektrody.
Jedna elektroda(katoda) je polarizovatelná (mění svůj potenciál), druhá elektroda (anoda) je
nepolarizovatelná (její potenciál se nemění). Použití polarografie je orientováno na stanovení
látek, které lze oxidovat či redukovat.
Stanovení se provádí na přístroji, nazývaným polarograf.
158
Prof.Ing. Jaroslav Heyrovský
(1890-1967)
Jeden z prvních polarografů
prof.Heyrovského
Schéma polarografu
Polarograf s detailem na měřící nádobku
Katodu tvoří rtuťová kapka, odkapávající z kapiláry (tím se neustále regeneruje, není
ovlivněna produkty elektrolýzy) anodu tvoří rtuť na dně polarografické nádobky (slouží jako
referenční/srovnávací elektroda). K analyzovanému vzorku se přidává roztok základního
elektrolytu, jehož ionty ve sledovaném rozmezí napětí nesmí na elektrodách reagovat, tento
elektrolyt slouží především ke zvýšení vodivosti.
Na počátku analýzy je napětí nulové, při zvyšování napětí dochází k polarizaci rtuťové
elektrody. Při určitém napětí dojde k rozkladu elektrolytu, toto napětí se nazývá rozkladné.
Analyt přítomný v analyzovaném vzorku schopný oxidace nebo redukce se začne při svém
rozkladném napětí vylučovat na povrchu rtuťové kapkové elektrody. Pokud se analyt vylučuje
dochází k náhlému vzrůstu intenzity proudu. Tento proud je tím vyšší, čím je vyšší
koncentrace stanovovaného analytu. Tento proud se potom ustálí i při dalším zvyšování
napětí. Ustálená hodnota tohoto proudu se nazývá limitní difuzní proud. Potenciál rtuťové
kapkové elektrody se dále plynule zvyšuje až při dosažení dalšího určitého potenciálu se
začne na elektrodě vylučovat další druh iontů přítomných v měřeném vzorku.
Závislost proudu na zvyšujícím se napětí se dá znázornit graficky jako polarografická křivka.
Při spuštění kolmice z inflexního bodu vlny na osu x (hodnota potenciálu) se určí tzv.
půlvlnový potenciál, který charakterizuje druh analytu (kvalita). Výška vlny je úměrná
míchadlo
rtuťová kapková
elektroda
referenční
elektroda
159
kocentraci analytu v analyzovaném vzorku (kvantita). Polarografie je metoda kvantitativní i
kvalitativní.
11.3.2. Polarografie na tuhých elektrodách
Elektrody bývají zhotoveny z platiny, zlata, stříbra,aj.(tvoří katodu) a jako referenční
elektrody(tvoří anodu) se používají např. chloridostříbrná nebo kalomelová elektroda.
Příklad: Clarkova kyslíková elektroda – viz kapitola analyzátory ABR
11.3.3. Amperometrie
je metoda, při níž je na pracovní elektrodu vložen konstantní potenciál a měří se změny
proudu mezi indikační (polarizovatelnou) a referenční (nepolarizovatelnou) elektrodou v
závislosti na čase. Velikost tohoto proudu v přítomnosti analytu (depolarizátoru) je mírou jeho
koncentrace. Jde o metodu odvozenou od metod a polarografických, lze při ní použít stejné
instrumentace.
11.4. Coulometrie
Coulometrie je elektroanalytická metoda, při které se měří velikost elektrického náboje
(coulomb) procházející mezi dvěma elektrodami potřebného k elektrochemické přeměně
(oxidaci nebo redukci) stanovovaného analytu . Velikost elektrického náboje procházejícího
mezi elektrodami je přímo úměrná oxidaci nebo redukci elektroaktivní látky na jedné
z elektrod. Náboj přenesený v tomto procesu je podle Faradayova zákona úměrný množství
elektroaktivní látky.
Q = z . a . F
Q –množství elektrického náboje prošlého měřící komůrkou
z – počet elektronů přenesených při oxidační nebo redukční reakci
a – množství elektroaktivní látky v molech
F - Faradayův náboj (96 500 coulombů)
160
Metoda využívá II.Faradayův zákon, který říká, že k vyloučení nebo rozložení jednoho
molu chemických ekvivalentů látky je nutné, aby roztokem prošel jeden mol elektronů
(t.j.Faradayův náboj (F), který je roven 96 500 coulombů).
A= Mr/ z.F
A – elektrochemický ekvivalent
Mr – relativní molekulová hmotnost vylučované nebo rozkládané látky
F – Faradayův náboj (96 500 coulombů)
z –počet elektronů, které se vymění s elektrodou
Při této metodě se měří množství elektrického náboje (měření coulombů) prošlého
analyzovaným roztokem. Do roztoku jsou vloženy dvě elektrody, pracovní a pomocná.
Měření se provádí na přístrojích nazývaných coulometry. Při elektrolýze se zaznamenává
závislost proudu na čase. Z velikosti prošlého náboje se vypočítá množství stanovované látky.
Rozlišujeme
Coulometrii prováděnou při konstantním potenciálu pracovní elektrody (potenciostatická
coulometrie)
Při této metodě proud neustále klesá až do bodu ekvivalence. Měří se množství prošlé
elektřiny.
Coulometrii prováděnou při konstantním proudu pracovní elektrody (coulometrická titrace)
Při této metodě vzniká titrační činidlo elektrolyticky na pracovní elektrodě průchodem
konstantního stejnosměrného proudu. Takto vzniklé titrační činidlo potom reaguje se
stanovovanou látkou v analyzovaném roztoku. Měří se čas od počátku elektrolýzy do
dosažení bodu ekvivalence, který zjistíme nejčastěji potenciometricky nebo ampérometricky
pomocí pomocných elektrod.
Analyzovaným roztokem prochází proud(I) o konstantní velikosti, elektrický náboj(Q) prošlý
analyzovaným roztokem do bodu ekvivalence vypočítáme jako součin doby(t) elektrolýzy a
velikosti prošlého proudu(I) pomocí vztahu:
Q = I . t
Množství stanovované látky (m) potom vypočítáme z I. Faradayova zákona: Hmotnost látky
vyloučené nebo rozložené při elektrolýze je přímo úměrné velikosti elektrického náboje
prošlého elektrolytem
M = Q.A
Stanovení chloridů coulometricky
Přístroje se nazývají coulometrické titrátory (v našem příkladu chloridometry). Skládají se
z titrační nádobky obsahující stanovovaný analyt (v tomto případě chloridy, Cl),
stříbrné
anody (+) a pomocné stříbrné katody (-), déle z míchadla a pomocných elektrod pro stanovení
bodu ekvivalence (konec titrace) připojených na potenciometr. Mezi stříbrnou anodu a
platinovou katodu je veden konstantní elektrický proud
Stříbrné kationty vznikají elektrolyticky na stříbrné anodě: Ag → Ag+
+ eNa
katodě je redukován H+
na plynný vodík.
Stříbrné kationty reagují se stanovovanými chloridovými anionty přítomnými
v analyzovaném vzorku za vzniku nerozpustného chloridu stříbrného: Ag+
+ Cl→
AgCl
V bodě ekvivalence, tj. okamžik kdy jsou všechny chloridové ionty vázány se stříbrnými
kationty, dojde k prudkému nárůstu koncentrace Ag+
a tím i náhlé změně vodivosti.
Chloridový titrátor měří čas potřebný k dosažení bodu ekvivalence. Elektrický náboj se
vypočítá jako součin tohoto času a velikosti konstantního proudu. Množství stanovovaného
analytu(m) se vypočítá z Faradayových zákonů (viz výše). Přístroje se v bodě ekvivalence
vypínají automaticky. Zjednodušeně: měří se časy k dosažení bodu ekvivalence, přístroj se
kalibruje pomocí kalibrátorů se známou koncentrací chloridů, zjištěné časy se porovnají
161
s časy analyzovaných vzorků, naměřené časy jsou přímo úměrné koncentraci chloridů .
Coulometrie je pro stanovení chloridů metodou referenční.
Obr. Schéma coulometru
Coulometr typSherwood 926S Coulometr typ Karl Fischer
162
12. Iontově selektivní elektrody (ISE), biosenzory
Názvem iontově selektivní elektrody (ISE) jsou obvykle označována elektrochemická čidla,
která umožňují potenciometrická měření aktivity iontů ve vodných nebo smíšených
prostředích, případně parciálních tlaků plynů rozpuštěných v kapalinách.
ISE ponořená do zkoumaného roztoku, sestává obvykle z iontově selektivní membrány,
vnitřního elektrolytu a vnitřní referenční elektrody.
Druhou částí měřícího systému je vnější srovnávací (referentní) elektroda (kalomelová,
argentchloridová).
Obr. 145 Měřící systém pomocí ISE
Biosenzor je analytický přístroj, v principu ISE, obsahující bioreceptor a fyzikálně-chemický
převodník.
Bioreceptory jsou molekuly, často enzymy, které rozpoznávají analytický cíl, tj. látku, která
má být analyzována.
Můžeme je rozdělit na:
 Biokatalytické (stanovovaní látka je enzymem přeměňována v průběhu chemické
reakce, stanovovaná látka obvykle vstupuje do reakce jako substrát)
 Bioafinitní (imunosenzory, stanovovaná látka je specificky vázána protilátkou)
membrána
163
Převodník převádí analytický cíl na měřitelný signál, který je přímo úměrný koncentraci
jedné nebo několika chemických látek ve vyšetřovaném vzorku.
Převodníky mohou být:
 Elektrochemické
 Optické
Důležitou částí je i nosič bioreceptoru.
Prvním biosenzorem byla enzymová elektroda na stanovení glukózy (1972). V roce 1987 byly
zkonstruovány první osobní glukometry. Biokatalyzátor (enzym) v imobilizované nebo
insolubilizované podobě je umístěn na konvenční ISE, kterou se měří úbytek reaktantu nebo
přírůstek produktu biochemické reakce. Změny v koncentracích produktů bývají často
indikovány potenciometricky, ale také ampérometricky, jak tomu je např. u enzymové
elektrody pro stanovení glukosy nebo alkoholu, využívá se také konduktometrie. V
potenciometrických biosenzorech se nejvíce uplatňují ISE se skleněnou, pevnou nebo
plastickou membránou.
Klasifikace ISE:
 Skleněné elektrody mají membránu tvořenou různými vícesložkovými skly. Tyto
elektrody patří mezi elektrody s pevnou homogenní membránou, k jejich
samostatnému řazení přispívá dlouholetá tradice a způsob využití ( především pro
měření pH)
 Elektrody s vhodnými přídavnými membránami, jejichž potenciometrická detekční
jednotka je založena na konvenčních elektrodách. Patří mezi ně tzv. plynové elektrody
a elektrody s biokatalytickými membránami (biosenzory)
 Elektrody s kapalnou membránou mají membrány zhotoveny z kapalných
elektroaktivních sloučenin nebo z elektroaktivních pevných materiálů rozpuštěných ve
vhodném organickém rozpouštědle (tzv. mediátoru) nemísitelném s vodou.
Elektroaktivní látkou v kapalinových membránách může být buď iontoměnič
(hydrofobní kyseliny, zásady nebo soli), nebo ionofor (valinomycin, nonactin,
cyklické ethery atp.). Mezi elektrody s kapalnou membránou patří také ty, jejichž
membrána je tvořena měkčenými plasty, v málo těkavém plastifikátoru je současně
rozpuštěna vhodná elektroaktivní látka. Elektrody, u nichž je plastickou membránou
přímo potažen vnitřní kovový vodič jsou známy jako elektrody typu "coated-wire".
 Elektrody s pevnou membránou ("solid-state"), tj. membránou tvořenou pevnými,
málo rozpustnými solemi, které mohou být založeny na monokrystalech, ztuhlých
taveninách nebo polykrystalických tabletách lisovaných z práškových solí. Vnitřní
elektrolyt se u tohoto typu elektrod obvykle nahrazuje kovovým kontaktem ("all-solidstate").
Membrány mohou být zhotoveny také z heterogenních směsí sraženin
zabudovaných do polymerní matrice.
 Elektrody připravené sítotiskovou technikou – na jednu matrici lze vytisknout i
více senzorů najednou
Nejrozšířenějším principem měření je potenciometre při které se ze změřené hodnoty napětí
elektrochemického článku zjišťuje koncentrace (nebo aktivita) iontu v roztoku. Při
předpokladu lineárního průběhu kalibrace se běžně používá jednoduchá kalibrační metoda
založená na měření napětí článku ve dvou standardních roztocích ve zvoleném koncentračním
rozmezí (dvoubodová kalibrace).
164
12.1. Stanovení sodného kationu (Sodík, Natrium, Na+
)
Jako indikační se používá elektroda s iontově-výměnnou membránou, lze použít i skleněnou
elektrodu; jako referenční elektroda se používá téměř výhradně Ag/AgCl elektroda, ojediněle
i jiné, např. kalomelová elektroda. Napětí mezi indikační a referenční elektrodou se měří
citlivým digitálním voltmetrem (změna aktivity o řád odpovídá změně potenciálu o 0,059
mV) s vysokým vstupním odporem (proto je během měření bezproudový stav).
ISE jsou konstruovány jako ponorné, průtokové nebo suché elektrodové systémy. Průtokový
systém může používat buď okénko s indikační elektrodou (elektroda se snadněji vyměňuje,
ale styková plocha elektrody a tím i její citlivost je menší) nebo indikační elektrodu ve formě
trubky (výměna elektrody je o něco složitější, ale styková plocha se vzorkem a tím i citlivost
měření je větší. Příklady použitých ionoforů v iontově-výměnné elektrodě jsou ETH 227
(N,N',N''-triheptyl-N,N',N''-trimetyl-4,4',4''-propylidintris(3-oxabutyramide), makrocyklické
crown-etery oblíbené u japonských výrobců jako DD-16-C-5, 2,3:11,12-didekalino-16-crown-
5.
Přestože je mez detekce sodných elektrod s kapalnou membránou asi 1000-krát vyšší než u
skleněné elektrody, používají se v současných analyzátorech prakticky výhradně indikační
elektrody s kapalnou membránou, které jsou schopné sledovat aktivity sodných iontů od 1
mmol/l. Skleněné elektrody totiž nelze konstruovat tak malé jako elektrody s kapalnou
membránou a bylo nutné poskytnout alespoň 100 µl materiálu k měření. Obvyklé složení
měrného skla skleněné elektrody je 11 % Na2O, 18 % Al2O3 a 71 % SiO2. Měřený potenciál
iontově selektivní elektrody E určuje Nernstova rovnice.
Měření probíhá v neředěných vzorcích (přímá metoda ISE, direct ISE) nebo v ředěných
vzorcích (nepřímá metoda ISE, indirect ISE).
Přímá metoda umožňuje měřit aktivitu sodných iontů v plné krvi, případně v plazmě nebo
séru. Elektrochemické analyzátory používané v POCT měří výhradně v plné krvi, protože
tento postup umožňuje za 1 – 2 min po odběru získat výsledek. Navíc tato metoda poskytuje
správné výsledky i v případě tzv.pseudohyponatremie, kdy se v důsledku vysoké koncentrace
lipidů případně bílkovin významně snižuje podíl vody v plazmě (ionty jsou vysoce polární a
tedy rozpustné jen ve vodě !). Protože aktivitu měříme přímou metodou jen ve vodném
podílu, není zastoupení iontů změnou velikosti vodného podílu ovlivněno. Pokud uvažujeme
celkovou koncentraci včetně nevodného podílu budou výsledky falešně nízké (odtud název
pseudohyponatremie) a neodpovídají hladině iontů ve vodní frakci. Koncentrace sodných
iontů ve vodném podílu je pochopitelně vyšší než celková koncentrace (např. 158 mmol/l ve
vodném podílu odpovídá 145 mmol/l celkové koncentrace).
Přesto automatické analyzátory v laboratořích používají většinou nepřímou metodu
s ředěnými vzorky séra nebo plazmy, někdy s možností přepnutí mezi oběma způsoby. Ředění
do jisté míry přibližuje výsledek přímé metodě. Při extrémně vysokém obsahu tuků nebo
bílkovin však špatnému výsledku (pseudohyponatrémii) nezabrání. Technické uspořádání ISE
modulu vždy umožňuje paralelní měření sodných i draselných iontů a většinou také chloridů.
Lineární odezva sodné elektrody je v intervalu 1 – 100 mmol/l (kapalná membrána), resp.
0,001 – 100 mmol/l (skleněná membrána).
Při stanovení sodných iontů v moči se musí vzorky vždy ředit diluentem s velkou iontovou
silou, aby se kompenzoval vliv kolísání iontové síly ve vzorku moče. Koncentrace sodných
iontů v moči se mění i dvacetinásobně a iontově selektivní elektroda není schopna pracovat v
takovém rozsahu změny iontové síly. Proto se přidává diluent obsahující konstantní množství
disociované a dobře rozpustné soli (např. desetinásobné ředění diluentem obsahujícím > 100
mmol/l fosforečnanu hořečnatého) a kolísání koncentrace iontů v moči pak výslednou
165
iontovou sílu ovlivňuje málo. Nicméně spolehlivé měření v moči závisí i na dalších faktorech,
např. povrchovém napětí. Proto je nutné vždy používat diluent doporučený výrobcem
elektrochemického modulu. Elektrody jsou vyhřívány na 37°C.
Existuje možnost stanovení koncentrace sodíku na pevné fázi, principem je rovněž
potenciometrie. V tomto případě se speciální multipipetou se dvěma špičkami dávkuje
paralelně vzorek i referenční kapalina. Potenciometrická destička sestává s pěti vrstev. Nahoře
je papírový můstek, který spojuje obě části komůrky a také plní funkci izolátoru proudu. Pod
ním je vrstva polymeru, která slouží jako iontově selektivní membrána. Dalšími vrstvami jsou
referenční vrstva želatiny s krystaly chloridu sodného a Ag/AgCl vrstva, kde dochází ke
vzniku potenciálu. Spodní vrstva má funkci nosiče.
12.2. Stanovení draselného kationu (Draslík, Kalium, K+
)
V současné době nejrozšířenější používaný princip stanovení aktivity draselných kationtů je
použití ISE.
 Iontově selektivní membrána obsahuje specifický nosič draselných iontů, kterým je
neionogenní makrocyklické antibiotikum valinomycin rozpuštěné v dioktyladipátu na
porézním organofilním PVC nosiči. Jako nosič může sloužit také teflon.
 Méně obvyklý je v současnosti ionogenní tetra(p-chlorfenyl)boritanový anion.
 Dále se používají tzv. „crown“ etery, zejména v ISE japonských analyzátorů (např. 18crown-6)
nebo kryptandy (např. kryptand 2.2.2). Pórovitá membrána je nasycena 0,1
molárním roztokem KCl, aktivita K+
je v ní udržována na konstantní úrovni
iontoměničem; Donnanův potenciál pak závisí pouze na aktivitě K+
ve vodě (krev,
sérum, plazma jsou vodné roztoky).
Podobně jako u stanovení sodného kationtu se používá přímé měření bez ředění (měřenou
veličinou je aktivita ve vodné fázi) a nepřímé měření s dilucí (stanovení aktivity odpovídající
166
koncentraci v celém vyšetřovaném vzorku). Draselná elektroda má lineární odezvu v rozsahu
0,03 až 1000 mmol/l, takže je dobře použitelná jak pro měření draselných iontů v séru, tak i v
moči. Nicméně velké změny iontové síly vlivem iontů v moči vyžadují přidání diluentu s
velkou iontovou silou, aby se její výkyvy podstatně zmírnily. Při stanovení v moči se může u
některých ISE projevit interference amoných iontů.
12.3. Stanovení chloridového anionu (Chloridy, Cl-
)
Měří se aktivita chloridového anionu ve zředěném vzorku nebo v neředěném vzorku. Většina
současných analyzátorů používá před potenciometrickou analýzou ředění vzorku. Nejvíce
používaná je iontově-výměnná membrána obsahující kvartérní amoniovou sůl jako anex,
např. tri-n-oktylpropylamoniumchlorid v n-dekanolu. Kapalná membrána může obsahovat
také o-fenantrolin. Existuje také aplikace potenciometrie na pevné fázi. V tomto případě se
provádí měření bez ředění a vzorek se dávkuje paralelně s referenčním roztokem speciální
dvoukanálovou multipipetou, jako při stanovení sodíku.
Lineární odezva chloridové elektrody je v intervalu 1 – 100 mmol/l. Přestože se často
upozorňuje na nestabilitu chloridových elektrod (skutečně jejich životnost je ve srovnání se
sodnými a draselnými elektrodami podstatně nižší) a nekonzistenci v selektivitě mezi
jednotlivými šaržemi elektrod, je tento způsob stanovení chloridových iontů v biochemických
laboratořích nejrozšířenější. Nepřímý způsob měření po ředění diluentem s velkou iontovou
silou se používá častěji než přímé měření, protože je součástí technologie rozšířených ISE
analyzátorů firem Abbott, Beckman, Roche, Siemens (Dade Behring, Olympus).
12.4. Stanovení vápenatého kationu (Ionizovaný vápník, ionizované kalcium, Ca2+
)
Tento potenciometrický postup umožňuje měřit aktivitu vápenatých iontů (s jedinou
výjimkou, kdy analyzátor Nova 8 firmy Nova Biomedical měřil také celkový vápník). Pro
stanovení aktivity ionizovaného vápníku (iCa) se používají elektrody ionexového typu, nebo
elektrody s neutrální membránou. Oba typy mají kapalnou membránu, obsahující organické
rozpouštědlo nemísitelné s vodou, ve kterém jsou rozpuštěny látky schopné vyměňovat nebo
zachycovat ionty z vnějšího roztoku. Hydrofobní přepážka (obvykle z PVC) odděluje
kapalnou membránu od měřeného roztoku. Elektrody ionexového typu používají ionex
didecylfosforečnan vápenatý [C10H21O)2PO2]2Ca v dekan-1-olu nebo dioktylfenylfosfonátu
(obr.a). Na fázovém rozhraní s měřeným roztokem se ustavuje rovnováha ovlivněná
koncentrací vápenatých iontů v tomto roztoku.
Obr. a Obr. b
Elektrody s neutrální membránou zachycují vápenaté ionty do dutin, které jim vyhovují svou
velikostí (jedná se o syntetické cyklické polyetery, např. ETH 1001 (obr.b) t.j. N,N´-bis[11(etoxykarbonyl)undecyl]-N,N´-4,5-tetrametyl-3,6-dioxaoktandiamid,
nebo přírodní
makrocyklické sloučeniny). Polymerní membrána obsahuje rozpouštědlo s takovými nosiči.
167
Při měření ionizovaného vápníku měříme potenciál měrné elektrody vůči referenční Ag/AgCl
elektrodě. Obě elektrody jsou spojeny můstkem s nasyceným roztokem KCl. Tím je zaručeno
jeho konstantní složení a současně nulový difuzní potenciál (iontová pohyblivost draselných a
chloridových iontů je shodná). Obvyklé jsou ještě dvě přídavné platinové elektrody, které
slouží pro detekci kapaliny nebo vzduchu při automatizovaném postupu. Předpokladem
spolehlivosti měření je minimální odchylka mezi aktivitou vápenatého kationtu ve vzorku a v
kalibračním roztoku. Expozice vzorku na vzduchu vede k úniku CO2 a změně pH, na kterém
je hodnota iCa závislá. Proto je nutný anaerobní odběr, zpracování i měření. Analyzátory jsou
vybaveny pH elektrodou a kromě aktuální hodnoty iCa uvádějí i hodnotu korigovanou na pH
7,4. Vliv teploty není podstatný v intervalu měření ±2 °C. Abnormální koncentrace nebo
složení albuminu může u některých přístrojů zapříčinit falešně negativní nebo falešně
pozitivní výsledky. Pro měření je vhodnější sérum než plazma (vliv heparinu), ale jeho
anaerobní získání může být problémem. Sraženinu je nutné rychle separovat a vzorek
neskladovat (vliv pH); iCa elektroda je citlivá na iontovou sílu a při měření interferují sodné
ionty. Proto má každý solidní přístroj ke stanovení aktivity iCa také sodnou elektrodu.
Aktivita sodných iontů nemusí být pro obsluhu dostupná, ale přístroj ji měří a používá ke
korekci naměřených hodnot aktivity iCa. Vzhledem k velkému kolísání iontové síly v moči se
aktivita iCa v moči nestanovuje. Mimo to iCa elektroda nepracuje při pH < 5,5, které se v
moči může vyskytnout. Falešnou pozitivitu mohou způsobit bromidy.
12.5. Stanovení hořečnatého kationu (Ionizovaný hořčík, ionizované magnézium, Mg2+
)
Pro stanovení ionizované frakce pomocí ISE je vhodný anaerobní odběr, současné měření pH
vzorku a adjustace výsledku na pH 7,40 i když aktivita ionizovaného hořčíku (iMg) je na
změny pH o něco méně citlivá, než aktivita iCa.
Iontově selektivní elektrody pro stanovení hořečnatých iontů mají často poměrně krátkou
životnost (2 týdny). Používají se neutrální ionofory jako ETH 5220, tj. N,N"oktametylenbis(N',N'-dioktylmalondiamid).
Elektrody měří aktivitu ve vodné fázi vzorku,
specifičnost je malá, interferují vápenaté kationty. Proto musí být elektrický potenciál iMg
elektrody nastaven pomocí signálu iCa elektrody s využitím koeficientu selektivity pro iMg
(kromě toho systém obsahuje ještě Na+
a pH elektrodu). Kalibrace se provádí na dva vodné
roztoky s rozdílnými koncentracemi MgCl2 při známém pH a známých koncentracích Na+
, K+
a Ca2+
. Měření iMg neruší silikonový separátor (separační gel) ze zkumavek, ani sérové
lipidy.
12.6. Stanovení laktátu
a) Polarografie (amperometrie)
Měrná elektroda je potažena laktátoxidázou (odtud název „laktátová“ elektroda). Při
konstantním potenciálu (přepětí) je vzniklý proud úměrný koncentraci peroxidu vodíku.
L-laktát + O2 → pyruvát + H2O2
H2O2 → 2H+
+ O2 + 2e–
Velmi rychlý postup umožňuje měření laktátu z celé krve v elektrochemických analyzátorech.
Elektroda je vlastně modifikací Clarkovy kyslíkové elektrody. Laktátový senzor obsahuje
většinou čtyři elektrody (platinovou měrnou elektrodu potaženou laktátoxidázou – srovnávací
argentchloridovou elektrodu – platinovou elektrodu určenou ke stabilizaci konstantního
potenciálu – platinovou elektrodu bez enzymu sloužící ke stanovení interferujících látek)
Odběr krve se provádí do odběrových nádobek s protisrážlivým činidlem (EDTA) a
antiglykolytickým činidlem (NaF). Transport krve se uskutečňuje na ledové tříšti. Je třeba
168
zabránit hemolýze (falešně snižuje výsledky). Separaci krevních elementů je nutné provést do
15 min od odběru, stanovení nejdéle do 2 h od odběru.
b) Potenciometrie
Využívá se ferikyanidu jako mediátoru elektronů. Laktát se laktátoxidázou (LO) oxiduje na
pyruvát a současně se ferikyanid redukuje na ferokyanid. Ten při zpětné oxidaci předává
elektrony na platinovou katodu, kde dochází k jejich spotřebě při redukci kyslíku na vodu.
Tento postup lze automatizovat. Analýza je spolehlivá, rychlá a citlivá, ale zařízení není
běžně dostupné.
12.7. Stanovení glukózy
Vužívá se polarografie (amperometrie), často s využitím čipové technologie
Enzym imobilizovaný na čipu zajišťuje oxidaci glukózy ve vzorku za tvorby peroxidu vodíku.
Ten je následně oxidován (+600mV), změna protékajícího proudu je úměrná koncentraci
měřeného analytu.
Glukóza + O2 → kyselina glukonová + H2O2
H2O2 → 2H+
+ O2 + 2eGlukózový
senzor obsahuje podobně jako u stanovení laktátu většinou čtyři elektrody
(platinovou měrnou elektrodu potaženou glukózooxidázou – srovnávací argentchloridovou
elektrodu – platinovou elektrodu určenou ke stabilizaci konstantního potenciálu – platinovou
elektrodu bez enzymu sloužící ke stanovení interferujících látek)
Je možné také měřit úbytek kyslíku spotřebovaného při reakci.
Firma EKF Diagnostics: analyzátory Biosen C-line Clinic, Biosen C-line Lab+
Vlastnosti:
 Stanovení 120 až 180 vzorků za hodinu
 Čipové senzory
 20μl vzorku (krev, plazma, sérum) se ředí 1ml systémovým roztokem
 Pravidelná kalibrace
Měřené analyty: glukóza, laktát
Biosen C-line Lab+
Firma Eppendorf: analyzátor EBIO® plus
Vlastnosti:
 Stanovení 150 vzorků za hodinu
169
 Enzymové elektrody
 Analyzovaný materiál (krev, plazma, sérum)
 20μl vzorku se ředí 1ml systémovým roztokem
Měřené analyty: glukóza, laktát
1 Měřící komůrka
2 Enzymová membrána
3 Enzym (glukózooxidáza)
4 Měřící Pt elektroda
Analyzátor EBIO® plus Schéma měření (glukóza)
Jedním z prvních glukózových analyzátorů byl analyzátor firmy Beckman:
Vlastnosti:
 Stanovení 54 vzorků (sérum, plazma, moč, likvor) za hodinu
 Enzymová elektrod
Měřený analyt: glukóza
Enzym imobilizovaný v membráně elektrody zajišťuje oxidaci glukózy ve vzorku za tvorby
peroxidu vodíku. Ten je rozkládan cestou, která nevede k tvorbě kyslíku. Měří se rychlost
poklesu koncentrace kyslíku, která je úměrná koncentraci glukózy v analyzovaném vzorku.
Glukóza + O2 → kyselina glukonová + H2O2
H2O2 + 2H+
+ 2I→
I2 + 2 H2O
170
Beckman Glukose Analyser 2
Technologie firmy Nova Medical použitá v glukometru StatStrip: Multi-WellTM- je založena
na větším počtu vrstev testovacího proužku a měrných komůrek v měřící vrstvě (jedná se o
čtyři vrstvy a čtyři komůrky). Tato patentovaná technologie umožňuje rychlé stanovení
koncentrace glukózy a hodnoty hematokritu; zároveň je eliminován vliv chemicky nebo
elektrochemicky interferujících sloučenin přítomných v testovaném vzorku krve.
Glukometr StatStrip Glukometr Optimum Xceed
171
Odběrová lanceta Odběrová lanceta
Měření pomocí glukometrů je jednoduché. Uvádíme příklad firemního postupu (Roche
Diagnostics) s přístrojem Accutrend Plus (přístroj umožňuje stanovit kromě koncentrace
glukózy, také cholesterol, triacylglyceroly a laktát).
Zapnout přístroj, vložit testovací proužek, blikající šipka na displeji naznačuje, abyste
přístroj otevřeli a nanesli vzorek krve
2.krok
Pomocí odběrové lancetky proveďte vpich do konečku prstu a naneste vzorek kapilární krve
přímo na testovací proužek
172
3.krok
Zavřete přístroj a počkejte na výsledky, které se po dokončení měření zobrazí na displeji
Kontinuální monitory pro zjišťování koncentrace glukózy jsou přístroje, které měří
koncentraci glukózy v reálném čase.
Dnes se využívají čtyři technologické postupy:
 Transkutánní senzory (s glukózooxidázou, systém obvykle tvoří senzor = měřící
elektroda, vysílač, monitor)
 Mikrodialýza kůže (metoda je založena na měření rychlosti přestupu molekul o určité
velikosti přes semipermeabilní membránu, systém se skládá z biosenzoru,
mikropumpy, která je zapojena na mikrodialyzační systém, řídící jednotky)
 Neinvazivní kožní a oční přístroje k měření koncentrace glukózy (v současné době
není žádný neinvazivní systém pro monitorování koncentrace glukózy dostatečně
spolehlivý; výzkum se zaměřuje na: využití proteinu, na který se váže glukóza, na
difuzní reflektanti založené na polarizaci, na využití Ramanových spekter, na
impedanční spektroskopii, na reverzní iontoforézu a na transdermální měření vodivosti
a tepelné kapacity)
12.8. Stanovení kreatininu
Princip: polarografie (amperometrie)
Firma Radiometer: analyzátor ABL800 Flex
Firma využívá dvě kreatininové elektrody. Jedna elektroda umožňuje stanovit kreatinin i
kreatin přítomné v analyzovaném vzorku krve, druhá elektroda stanovuje pouze kreatin. Po
odečtení obou signálů a tedy kompenzaci interferujících látek v analyzovaném vzorku krve je
stanoven kreatinin. Obě elektrody mají podobné složení liší se jen v počtu imobilizovaných
enzymů na membráně (jedna elektroda obsahuje všechny tři enzymy, druhá elektroda
obsahuje pouze poslední dva enzymy).
173
Kreatinin + H2O ↔ kreatin (kreatininasa)
Kreatin + H2O → sarkosin + močovina (kreatinasa)
Sarkosin + H2O + O2 → glycin + formaldehyd + H2O2 (sarkosinoxidasa)
Vznikající peroxid vodíku (H2O2) je transportován k platinové elektrodě, mezi elektrody je
vloženo polarizační napětí (675mV), dochází k oxidaci peroxidu vodíku, při které vzniká
elektrický proud úměrný množství peroxidu vodíku a tedy i koncentraci kreatininu
v analyzovaném vzorku krve.
Na anodě probíhá oxidace (při které vznikají elektrony) peroxidu vodíku:
H2O2 → 2H+
+ O2 + 2eNa
katodě probíhá redukce (při které jsou spotřebovávány elektrony) Ag+
(z AgCl) na Ag:
Ag+
+ e→
Ag
Dva stříbrné kationy jsou redukovány při oxidaci jedné molekuly peroxidu vodíku.
12.9. Stanovení močoviny (urea)
Potenciometrický biosenzor se zakotvenou ureázou, stanovující vznikající oxid uhličitý (pCO2
elektroda) nebo stanovující amonné ionty vytvářené ze vzniklého amoniaku
(NH3 + H+
→ NH4
+
)
V současné době se stanovení Na+
, K+
; Clprovádí
na automatických analyzátorech, až na
výjimky se tedy nepoužívají jednoúčelové přístroje.
174
Automatický analyzátor Architekt ci16200 (Abbott Diagnostics)
Integrovaný čip (ICT) sloužící ke stanovení Na+
, K+
; Clna
principu nepřímé potenciometre a
uspořádání měřících elektrod
Příklad jednoúčelového přístroje:
Firma Roche Diagnostics: analyzátor ISE 9180
Vlastnosti:
 Programově nastavitelná konfigurace elektrod (Na+
, K+
; Na+
, K+
; Cl;
Na+
, K+
, Ca2+
;
Na+
, K+
, Li+
; Na+
, Li+
; Li+
)
Měřené analyty: Na+
, K+
, Cl,
Ca2+
, Cl,
Li+
Jiným příkladem jednoúčelového přístroje je přístroj EasyLyte
175
EasyLyte
176
13. Analyzátory acidobazické rovnováhy (ABR) a krevních plynů.
Hodnota pH krve a krevních plynů (O2, CO2) patří vedle iontů a osmolality k základním
charakteristikám vnitřního prostředí. Jsou důležité při monitorování vnitřního prostředí
kriticky nemocných pacientů na jednotkách intenzivní péče, při anestezii,atd.
Přístroje pro jejich měření, stejně jako způsob jejich použití v diagnostice a léčbě poruch a
rozvratů vnitřního prostředí je nerozlučně spjat se jménem dánského profesora klinické
biochemie Paula Astrupa. Jeho jméno se i u nás stalo synonymem jak pro přístroj, tak i pro
vlastní vyšetření acidobazických parametrů.
Původní přístroje využívaly Astrupovu ekvilibrační metodu. Přístroj byl vybaven skleněnou
mikroelektrodou pro měření pH a dvěma ekvilibračními komůrkami pro nasycení krevních
vzorků dvěma různými koncentracemi CO2 .Všechny součásti přístroje byly temperovány
cirkulující vodou vyhřívanou na 37°C. Pacientovi se odebraly 3 kapiláry arterializované
kapilární krve z ušního lalůčku. V první kapiláře se změřilo aktuální pH krve. Krev ze
zbývajících dvou kapilár se vypustila do ekvilibračních komůrek, ve kterých probublávaly dvě
různé koncentarce pCO2 . Po několikaminutové ekvilibraci (sycení) se v obou vzorcích krve
rovněž změřila hodnota pH. Aktuální hodnota pCO2 se potom zjistila extrapolací aktuální
hodnoty pH krve z grafu závislosti pH na hodnotě pCO2.
Vývojem selektivních elektrod k měření pCO2 a pO2 začala éra analyzátorů k přímému
měření acidobazických parametrů a krevních plynů. Konstrukce těchto analyzátorů od
různých výrobců (Radiometer, Instrumentation Laboratory, AVL, Ciba Corning, Nova,...)
byla dosti podobná. Tři elektrody (pH, pCO2 ‚ pO2) umístěné v termostatovaném prostoru
(37 °C) zasahují svými měrnými konci do skleněné kapiláry, do které se nasává měřený
vzorek nesrážlivé krve.
Současné analyzátory ABR umožňují současně ze stejného vzorku krve měřit další parametry
za použití iontově selektivních elektrod (Na, K, Cl, Ca, Mg ), případně enzymových elektrod
(laktát, glukóza, kreatinin, močovina) nebo spektrofotometrie frakcí hemoglobinu
(oxyhemoglobin, karnonylhemoglobin, methemoglobin, fetální hemoglobin). Tyto
analyzátory jsou již plně automatizované. Umožňují nastavení automatické kalibrace elektrod
v určených časových intervalech (např. po 6 hodinách), automatické provádění kontroly
kvality, automatické promývání a případně i základní údržbu systému.
Preanalytické podmínky
pH, pCO2 a pO2 se stanovují:
 v nesrážlivé arterializované kapilární krvi (ušní lalůček, bříško prstu, patička u
novorozenců, vždy po hyperemizaci prohřátím, masáží,apod.)
 v nesrážlivé arteriální krvi ( odebírá se nejčastěji z artéria radialis, nachází se na
zápěstí, v místě, kde se obvykle vyšetřuje pulz do speciální odběrové stříkačky, na
jednotkách intenzivní péče se často zavádí arteriální katetr, který umožňuje
opakované odběry)
 v centrální nebo (lépe) smíšené žilní krvi (z centrálního žilního katetru, portu)
177
Odběr kapilární krve Odběr arteriální krve Odběr arteriální krve z katetru
Krev v kapiláře musí být důkladně
promíchána pomocí drátku vloženého do
kapiláry a magnetu. A pečlivě na obou
koncích uzavřena
Odběrová stříkačka pro vyšetření ABR
Je nutné použít protisrážlivé činidlo (heparin), v případě současného stanovení iontů je nutné
použít titrovaný (balancovaný, iontově vyvážený) heparin.
Odběr musí být anaerobní, bez vzduchových bublin, dokonalé promíchání krve s
protisrážlivým činidlem je nutností.
Analýza je nutná do 15 min od odběru, pokud se analýza provádí v mimo odběrové místo v
laboratoři, musí se vzorek krve transportovat na ledu, potom je stabilita analytů při +4 až
+8°C až 2h.
13.1. Stanovení pH – viz také kapitola Potenciometrie
Pro měření pH v roztocích se obvykle používá skleněná indikační elektroda, nejstarší a dosud
i nejvíce v praxi používaná iontově selektivní elektroda. Elektroda je tvořena tenkou
skleněnou membránou (tvořenou různými vícesložkovými skly), která je z jedné strany
plněna pufrem o známé hodnotě pH a z druhé strany je ovlivňována prostředím měřeného
vzorku o neznámém pH. Na fázových rozhraních vzniknou potenciálové rozdíly, které se měří
pomocí referenčních elektrod. Potenciál vzniká výměnou iontů mezi roztokem a membránou.
Ideální elektrodové sklo by mělo vykazovat rychle se ustavující teoretickou odezvu v co
největším rozmezí pH, mít vyhovující chemickou odolnost malý elektrický odpor. Pro měření
zásaditých roztoků obsahující sodné ionty je třeba počítat s tzv. alkalickou chybou, která se
projeví naměřením nižší hodnoty pH než odpovídá skutečnosti.
178
Pro měření pH je zapotřebí nejprve na povrchu skleněné membrány máčením v kyselém
roztoku vytvořit hydratovanou vrstvu, v níž jsou sodné ionty ze skla nahrazeny vodíkovými
ionty z roztoku:
Na+
(sklo) + H+
(roztok)  H+
(sklo) + Na+
(roztok)
Tyto vodíkové ionty z hydratované vrstvy se mohou účastnit při měření pH rovnovážné
výměnné reakce s vodíkovými ionty v analyzovaném i vnitřním roztoku, jejímž důsledkem je
vznik membránového potenciálu:
H+
(sklo)  H+
+ skloNejvíce
je používaná kombinovaná pH elektroda, která má indikační i referenční elektrody
společně v malé sondě. Referenční vnitřní Ag/AgCl elektroda je utěsněna v úzkém skleněném
válci zakončeném skleněnou špičkou (kuličkou) citlivou na H+
ionty. Referenční vnější
elektroda je tvořena drátem, který obaluje indikační elektrodu. Vnější skleněný obal je
naplněn nasyceným roztokem KCl (vnější plnící roztok) a je v blízkosti detekční špičky
(kuličky) porézní (keramika). Tak vzniká kapalný můstek. Měřený roztok musí kompletně
pokrýt povrch detekční špičky (kuličky). Elektroda pH pracuje v rozsahu 0 – 14 a optimální
selektivitu k H+
iontům zaručuje složení skla: 72 % SiO2, 22 % Na2O a 6 % CaO. IFCC
vypracovala v roce 1986 variantu potenciometrického měření pH jako doporučenou
referenční metodu. K dispozici jsou i kazety s elektrodami na jedno použití pro POCT.
těsnící kroužek
pufr obsahující chloridový ion
vzduchová bublina
stříbrný drátek potažený AgCl
plastikový obal
pH senzitivní skleněná membrána
převlečná upevňující matice
pH ELEKTRODA
(skleněná elektroda)
179
13.2. Stanovení pO2, parciálního tlaku kyslíku
pO2 je definován, jako parciální tlak kyslíku v plynné fázi, který je v rovnováze s krví. Je
měřen kyslíkovou elektrodou.
13.2.1. Polarografie (ampérometrie)
Tento princip používají:
 klasické pO2 elektrody
 čipové pO2 elektrody
 transkutánní kyslíkové elektrody
V klasickém uspořádání měří ampérmetr proud procházející elektrickým obvodem. Elektrolyt
poskytuje kontakt mezi katodou a anodou; obsahuje pufr udržující konstantní pH a také
chloridy k odstranění stříbrných iontů z roztoku. Katodu pro redukci kyslíku tvoří platinový
drát. Membrána propustná pro O2 umožňuje jeho transport ze vzorku ke katodě. Vzorek je v
kontaktu s membránou elektrody. Platinová čerň katalyzuje převedení H2O2 na kyslík a vodu
v případě neúplné redukce kyslíku. Vrstva AgCl je výsledkem odstranění Ag+
iontů z roztoku
při reakci s Cl.
Na stříbrné tyči dochází k anodické oxidaci a vložené přepětí odpovídá
redukčnímu potenciálu O2. Polarografie sleduje závislost intenzity proudu a napětí
(potenciálu). Vložené přepětí (630 mV) odpovídá půlvlnovému potenciálu kyslíku a
umožňuje selektivně kvantifikovat jeho množství na základě měření intenzity proudu.
Katodická redukce probíhá jako kompletní:
O2 + 4H+
+ 4e→
2H2O
nebo neúplná:
O2 + 2H+
+ 2e→
H2O2
dokončená na platinové černi (amorfní Pt):
2H2O2 → 2H2O + O2
a kyslík je opět redukován na katodě. Při redukci kyslíku se spotřebovávají volné elektrony, tj.
elektrický proud:
Zdrojem elektronů je anodická oxidace stříbra.
Ag → Ag+
+ eMusí
být oxidovány čtyři atomy stříbra, aby mohla být redukována jedna molekula kyslíku.
a) Clarkova kyslíková elektroda se skládá z měrné, polarizované platinové elektrody
(katoda) a argentchloridové referentní elektrody (anoda). Obě elektrody jsou od měřeného
180
vzorku odděleny membránou z teflonu nebo polypropylénu, která je propustná pro O2. Na
elektrody se vkládá konstantní napětí, při kterém se na katodě kyslík redukuje (-630 mV).
Ampérmetr měří protékající proud, který je úměrný koncentraci rozpuštěného kyslíku
v analyzovaném vzorku. Tato elektroda se používá u acidobazických analyzátorů a také např.
u některých typů glukózových analyzátorů.
V elektrodě probíhají následující reakce:
 Na katodě: O2 + 2H2O + 4e→
4OH
Na anodě: Ag + Cl→
AgCl + eb)
Čipové pO2 elektrody využívají technologie hustého filmu . Vrstvy jsou postupně
nanášeny na keramickou podložku, přičemž se materiál vybírá podle svých elektrických
vlastností (vodič, izolant). Každá vrstva se nanáší přes specifickou šablonu s dutinami pro
čidla a elektrody. Tloušťka vrstev je 10 – 70 μm. Čip může tvořit až 28 různých vrstev.
Technologie umožňuje do jedné základní vrstvy umístit až 16 elektrodových senzorů pro
různé analyty. Čipová kyslíková elektroda se od klasické liší tím, že má zlatou katodu a je
podstatně menší. Proto má spojovací otvory vrtané laserem. K dispozici jsou i kazety s
elektrodami na jedno použití pro POCT.
c) Transkutánní kyslíkové elektrody. Základem je Clarkova polarografická elektroda
přizpůsobená k použití na povrchu kůže. V anodě je zabudovaný malý termostatem řízený
ohřívač (anoda je vyhřívaná na 45°C), způsobující překrvení kůže na kterou je přiložen.
Elektroda se kalibruje na dva body in vitro. Vlastní měření se pak provádí tak, že se na kůži
kápne kapka destilované vody a přiloží se elektroda s adhesivním kroužkem. Přiložení musí
být vodotěsné bez vzduchových bublin. Nejčastěji se měření provádí na kůži nad bicepsy.
181
13.2.2. Fluorimetrie
Optody využívající fluorimetrického principu detekce se používají zejména v analyzátorech
POCT v práci rychlé záchranné služby. Senzor pO2 obsahuje fosforeskující barvivo
rozpuštěné v PVC membráně. Barvivo (NPT7) tvoří komplex porfyrinu s paladiem a přístroj
detekuje zhášení fosforescence způsobené kyslíkem.
13.3. Stanovení pCO2, parciálního tlaku oxidu uhličitého
Princip: potenciometrie
pCO2 je definován, jako parciální tlak CO2 v plynné fázi, která je v rovnováze s krví a je
měřený pCO2 elektrodou.
pCO2 elektroda je kombinací skleněné a argentchloridové elektrody (Ag/AgC1) referenční
elektrody uložené v plastikovém obalu naplněném bikarbonátovým pufrem. Obal elektrody je
na měrném konci překryt silikonovou membránou (tloušťky 20 µm) na nylonové síťce
(tloušťky 50 µm).
pCO2 elektroda je v zásadě pH elektroda s přidanou silikovou membránou. Tato membrána
umožňuje průchod pouze molekulám bez náboje (např. CO2, O2, N2). Ionty s nábojem, jako
např. H+ nemohou přes membránu projít. To vede k tomu, že rozpuštěný CO2 v krevním
vzorku difunduje přes silikonou membránu do tenké vrstvičky bikarbonátového pufru uvnitř
elektrody, dokud se neustaví rovnováha (dokud nedojde k ekvilibriu).
Vznikající kyselina uhličitá disociuje a posunuje tak pH vnitřního elektrolytu elektrody na
kyselou stranu.
CO2 + H2 O  H2 CO2  H+
+ HCO3
Aktivita
H+
měřená pH elektrodou je v tomto prostoru úměrná parciálnímu tlaku CO2 (pCO2)
ve zkoumaném vzorku.
Vzhledem k tomu, že přes membránu nemohou projít molekuly a atomy s nábojem, odpovídá
změna pH výhradně množství CO2 v krevním vzorku. Naměřená změna pH se po ustálení
elektrody převede na hodnotu pCO2. Elektroda se kalibruje směsí plynů nebo roztokem o
známém parciálním tlaku CO2.
K dispozici jsou i kazety s elektrodami na jedno použití pro POCT.
182
nylonová síťka
vzduchová bublina
plastikový kryt
těsnící gumový kroužek
Ag/AgCl referenční elektrody
přepad. otvor
Ag/AgCl drát
roztok vnitřního pufru
pH senzitivní sklo na
povrchu elektrody
těsnící gumový kroužek
elektrolyt- vodný roztok
HCO-
3 a NaCl v glycerolu
pCO2 ELEKTRODA
(Severinghauzova elektroda)
12 µ teflonová
membrána
těsnící kroužek
převlečná matice
konektor
183
Některé příklady technického řešení
Firma Instrumentation Laboratory: analyzátory GEM®Premier 4000, GEM®Premier
3500, GEM®Premier 3000.
Vlastnosti:
 Použití kazet (cartridge) obsahujících všechny součásti měřícího systému (senzory,
reagencie, kontrolní vzorky, hadičky, ventily)
 Automatická kontrola kvality (iQM™, Inteligent Quality Management systém) :
aktivní program procesu kontroly kvality určený ke kontinuálnímu monitorování
analytického procesu s automatickou detekcí chyb v reálném čase, automatickou
korekcí systému a automatickou dokumentací všech nápravných opatření
 Dálková správa dat, kontrola přístroje, prohlížení výsledků (GEMweb®Plus)
 Provoz bez údržby (náhrada kazety každých 30 dnů)
Měřené analyty: pH, pCO2, pO2, Na+
, K+
, Ca2+
, glukóza, laktát, hematokrit, hemoglobin a
jeho deriváty, bilirubin a vypočítané parametry: TCO2, BE, p50, sO2, HCO3
,
aj.
GEM®Premier 3000 a vložení kazety Automatická kontrola kvality (iQM,
Inteligent Duality Management systém
Firma Roche Diagnostics: analyzátory cobas b211(OMNI S), cobas b121 (OMNI C)
Vlastnosti:
 3 způsoby aplikace vzorku (kapiláry, ampule, stříkačka)
 Detekce hladiny reagencií
 Automatická kalibrace (jedno a dvoubodová), kontrola kvality
 Automatické čištění a údržba přístroje
 Možnost dálkové údržby a monitorování přístroje
Měřené analyty: pH, pCO2, pO2, Na+
, K+
, Ca2+
, Cl,
glukóza, laktát, močovina, hematokrit,
hemoglobin a jeho deriváty, bilirubin a vypočítané parametry: TCO2, BE, p50, sO2, HCO3
,
aj.
184
Firma Radiometer Copenhagen: analyzátory ABL800 Flex, ABL90 Flex, ABL80Flex
Vlastnosti:
 Možnost použití kazet (ABL80 Flex)
 Detekce hladiny reagencií
 Automatická kalibrace (jedno a dvoubodová)
 Přístroj je vybaven podavačem vzorků
Měřené analyty: pH, pCO2, pO2, Na+
, K+
, Ca2+
, Cl,
glukóza, laktát, kreatinin, bilirubin,
hematokrit, hemoglobin a jeho deriváty, vypočítané parametry: TCO2, BE, p50, sO2, HCO3
-
,
aj.
ABL800 Flex ABL80 Flex
Firma Siemens: analyzátory Rapidpoint 340/350, Rapidpoint 400/405, Rapidlab 1200
(1240, 1245, 1260, 1265)
Cobas b211(OMNI S)
185
Vlastnosti:
 Použití reagenčních a promývacích kazet (životnost 28 dní)
 Detekce hladiny reagencií
 Automatická kalibrace (jedno a dvoubodová) a kontrola kvality
 Možnost automatické správy dat (RAPIDComm™)
 Bezdotykové dávkování
Měřené analyty: pH, pCO2, pO2, Na+
, K+
, Ca2+
, Cl,
glukóza, laktát, hematokrit, hemoglobin a
jeho deriváty, vypočítané parametry: TCO2, BE, p50, sO2, HCO3
,
aj.
Rapidlab 1200 Vložení reagenční kazety
Reagenční kazeta Vnitřek kazety
Firma Abbott Diagnostics: analyzátory i-STAT
Vlastnosti:
 Použití reagenčních a promývacích kazet
 Automatická kalibrace (jedno a dvoubodová) a kontrola kvality
 Možnost automatické správy dat (RAPIDComm™)
Měřené analyty: pH, pCO2, pO2, Na+
, K+
, Ca2+
, Cl,
glukóza, laktát, hematokrit, hemoglobin a
jeho deriváty, vypočítané parametry: TCO2, BE, p50, sO2, HCO3
,
aj.
186
Kazety Analyzátor i-STAT
13.4. Stanovení saturace hemoglobinu kyslíkem
Princip: spektrofotometrie
Oxymetr v elektrochemických analyzátorech měří koncentrace oxyhemoglobinu,
deoxyhemoglobinu, celkového hemoglobinu, methemoglobinu, karboxyhemoglobinu (některé
registrují také sulfhemoglobin) a % saturace hemoglobinu kyslíkem. Oxymetry mohou měřit
jen několik pro analýzu nejdůležitějších vlnových délek nebo poměrně rozsáhlé spektrum až
128 vlnových délek (478 – 672 nm). Základní optický systém sestává ze světelného zdroje,
kyvety, hemolyzátoru, optického vlákna a detektoru. Zdrojem světla je obvykle halogenová
žárovka vybavená infračerveným (tepelným) filtrem. Kvalitní oxymetry mají ještě druhý
světelný zdroj – neonovou žárovku – která slouží ke generování referenčního paprsku pro
detekci driftu primárního zdroje a jeho softwarovou korekci. Optickou dráhu paprsku
usměrňují čočky. Kyveta ultrazvukového hemolyzátoru je vyhřívaná na 37 °C a hemolýza
probíhá pod tlakem 200 kPa. Jednoduchý optický systém obsahuje filtry a fotonku,
sofistikovaný systém je vybaven konkávní mřížkou a detektorem diodového pole (až 128
diod).
Pulzní oxymetr získává signál z pulzující arteriální krve při měření in vivo, není potřeba
žádný vpich k získání vzorku krve. Měří se saturace hemoglobinu kyslíkem jen při dvou
vlnových délkách a to v červené a infračervené oblasti. Senzor je připojen na konec prstu
187
nebo ušní lalůček. Přístroj je tak jednoduchý, že ho mohou používat při monitorování hypoxie
i chronici v domácí léčbě. V místě měření je absorpce konstantní s výjimkou absorpce, která
vzniká ze zvětšeného objemu krve v důsledku arteriální pulzace. Pulzující složka signálu je
izolována, zesílena a filtrována simultánně v červené i infračervené oblasti. Konstantní
(nepulzující) signály, např. z kostí, lipidů, tkání, venózní a nepulzující arteriální krve jsou
sumarizovány a využity k normalizaci pulzujících signálů. Zdrojem světla jsou dvě světlo
emitující diody. Detektorem je fotonka, která poskytuje proud odpovídající intenzitě
dopadajícího světla. Analogově- digitální převodník převádí signály z filtrů na číslicové
signály ke stanovení saturace kyslíkem v měřené arteriální krvi.
Příbuzná technologie reflektanční spektrofotometrie se využívá při měření Sv´O2 (v plícnici)
nebo SCVO2 (v horní duté žíle) optickými plícnicovými nebo centrálními žilními katetry.
Fibrooptická vlákna na špici katetru emitují a zpětně přijímají monochromatické světlo o 2-3
vlnových délkách. Předností systémů pracujících s třemi vlnovými hodnotami je nezávislost
měření na hodnotě hemoglobinu. Problémem je výskyt artefaktů, pokud optický konec katetru
naléhá na cévní stěnu, výsledný signál ukazuje zkreslenou hodnotu SpO2 85-90%.
188
14. Průtoková cytometrie (FLOW CYTOMETRY)
Průtoková cytometrie je technika umožňující kvalitativní a kvantitativní analýzu buněk nebo
jiných částic (jadérka, mikroorganizmy, latexové částice aj.) v suspenzi. Pomocí
definovaných měřených parametrů (rozptyl světla, fluorescence) dovoluje rozlišovat buňky na
základě jejich fyzikálních a chemických vlastností (např. velikosti, množství granul, obsahu
DNA, apod.) a po označení buněk fluorescenčním konjugátem monoklonálních protilátek
umožňuje studium povrchových molekul, diferenciačních antigenů, intracelulárních molekul
včetně cytokinů apod.
Přístroj – průtokový cytometr – vyhodnocuje řádově tisíce buněk za sekundu
14.1. Princip průtokové cytometrie:
Buňky v suspenzi (usměrněné do velmi tenkého proudu) protékají kapilárou a postupně
protínají dráhu paprsku světla (nejčastěji laseru) kolmého na směr toku buněk. Každá buňka
se chová jako sférická čočka a podle své velikosti a vnitřní struktury (granulace) rozptyluje
světlo do různých směrů. Vyhodnocením rozptylu lze buňky roztřídit na jednotlivé buněčné
populace (př. lymfocyty, monocyty, granulocyty).
Pokud byly buňky před analýzou obarveny fluorescenčním barvivem nebo inkubovány
s fluorescenčně značenými monoklonálními protilátkami proti určitým antigenům, dochází
k excitaci fluorochromů laserovým paprskem a následné emisi fluorescenčního záření (princip
přímé imunofluorescence). Takto je možné vyšetřit vnitřní strukturu buňky nebo specifické
molekuly, které buňky exprimují na svém povrchu (znaky, receptory), a tím buňky třídit do
dalších subpopulací.
Světlo vznikající interakcí buněk při průchodu laserovým paprskem (rozptýlené světlo a
emitovaná fluorescence) je rozděleno optickou soustavou hranolů, filtrů a zrcadel podle
vlnové délky fluorescence.
Obr.146: Schema průtokového cytometru
Převzato z
http://www.abdserotec.com/uploads/signal1.jpg
Obr.147: FACS Calibur (Becton-
Dickinson)
(Fluorescence Activated Cell Scanner)
189
FSC…detektor rozptylu světla v malém úhlu
SSC…detektor bočního rozptylu
PMT…fotonásobiče (detektory fluorescence)
14.1.1. Fluidní systém:
Fluidní systém průtokového cytometru zajišťuje tzv. hydrodynamickou fokuzaci:
Vzorek (suspenze buněk různých velikostí v izotonickém roztoku) je vnášen velmi tenkou
tryskou do průtokové kyvety - silnější kapiláry, kterou proudí dostatečnou rychlostí nosná
tekutina (solný roztok, tzv. Sheath fluid). Laminární průtok nosné tekutiny v kyvetě působí
usměrnění buněk do velmi tenkého proudu, částice se tedy pohybují v jedné řadě za sebou.
Obr.148: Hydrodynamická fokuzace
Přejato z publikace: Iuri Marinov,
Průtoková cytometrie v klinické
hematologii, Praha, Triton 2008)
Obr.149: Průtoková cela cytometru
http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_
FACSCanto_II_brochure.pdf
Pozn.: Obrácené uspořádání než na obr.148
Obr.150: Akustická fokuzace
Přejato z:
http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications
-technologies/flow-cytometry.html
Alternativním způsobem usměrnění buněk je akustická fokuzace:
Technika využívá pro umístění buněk do osy kapiláry
ultrazvukové vlny. Na rozdíl od hydrodynamické fokuzace
nevyžaduje tento způsob rychlé průtoky a použití nosné tekutiny;
je možné zpomalit průtok bez narušení fokuzace buněk a tím
prodloužit dobu, po kterou buňka setrvá v laserovém paprsku. Akustickou fokuzaci využívá
cytometr Attune firmy Applied Biosystems.
14.1.2. Optický systém:
Zdrojem světla pro optický systém FACS je laser, např. argonový (488 nm – modrý), helium
- neonový (635 nm – červený), heliový - kadmiový (UV), diodové lasery, argon - krypton dye
laser; zdrojem může být i rtuťová nebo xenonová lampa.
Světlo vznikající interakcí buněk při průchodu laserovým paprskem je rozděleno optickou
soustavou podle vlnové délky fluorescence. Základními prvky optické soustavy jsou
- long pass filtry - propouštějí světlo od určité vlnové délky (nižší vlnové délky zachytí)
190
- short pass filtry - propouštějí světlo do určité vlnové délky (vyšší vlnové délky zachytí)
- band pass filtry - propouštějí světlo pouze v určitém rozsahu vlnových délek (vyšší i
nižší vlnové délky zachytí), např.520 – 540 nm
- dichroická zrcadla – odráží světlo určité vlnové délky, jiné propouští
Jako detektory slouží diody a fotonásobiče (zkratka PMT – photomultiplier tube).
Základními parametry flow cytometrické analýzy je rozptyl světla v malém úhlu, boční
rozptyl a fluorescence:
Forward scatter channel – FSC (rozptyl světla v malém úhlu nebo též dopřední rozptyl)
zachytí dioda dopředního rozptylu, která měří signál v malém úhlu od osy laserového
paprsku. Intenzita FSC signálu je přímo úměrná velikosti buněk.
Side scatter channel– SSC (boční rozptyl) zachycuje fotonásobič v úhlu 90o
od osy
laserového paprsku, poskytuje informaci o vnitřní struktuře buněk (granulace). Kombinace
FSC a SSC umožňuje identifikaci a charakterizaci buněk v heterogenní suspenzi (např. plná
krev).
Fluorescence – FL je zachycena fotonásobičem pro každý fluorofor zvlášť v úhlu 90o
od osy
laserového paprsku; fotonásobiče jsou uspořádány do osmiúhelníku nebo trojúhelníku.
Fluorescence poskytuje informaci o obarvených vnitřních strukturách buňky nebo o
specifických membránových resp. cytoplazmatických molekulách, na které se navázala
fluorescenčně značená protilátka.
Moderní přístroje používají více laserů a detektorů (max. 4 lasery, 18 detektorů)
Obr. 151: Optický systém FACS Canto (Becton-Dickinson):
http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_brochure.pdf
14.1.3. Vyhodnocovací systém
Světelné signály jsou převedeny na elekrické impulzy a lineárně nebo logaritmicky
znásobeny. Zpravidla se měří „plocha“ elektrického signálu (integrál). Používají se i další
možnosti zpracování signálu, například měření výšky a šířky signálu pro odlišení agregátů
buněk. Elektrické signály jsou zpracovávány počítačem (digitalizace, grafické znázornění).
Počítačové zpracování dat umožňuje tzv.gatování (elektronická selekce analyzovaných
částic).
191
Obr.152: Ukázka odlišení agregátů
buněk na základě měření výšky a plochy
signálu
Přejato z: Tomáš Eckschlager a kol.:
Průtoková cytometrie v klinické praxi,
Praha, Grada
14.2. Zobrazování dat z flow cytometrické analýzy
Výstupem flow cytometrické analýzy jsou výsledky v číselné a grafické formě.
Ke grafickému zobrazení se používají jednoparametrové histogramy (na ose x je znázorněna
intenzita signálu – FSC, SSC nebo fluorescence, na ose y je znázorněna četnost buněk) nebo
dvouparametrové grafy o různých formátech. U dvouparametrových grafů je na ose x
vynesena intenzita jednoho měřeného parametru, na ose y intenzita druhého parametru a
množství buněk je znázorněno hustotou bodů (tzv. dot-plot histogram), čarami, které
připomínají vrstevnice na mapě (contour-plot histogram) nebo různými barvami
znázorňujícími hustotu (density plot).
Data je možné archivovat buď pouze ve formě histogramů, nebo jako soubory uchovávající
všechny údaje o každé buňce. Druhý způsob je náročný na kapacitu paměti, ale umožňuje
opakované zpracování dat.
Obr.153: Jednoparametrový histogram Obr.154: Typy dvouparametrových
histogramů
192
14.3. Využití flow cytometrie:
14.3.1. Historie
Prvním předchůdcem flow cytometrů byl Counter (počítač buněk) zkonstruovaný 1953
v USA bratry Coulterovými. Pro stanovení počtu a velikosti částic v suspenzi využíval
impedanční princip: Buňky usměrněné hydrodynamickou fokuzací ve vodivém roztoku
prochází mezi elektrodami, na něž je vloženo napětí a systémem prochází proud. Při průchodu
buňky dochází k pulznímu zvýšení elektrického odporu (impedanční pulz), jehož analýzou se
získá kvantitativní a kvalitativní informace o procházejících buňkách - počet impulzů
odpovídá počtu prošlých buněk, velikost impulzu odpovídá objemu buňky.
Původní Coulter princip se stále používá v hematologii pro počítání krevních buněk a moderní
hematologické analyzátory jej kombinují s dalšími technologiemi (rozptyl, fluorescence).
V roce 1968 byl zkonstruovaný první fluorescenční flow cytometr. Původní název metody (až
do roku 1988) zněl „pulzní cytofotometrie“. První flow cytometry byly přístroje pouze
experimentální, ale technický vývoj umožnil jejich využití pro klinické účely.
14.3.2. Hematologické systémy pro počítání krevních buněk
Hematologické analyzátory krevních buněk zaznamenaly v posledním desetiletí výrazný
rozvoj v užitých technologiích. Moderní analyzátory jsou schopny stanovit počty jednotlivých
typů krvinek na principu průtokové cytometrie. Měřenými parametry jsou počet erytrocytů
(RBC – red blood cell), trombocytů (PLT - platelet), počet a morfologický typ leukocytů
(WBC – white blood cell) a další (retikulocyty, hemoglobin, odvozené parametry).
Bílé krvinky (leukocyty, WBC) se dělí na polymorfonukleární a mononukleární.
Polymorfonukleáry (zjednodušeně polynukleáry) neboli granulocyty mají členité jádro a
obsahují granula, podle jejichž barvitelnosti jsou dále rozlišovány na neutrofilní, eozinofilní a
bazofilní. Mononukleáry (lymfocyty, monocyty) mají nečlenité jádro, nemají specificky
barvící se granula.
Počty erytrocytů, leukocytů a trombocytů byly ve vzorku nesrážlivé periferní krve počítány
v komůrkách pod mikroskopem. Cytomorfologické vyšetření leukocytů bylo prováděno
počítáním jednotlivých typů leukocytů v obarveném tenkém krevním nátěru na sklíčku pod
mikroskopem. Oba zmíněné postupy byly časově náročné, vyžadovaly zkušenost
laboratorních pracovníků a poskytovaly výsledky se značným rozptylem vzhledem
k subjektivnímu způsobu hodnocení nálezů. Zavedení flow-cytometrie představovalo
revoluční změnu, která umožnila automatizaci velkého počtu hematologických vyšetření. Při
jednom vyšetření se tímto způsobem proměří cca 10 tisíc buněk.
14.3.2.1. Princip stanovení na hematologickém analyzátoru:
Krev je rozvedena do tří cest:
V první cestě jsou stanoveny erytrocyty a trombocyty impedanční metodou v komůrce pro
měření elektrického odporu (analyzátory mají možnosti k případnému upřesnění počtu těchto
buněk opticky).
Hemoglobin se stanovuje v druhé cestě spektrofotometricky v průtokové cele.
Třetí cesta je určena pro stanovení tzv. diferenciálního krevního obrazu (rozpočtu leukocytů
na neutrofily, eozinofily, bazofily, lymfocyty a monocyty); různí výrobci přístrojů kombinují
různé detekční metody stanovení.
193
14.3.2.2. Příklady technických řešení stanovení leukocytů
Přístroje Beckman Coulter využívají elektrooptickou flow cytometrii VCS (V – volume, C –
conductivity, S – scatter): Lyzačním činidlem se destruují erytrocyty a trombocyty; leukocyty
zůstávají konstitučně neporušeny a detegují se impedanční metodou (počet a objem buněk –
V), vysokofrekvenčním střídavým elektrickým polem (zjišťují se vnitřní struktury buněk,
které nevedou elektrický proud – C) a rozptylu laserového paprsku (měří se tvar buňky,
povrch – S). Všechny tři parametry jsou měřeny simultánně v jednom kanálu na každém
leukocytu a jsou softwarově zpracovány. Vyhodnocovací program roztřídí jednotlivé buňky a
částice do skupin, spočítá jejich množství v každé skupině a zobrazí je jako bodový histogram
(scattergramu).
Analyzátory Sysmex využívají optickou metodu – fluorescenční průtokovou cytometrii.
Metoda využívá dvou měřících systémů (kanálů), z nichž každý používá jiné lyzační činidlo
a způsob detekce buněčných populací: v 1.systému pro měření neutrofilů, eozinofilů,
monocytů a lymfocytů dochází vlivem lyzačního činidla k destrukci erytrocytů a trombocytů
a k perforaci membrány leukocytů. Perforacemi se do buňky dostává barvivo, které se váže
na DNA a RNA v jádře i cytoplazmě. Organické kyseliny z lyzačního činidla se navíc
specificky váží na eozinofilní granula, zvyšují tím signál a tak umožňují odlišení eozinofilů
od neutrofilů. Po expozici polovodičovým laserem se měří intenzita bočního rozptylu
(informuje o lobularitě, tj. členitosti jádra a přítomnosti granulí v cytoplazmě) a fluorescence
(odpovídá množství nukleových kyselin).
V 2.systému pro měření bazofilů dochází k destrukci všech buněk kromě bazofilů (z
ostatních WBC zůstávají jen holá jádra) a měří se FSC (velikost částice) a SSC (vnitřní
struktura). Zastoupení buněk je opět zobrazeno formou scattergramu.
Obr.155: Zjednodušený scattergram z WBC kanálu a z kanálu bazofilů – Sysmex (Ghost –
lyzované RBC a PLT)
Přístroje firmy Abbott jsou založeny na průtokové cytometrii tzv. MAPSS technologii (Multi
Angle Polarized Scatter Separation). Po interakci buněk s polarizovaným paprskem
argonového laseru se měří rozptýlené světlo v různých úhlech a navíc je v kolmém směru
sledována míra depolarizace světelného paprsku buňkou. Buňky jsou rozlišeny na základě
rozptylu světla, rozlišení buněk s členěným jádrem na neutrofily a eozinofily se děje na
základě jejich schopnosti měnit rovinu polarizovaného světla.
194
Obr.156: Optický systém analyzátoru CELL-DYN 4000 (Abbott)
Polarizovaný paprsek argonového
laseru je zrcadly (Rear, Front
Mirror) usměrněn do průtokové
cely (Flow Cell).
Protékající buňky zředěného
vzorku krve usměrněné fokuzací
v průtokové cele mění optické
charakteristiky paprsku.
Detektor „buvolí oko“ (Bull’s Eye
Detector) deteguje rozptýlené
světlo pod úhlem 0 a 7 stupňů
Děliče paprsků (Beam Splitter)
směřují světlo na 3 fotonásobiče:
PMT 1 detekuje polarizované
rozptýlené světlo z eozinofilů,
PMT 2 rozptýlené světlo pod
úhlem 90°, PMT 3 dává možnost
využít fluorescenci.
Obr. 157:
Měřené parametry (Abbott)
ALL - úbytek světla pod úhlem 0°, měřený ve středové části detektoru „buvolí oko“, při
průchodu buněk přes laserový paprsek je srovnáván s plnou intenzitou paprsku za
nepřítomnosti buněk. Velikost úbytku světelného záření v rovině laserového paprsku závisí
na velikosti procházejících buněk
IAS - Rozptýlené světlo měřené pod malým úhlem 7°: Buňky se složitější vnitřní strukturou
(komplexitou) produkují větší intenzitu rozptýleného světla pod úhlem 7°. Rozptýlené světlo
je měřeno v zevní, okrajové části detektoru „buvolí oko“.
PPS - Rozptýlené světlo měřené pod úhlem 90° je mírou členitosti buněčného jádra
(lobularity).
DPS - Rozptýlené depolarizované světlo měřené pod úhlem 90°: měří cytoplazmatická
granula (je mírou granularity), může být použito k odlišení eozinofilů od neutrofilů (granula
obsažená v eozinofilech světlo při rozptylu depolarizují).
14.3.3. Flow cytometrie v močové analýze
Analýza močového sedimentu a správné zařazení jednotlivých elementů má rozhodující
význam v diagnostice řady onemocnění ledvin a močových cest. Mikroskopická analýza
močového sedimentu v klinické laboratoři je procedura časově náročná a výsledek velmi
závisí na individuální zkušenosti laboratorního pracovníka.
První přístroje, které umožnily automatizaci a standardizaci močové analýzy, se objevily v 80.
letech minulého století a byly založeny na principu digitálního snímání částic ve vzorku
CELL-DYN ® 4000 Customer Training
Optical Bench
CELL-DYN ® 4000 Customer Training
90
o
Light Scatter
 90o
Light Scatter is used as a measurement of the
lobularity of a cell’s nucleus
 90° Light Scatter is a function of NUCLEAR
LOBULARITY
 Greater lobularity = greater 90o
Light Scatter
 90° Light Scatter is detected by a photomultiplier tube
(PMT2)
195
proudícím planární průtokovou kyvetou. Tuto techniku využívají např. močové analyzátory
firmy Iris Diagnostics; třídění elementů do skupin je prováděno na základě softwarového
porovnávání snímků s databází v počítači.
Jinou cestou k automatickému rozpoznávání a kvantifikaci částic v moči představují přístroje
na principu průtokové cytometrie využívající impedančního měření, rozptylu světla a
fluorescence - analyzátory UF firmy Sysmex. Přístroje rozeznávají RBC, WBC, epitelie,
hyalinní válce, patologické válce, bakterie, kvasinky, spermie, krystaly a „jiné buňky“.
Necentrifugovaná moč je po aspiraci do přístroje promíchána a naředěna dilučním pufrem
stabilizujícím osmotický tlak. Vzorek je dále obarven dvěma fluorescenčními barvivy - zvlášť
pro membrány (karbocyanin) a nukleové kyseliny (fenantridin) – a hydrodynamicky
fokuzován. Na vstupu do průtokové cely je změřena vodivost, která je průchodem každé
částice snížena; následuje průchod částic paprskem argonového laseru (488 nm) a optické
měření. Částice jsou klasifikovány na základě impedance (odráží objem buňky), intenzity
FSC (velikost částice), šířky FSC pulzu (délka částice), SSC (povrch částice), intenzity
fluorescence (odráží barvitelnost elementu nebo jeho části) a šířky pulzu fluorescence (délka
obarvené části) a zobrazeny pomocí několika typů scattergramů:
Obr.158: Scattergram malých částic
Závislost intenzity FSC signálu (odráží
velikost částic – Size of Cell) na intenzitě
fluorescence (barvitelnost částice Stainability).
WBC jakožto jaderné částice
s bohatou vnitřní strukturou mají vyšší
fluorescenci (umístění vpravo na grafu) na
rozdíl od RBC s chudou vnitřní strukturou
(umístění vlevo)
Přejato z
http://www.sysmex.dk/index.asp?id=4215
Obr.159: Scattergram velkých částic
Epitelie, válce hyalinní (without
inclusions), válce patologické (with
inclusions)
Závislost šířky signálu fluorescence (odráží
délku obarvené části – Lenght of Stained
Area) na šířce FSC signálu (odráží délku
částice – Lenght of Cell)
Přejato z
http://www.sysmex.dk/index.asp?id=4215
196
Obecnou nevýhodou průtokové cytometrie oproti digitální obrazové analýze je nemožnost
kvalitativního popisu položek (válce, krystaly) a rozpoznání zřídka se vyskytujících
komponent (kvasinky, spermie atd.), analýza takovýchto vzorků musí být doplněna
mikroskopií.
Velkou výhodou je naopak možnost diferenciální diagnostiky hematurií na základě distribuční
křivky erytrocytů a jejich morfologie. Zajímavá je i možnost analýzy jiných tělních tekutin
obsahujících menší množství buněk, např. mozkomíšní mok, sperma, tekutina z peritoneální
dialýzy apod.
14.3.4. Buněčná imunologická vyšetření
14.3.4.1. Buňky imunitního systému
V rámci imunologického vyšetření se získávají informace o počtu a funkci buněk imunitního
systému, které se podílejí na zajištění obrany organizmu. Vyšetření buněčných subpopulací
má významnou roli v diagnostice imunodeficitů, určování hematologických maligních
onemocnění apod.
Obr.160: Buňky imunitního systému - převzato z Hořejší, Bartůňková: Základy imunologie,
Praha, Triton 2009
Podstatnou část imunitního systému
tvoří různé druhy leukocytů.
Z pluripotentních kmenových buněk
vznikají dvě základní buněčné linie –
myeloidní a lymfoidní. Z myeloidní
linie vznikají (vedle erytrocytů a
trombocytů) monocyty a tři druhy
granulocytů (neutrofily, eozinofily a
bazofily), které zastupují
nespecifickou část imunitního
systému. Z lymfoidní linie se
diferencují NK buňky (natural
killer), B lymfocyty (vývoj probíhá
v kostní dřeni – bone) a T lymfocyty
(vývoj probíhá v brzlíku – thymus).
Konečným diferenciačním stadiem B lymfocytů jsou plazmatické buňky produkující
protilátky, T lymfocyty diferencují na Th buňky (pomocné – helper) a Tc buňky
(cytotoxické).
Buněčné subpopulace na svém povrchu exprimují (vystavují) specifické molekuly (znaky,
receptory). Strukturně se jedná o glykoproteiny a jsou pro jednotlivé subpopulace typické.
Jednotlivé znaky můžeme uspořádat do skupin, jež charakterizují nejen buněčnou linii, ale i
stav diferenciace buňky nebo její aktivaci.
Pro označování diferenciačních znaků se používá jednotný systém, tzv. CD klasifikace (z ang.
Cluster of Differentiation). Každý znak definované struktury, rozpoznatelný skupinou
(clustrem) monoklonálních protilátek, je označen číslem, např. CD1. CD2, CD3, atd. Každý
nově objevený znak dostane další pořadové číslo, které neříká nic o struktuře znaku (jedná se
197
jen o „inventurní“ systém). V současné době bylo charakterizováno již víc než 400 takových
znaků.
14.3.4.2. Princip
Některé povrchové molekuly (CD znaky) jsou společné pro více druhů leukocytů, protože
zajišťují společné základní funkce, jiné mohou být přítomné specificky pouze na určité
subpopulaci. Toho se využívá při imunofenotypizaci leukocytů průtokovou cytometrií:
Buňky v plné krvi se inkubují s monoklonální protilátkou proti vyšetřovanému antigenu (CD
znaku), přičemž protilátka je označena fluorescenčním barvivem (přímá fluorescence). Vazba
protilátky na buněčnou strukturu je vyhodnocována průtokovou cytometrií.
Buňky je možné současně označit více fluorochromy a tím detegovat najednou více znaků.
Počítačové zpracování naměřených dat pak umožní selektivní analýzu a zobrazování
konkrétní cílové subpopulace – tzv „gatování“ (elektronické ohraničení, gating). Takto lze
získat údaje o subpopulaci buněk charakterizovaných na základě jiného znaku, např.
zastoupení znaku CD4 na CD3 pozitivních buňkách (CD3 je typický pro T-lymfocyty,
kombinace CD3 a CD4 signálu z nich vyselektuje Th lymfocyty), nebo přítomnost
„aktivačního“ znaku na CD3 pozitivních lymfocytech (kombinace aktivačního znaku a CD3
vyselektuje pouze aktivované T-lymfocyty) apod.
Obr.161: Příklady gatování: na ose x dvouparametrového grafu je vynesen jeden parametr,
na ose y druhý, barevně je zobrazena cílová subpopulace.
14.3.4.3. Reagencie a postupy
Pro imunologické aplikace průtokové cytometrie se používají fluorescenčně značené
monoklonální protilátky. Lze používat přímou imunofluorescenci (protilátka proti
zkoumanému antigenu je označená fluoroforem) i nepřímou fluorescenci (protilátka proti
zkoumanému antigenu není značená a k její detekci se používá značená protilátka proti této
protilátce). Výhodou přímé fluorescence je jednodušší zpracování vzorku; nepřímá
fluorescence se používá v případě, že protilátka proti zkoumanému antigenu není k dispozici
ve formě konjugátu s fluorochromem nebo v případě sledování slabě exprimovaného antigenu
(nepřímá fluorescence poskytuje intenzivnější signál).
Pro značení protilátek je dostupná celá řada fluorochromů ať samostatných nebo tzv.
tandemových, u kterých excitace primárního fluorochromu aktivuje sekundární fluorochrom.
Pro průtokovou cytometrii jsou nutné některé další reagencie, které se využívají např. k fixaci,
lyzaci erytrocytů nebo permeabilizaci buněčných membrán leukocytů. Permeabilizace je
šetrné poškození membrány, aby byla průchodná pro reagencie, které musí proniknout do
198
buňky, což je nezbytné při vyšetřování cytoplazmatických nebo jaderných antigenů,
vyšetřování obsahu buněčné DNA a RNA a dalších aplikacích.
Cytometrie umožňuje tzv.kvantimetrii, tj. určení množství (intenzitu exprese) antigenu na
jednotlivých buňkách na základě množství navázané protilátky. Kvantifikace se provádí
srovnáním fluorescenčního signálu buněk s kalibrační křivkou sestrojenou na základě měření
kalibračních částic - kuliček se známým množstvím navázaného fluorochromu.
Některé cytometry mají jako jeden z parametrů i čas, takže lze provádět i kinetické studie
(např.měření změn hladin intracelulárního kalcia po stimulaci buňky, stanovení aktivity
intracelulárních enzymů).
14.3.4.4. Přístroje
Analýzy jsou prováděny na flow cytometrech se složitým optickým systémem (více laserů a
detektorů pro fluorescenci různých vlnových délek) a možností softwarové kompenzace
překryvu emisních spekter jednotlivých fluorochromů, ke kterému dochází při multibarevné
analýze.
Obr.162: Překryv emisních spekter
ekvivalentních koncentrací
samostatných (FITC,PE) a
tandemových (PE-TR, PE-Cy5)
fluorochromů, vymezení snímaných
vln. délek pásmovými filtry
Převzato z Iuri Marinov: Průtoková
cytometrie v klinické hematologii,
Praha, Triton 2008
Obr.163: flow cytometr se sorterem
Některé typy moderních průtokových cytometrů (např.
Calibur Becton–Dickinson, iCyt Eclipse, Partec CyFlow
aj.) jsou vybaveny „sorterem“ - zařízením pro fyzické
roztřídění buněk do více frakcí: Fokuzovaný proud buněk
prochází vibračním mechanismem, který způsobí rozpad
fokuzovaného proudu na jednotlivé kapičky, z nichž každá
obsahuje pouze jednu buňku (toho lze dosáhnout
kmitáním piezoelektrického krystalu). Po průchodu
paprskem laseru je buňkám udělován elektrický náboj (+
nebo -), pokud splňují určité kritérium. Buňky nesoucí
náboj jsou pak rozděleny do sběrných zkumavek
elektrostaticky pomocí nabitých vychylovacích destiček.
Průtoková cytometrie umožňuje analyzovat desetitisíce
buněk v jednom vzorku (na rozdíl od starší metody - fluorescenční mikroskopie).
199
V současné době jsou pro imunologické aplikace na trhu průtokové cytometry řady firem:
Becton-Dickinson, BioRad, Coulter Electronics, Kratel, Meridian Instruments, Ortho, Partec
aj.
14.3.5. Multiplexové metody
Flow cytometrie byla vyvinuta pro analýzu buněk, dokáže však detegovat jakékoli částice
velikosti řádově v μm, např. inertní mikrosféry (kuličky) obarvené různými fluorochromy.
Takovéto mikrosféry se používají pro kalibraci flow cytometrů (viz. kvantimetrie), mohou
však sloužit jako pevná báze pro multiplexové analýzy. Multiplexové systémy umožňují
stanovení velkého počtu analytů z minimálního objemu vzorku.
Dostupné multiplexové systémy jsou dvojího typu: planární, které jsou vlastně rozšířením
ELISA metody, a „bead-based“ multiplexové analýzy (na mikrosférách) zpracovávané flow
cytometrií.
Multiplexové analýzy na mikrosférách představují nejnovější aplikaci průtokové cytometrie.
Mikroskopické polystyrenové kuličky (beads) jsou obarveny různými koncentracemi dvou
fluorescenčních barviv, jejichž vzájemné kombinace tvoří až 500 různých barevných odstínů
(typů) mikrosfér. Na každém typu mikrosféry je navázaná specifická protilátka nebo proba
rozpoznávající a vázající určitou molekulu (antigen, protilátku, receptor, substrát enzymu,
DNA, RNA atd.). Po smísení mikrosfér se vzorkem (např. sérem, plazmou, buněčným
lyzátem) v jamce mikrotitrační destičky dojde ke specifickému navázání příslušného analytu
ze vzorku na povrch mikrosféry. Ke směsi je následně přidána fluorescenčně značená
protilátka proti navázanému analytu.
Obr.164: Princip
multiplex. analýzy na
mikrosférách
Pro multiplexové metody je typické, že se různé typy mikrosfér kombinují do setů, které pak
umožňují simultánní stanovení velkého počtu analytů z jednoho vzorku. Výsledná suspenze
mikrosfér s navázaným komplexem se následně vyhodnocuje průtokovou cytometrií, kdy
přístroj registruje nejdříve zbarvení vlastní mikrosféry (identifikuje navázaný analyt) a poté
kvantifikuje analyt na základě intenzity fluorescence značené protilátky.
Nejznámějším multiplexovým systémem pro flow cytometrii je Luminex xMAP (Multiple
Analyte Profiling) , který teoreticky umožňuje 50 – 500 simultánních analýz. Techniku a
reagencie Luminex dodává řada firem, např. Applied Cytometry System, Biosource
International, Mirai Bio, Qiagen, Upstate, LINCO Research, Marligen Bioscience, BioRad,
Invitrogen, Millipore a další. Kapacitu systému Luminex (až 500 typů mikrosfér – 500
simultánních stanovení) lze využít prakticky pouze pro analýzu nukleových kyselin; při
analýze proteinů při velkém počtu simultánních reakcí hrozí větší riziko zkřížených reakcí
protilátek a interferencí. Systém Luminex pro zpracování analýz vyžaduje speciální flow
cytometry (Luminex nebo BioRad).
200
Druhou možností je CBA (Cytometric Bead Array) firmy BD Bioscience, který dovoluje
simultánní stanovení 30-ti analytů a měření lze provádět na jakémkoli multibarevném flow
cytometru.
Podobný systém vyrábí i Beckman Coulter, který místo kombinace dvou barev na
mikročástici využívá kombinaci dvou mikrosfér pro každou metodu.
Spektrum možných aplikací zahrnuje cytokiny, chemokiny, růstové faktory, zánětlivé a
kardiální markery, tumormarkery, hormony, specifické IgE, izotypy imunoglobulinů,
protilátky, fosfoproteiny, intracelulární signální molekuly, HLA testování, genotypizaci a
další.
201
15. Osmometrie
15.1. Princip
Osmometrie je analytická metoda k měření koncentrace částic v roztoku. Tato metoda
využívá změn, které způsobí částice rozpuštěné v rozpouštědle tzv. koligativních vlastností
roztoku.
Rozpuštění látky v rozpouštědle vede ke:
 snížení tenze vodních par
 zvýšení teploty varu (ebulioskopický efekt)
 snížení teploty tuhnutí (kryoskopický efekt)
 vzniku osmózy - zvýšení osmotického tlaku
Všechny tyto vlastnosti jsou závislé pouze na počtu rozpuštěných částic a nikoliv na
rozpuštěné látce jako takové.
15.1.1. Osmotický tlak (π)
Osmotický tlak je tlak nízkomolekulárních látek a iontů v rozpouštědle. Jestliže jsou dva
vodné roztoky o různé koncentraci od sebe odděleny polopropustnou membránou, která je
propustná pouze pro vodu (ne pro rozpuštěné částice), potom proniká voda z prostoru s nižší
koncentrací rozpuštěných částic, do prostoru s vyšší koncentrací rozpuštěných částic. Tento
pohyb molekul vody se nazývá osmóza. Tlak, který je třeba vyvinout k zabránění pohybu
vody přes membránu, se nazývá osmotický tlak (obrázek č. 164).
Obrázek 164: Osmotický tlak
Osmotický tlak vzniká důsledkem působení celkového počtu osmoticky aktivních částic v
roztoku bez ohledu na jejich velikost. Každá částice – molekula, atom nebo iont v roztoku se
podílí na konečné hodnotě osmotického tlaku stejnou mírou. Osmoticky aktivní jsou pouze
částice, které jsou rozpuštěné v roztoku a které nemůžou volně přecházet přes membránu.
Pokud látka disociuje, je každá její disociovaná část osmoticky aktivní částicí. Nedisociovaná
látka představuje jen jednu osmoticky aktivní částici.
Osmotický tlak lze vyjádřit vztahem pro ideální roztok (van’t Hoffova rovnice, rovnice č.1):
π = i x c x R x T
kde:
π = osmotický tlak (Pa = J m-3
)
202
i = disociační číslo, počet částic, na které rozpuštěná látka disociuje – např. i =1 pro
neelektrolyty,
i = počet osmoticky účinných částic (pro silné elektrolyty)
c= molární koncentrace (mol L-1
)
R= molární plynová konstanta (8,31441 J mol-1
K-1
)
T= termodynamická teplota (K)
15.1.2. Osmolární koncentrace
Osmometrie je technika k měření koncentrace rozpuštěných částic v roztoku, tzv. osmolární
koncentrace. Osmolární koncetrace se vyjadřuje jako osmolarita nebo osmolalita.
Osmolarita (mol . l-1
, osmol . l-1
) – se vyjadřuje na objem (l) roztoku.Osmolarita je molarita
(mol/l), je to látková koncentrace osmoticky aktivních látek. Osmolarita je množství všech
osmoticky aktivních látek v 1 l roztoku.
Osmolalita ( mol · kg –1
nebo osmol · kg -1
) – vyjádřená na kg rozpouštědla. Je to
koncentrace osmoticky aktivních látek v jednotce hmotnosti rozpouštědla. Na rozdíl od
osmolarity se jedná o množství látek v objemu rozpouštědla (tj. bez rozpuštěných látek).
Osmolalita je stejná jako molalita (mol · kg –1
) u neelektrolytů nebo vyšší u elektrolytů, tj.
látek disociujících, než molalita téhož roztoku. Např. 1M roztok glukózy a 1M roztok NaCl
mají stejnou molalitu, tj. 1 mol/kg. Molekula glukózy nedisociuje, proto je osmolalita tohoto
roztoku rovna 1 osmol/kg. Roztok NaCl disociuje tak, že z jedné molekuly NaCl vzniknou
dva ionty (Na+
, Cl),
z nichž oba jsou osmoticky aktivní, proto osmolalita tohoto roztoku je 2
osmol/kg.
Osmol je mol osmoticky aktivních látek. Osmolalita vyjádřená v mmol/kg rozpouštědla je z
termodynamického hlediska přesnější, protože koncentrace roztoku vztažená na váhu
rozpouštědla není závislá na teplotě.
U silně naředěných vodních roztoků se hodnota osmolarity a osmolality téměř neliší, protože
1 l vody se přibližně rovná 1 kg vody a množství rozpuštěných látek je možné zanedbat.
15.2. Měření osmotického tlaku
V laboratoři se používá nepřímé měření osmotického tlaku. Vychází se z měření těch
vlastností roztoku (koligativní vlastnosti), které se mění v závislosti na změně osmolality.
Přístroje pro měření osmolality se nazývají osmometry. Nejvíce používaná metoda k měření
osmolární koncentrace je metoda založena na měření snížení bodu tuhnutí - kryoskopie.
15.2.1. Kryoskopie
Osmometry založené na kryoskopickém principu využívají snížení teploty tuhnutí roztoku
v závislosti na koncentraci částic v roztoku. Bod tuhnutí čisté vody je 0,000 °C, 1mol roztok
glukózy rozpuštěný v 1kg vody má bod tuhnutí snížen o -1,858 °C. Kryoskopický osmometr
musí být vybaven velmi citlivým teploměrem, protože snížení teploty tuhnutí je velmi malé. 1
mmol látky rozpuštěný v 1 kg vody, sníží bod tuhnutí o 0,001858 ºC.
Průběh kryoskopického měření (obrázek č.2):
 Vzorek se nejprve pomalu termoelektricky ochladí několik stupňů pod bod tuhnutí.
 Poté se mechanicky indukuje začátek krystalizace.
 V tomto bodě se při krystalizaci uvolňuje skupenské teplo tuhnutí – dojde ke zvýšení teploty
přesně na teplotu tuhnutí.
 Teplota tuhnutí je stejná po dobu, kdy se uvolňuje skupenské teplo tuhnutí rozpouštědla „fáze
platau“.
 Teprve pak pokračuje ochlazování mrznoucího roztoku.
203
 Pokles bodu tuhnutí roztoku (vzorku) proti bodu tuhnutí rozpouštědla (vody) je přímo
úměrný osmolalitě.
Jednotlivé přístroje se liší způsobem, jakým vyvolávají začátek krystalizace podchlazeného
měřeného vzorku. Může to být krátkodobá vibrace kovového drátku, poklep kladívka na stěnu
měřící nádobky nebo účinek ultrazvukových vln.
Obrázek 165 Kryoskopická teplotní křivka
15.2.2. Ebulioskopie
Ebulioskopická osmometrie sleduje snížení tenze vodních par nad roztokem, zvýšení bodu
varu (ebulioskopický efekt) v závislosti na koncentraci osmoticky aktivních částic v roztoku.
Jeden osmol jakýkoliv částic rozpuštěných v jednom kg vody způsobí zvýšení teploty varu
(ebulioskopický efekt) o + 0,52 ºC a snížení tenze vodních par rozpouštědla nad roztokem o
0,3 mmHg (39,9 Pa). Osmoticky aktivní částice v roztoku snižují proporcionálně tenzi
vodních par, což vede ke snížení rosného bodu. Rosný bod je teplota, při které je vzduch
maximálně nasycen vodními parami, pokud teplota klesne pod teplotu rosného bodu, nastává
kondenzace vodních par. Strmost poklesu rosného bodu je 0,303 ºC na osmol/kg, tento pokles
je velmi nízký a vyžaduje vyšší rozlišení při měření teploty (0,0003ºC) stejně jako měření
zvýšení teploty varu (ebulioskopie- zvýšení bodu varu bodu varu o +0,52 ºC na 1
osmomol/kg). Při měření interferuje přítomnost alkoholu a jiných těkavých látek.
15.2.3. Koloidní osmometr
Jeden osmol jakýchkoliv částic rozpuštěných v jednom kg vody způsobí zvýšení
osmotického tlaku o 17 000 mmHg (2266 kPa). V praxi není možné měřit osmolární
koncentraci látek přímo měřením osmotického tlaku, tzn. tlaku vznikajícího na
semipermeabilní membráně propustné pouze pro vodu, protože dostupná semipermeabilní
membrána je vždy propustná pro malé ionty. I kdyby existovala vhodná membrána, tlak ,
který je vyvíjen na membránu, je enormně vysoký (1 osmol způsobí zvýšení osmotického
tlaku o 2266 kPa ) a membrána by praskla. Pokud bychom chtěli měřit pouze osmoticky
aktivní molekuly proteinů, můžeme měřit osmotický tlak pomocí koloidního osmometru, kde
si zvolíme odpovídající membránu s cut off hodnotou 10 – 20 000 Da, která není propustná
pro proteinové molekuly. Pro měření celkové osmolality nelze koloidní osmometr použít.
Koloidní osmometr – onkometr (obr. č. 166) se používá vzácně k měření tzv. onkotického
tlaku – tlaku plazmatických bílkovin. K měření se používá polopropustná membrána, která
odděluje tekutiny (referenční a měřenou), o různé koncentraci vysokomolekulárních látek.
Principem měření onkotického tlaku je sledování rozdílu tlaku mezi referenční komůrkou a
komůrkou s měřeným vzorkem. Rozdíl tlaků je měřen piezoelektricky.
204
Obrázek 166 Schéma koloidního osmometru - onkometru
15.3. Stanovení osmolality v biologickém materiálu
Nejčastěji používaná metoda k měření osmolární koncentrace v biologických tekutinách
(plazmě, séru, moči) je založena na měření snížení bodu tuhnutí - kryoskopie. Je to robustní
metoda, která má široké použití ve všech klinických zdravotnických laboratořích. Lidská
plazma (podobně i plná krev a sérum) vykazuje snížení bodu tuhnutí v v rozmezí 0,54 ± 0,014
ºC (0,512 – 0,568 ºC). Pokud 1 mol osmoticky aktivních častic sníží teplotu tuhnutí o -1,858
ºC, pak snížení o -0,54 ºC představuje hodnotu osmolality 0,54/1,858= 0,2906 mol/kg= 290,6
mmo/l. Stejného výpočtu používají osmometry založené na kryoskopickém principu.
15.3.1. Osmolalita séra (plazmy)
Osmolalita charakterizuje osmotickou kapacitu tekutiny, schopnost působit osmotickým
tlakem na semipermeabilní membránu. Osmolalita plazmy se za fyziologických podmínek
pohybuje v rozmezí 285 ± 10 mmol/kg a je velmi přísně regulována pomocí osmoreceptorů
v mezimozku, které regulují sekreci adiuretinu (ADH), jež ovlivňuje zpětnou resorpci vody
v distálním tubulu ledvin. Systémy řídící příjem a výdej vody zajišťují nejen konstantní objem
celkové tělesné vody, ale i konstantní osmolalitu. Nemáme-li k dispozici osmometr, lze
k odhadu osmolality použít výpočet. Nejvíce rozšířená je rovnice
Osmolalita séra (vypočítaná) = 2xNa+
+ urea + glukóza
Kde: Na+
, urea, glukóza jsou plazmatické koncentrace v mmol/l. Ve vzorci se počítá
s hlavním extracelulárním kationtem (Na+
), koeficient 2 započítává i odpovídající anionty.
Urea a glukóza jsou jediné z běžně měřených složek plazmy, které mohou zvláště za
patologických stavů dosáhnout koncentrace významně ovlivňující osmolalitu.
15.3.2. Osmolální okno (osmolal gap)
Je rozdíl mezi měřenou a vypočítanou osmolalitou. Odhadovaná osmolalita podle uvedené
rovnice odpovídá osmolalitě měřené, pokud se v plazmě nesvyskytují patologické látky
zvyšující osmolalitu (tabulka č. 9). Obě hodnoty se běžně shodují, resp. liší pouze v intervalu
do 5, maximálně 10 mmol/kg vody. Porovnání výpočtu s měřením je užitečné tam, kde je
podezření na přítomnost látek o malé molekule, s nimiž výpočet nepočítá. Např. 1 g etanolu
(tedy 1 promile alkoholu) v plazmě zvýší naměřenou osmolalitu o cca 23 mmol/kg vody.
205
Patologická
látka
Potenciální letální
koncentrace (mg/l)
Osmolální okno
(mmol/ kg vody)
etanol 3500 81
etyléter 1800 70
izopropanol 3400 60
metanol 800 27
ethylenglykol 210 3,4
Tabulka 9
Dalším stavem, kdy neodpovídá vypočtená osmolalita měřené osmolalitě, je extrémně vysoká
plazmatická koncentrace bílkovin nebo lipidů. V těchto případech se mění podíl vody
v plazmě a výpočet, který počítá s koncentrací látek na 1 l plazmy, nemůže odpovídat
změřené hodnotě, která se vztahuje na 1 kg vody.
15.3.3. Osmolalita moče
Osmolalita moče se pohybuje u dospělého člověka v rozmezí 250 – 1200 mmol/kg při
maximálním koncentračním úsilí zdravých ledvin. Na osmolalitě moče mají hlavní podíl
kationty – Na+
, K+
, NH4
+
a urea. Koncentrační schopnost ledvin je menší u kojenců a
postupné snižování je fyziologické i vlivem stárnutí.
15.4. Diagnostický význam stanovení osmolality
15.4.1. Osmolalita séra (plazmy)
O osmolalitě séra (plazmy) rozhoduje především Na+ a odpovídající anionty, dále urea,
glukóza a v malé míře bílkoviny. Podíl urey se stává významnějším až s její retencí
v organizmu, podíl glukózy roste u dekompenzovaného diabetika nebo při intoleranci glukózy
u kriticky nemocných. Podíl bílkovin, tzv. koloidně osmotický tlak, je významný pro udržení
cirkulujících tekutin v cévním řečišti. Při patologicky zvýšených hodnotách osmolality
hovoříme o hyperosmolalitě a naopak při snížených hodnotách osmolality jde o stav, který se
nazývá hypoosmolalita.
Hyperosmolalita ( > 300 mOsm)
Hypoosmolalita ( < 270 mOsm)
15.4.2. Osmolalita moče
Stanovení osmolality moče má diagnostický význam u onemocnění ledvin. Podle hodnoty
osmolality moče se posuzuje koncentrační schopnost ledvin. Porucha koncentrační schopnosti
ledvin patří k prvním známkám onemocnění ledvin.
15.5. Technická řešení výrobců - nejvíce používané kryoskopické osmometry
Osmometr Arkray OM 6050 a OM 6060 výrobce ARKRAY Inc. (Japonsko)
Tento přístroj je plně automatizovaný, je vybaven podavačem vzorků, má integrovanou
termotiskárnu a čtečku čárového kódu. Potřebný objem vzorků pro měření je 200 µl, čas
měření je 2 - 3 minuty. Rozsah měření je 0-2500 mOsm/kg, přesnost měření udává výrobce
<1% (CV).
Průběh měření:
Tryska natáhne vzorek a pošle ho do měřící cely. Thermo-module 2 je aktivován a postupně
ochlazuje teplotní modul (Thermo module 1 a 3). To způsobuje superchlazení: vzorek
v měřící cele je ještě kapalný v bodě tuhnutí (tání). Thermo modul 3 je aktivován k chlazení
chladícího bloku(Cryogenic Cooling Blocku), dokud teplota nepoklesne pod teplotu tuhnutí.
Indukce krystalizace se provádí účinkem ultrazvukových vln. Vzorek v bloku tuhne
206
(zmrzne). Provede se měření teploty - pokles bodu tuhnutí roztoku (vzorku) proti bodu
tuhnutí rozpouštědla (vody), který je je přímo úměrný osmolalitě. Na Thermo-moduly 1 a 3
je aplikován opačný proud k zahřátí tepelného bloku ( Heat Blocku) a chladícího bloku
(Cryogenic Cooling Blocku). Vzorek roztaje do svého původního kapalného stavu. Tryska
přenese vzorek z měřící cely do odpadní nádobky (obrázek č.167).
Obrázek 167 Schéma měřící cely analyzátoru Advaced
Osmometr Fiske 210 (výrobce: Advanced Instrument, USA)
Jedná se o jednovzorkový přístroj vhodný pro malé laboratoře. Potřebný objem vzorků pro
měření je 20 µl, čas měření je 90 vteřin. Rozsah měření je 0-2000 mOsm/kg, přesnost měření
udává výrobce <1% (CV).
Průběh měření:
Vzorek je dávkován speciální pipetou, která dávkuje a umísťuje vzorek do měřící komůrky a
zároveň aktivuje spouštěcí spínač chladící komůrky. Teplota v chladící komůrce je udržována
pomocí modulu s termoelektrickými články. Pro indukci krystalizace používá poklep kladívka
na chladící komůrku. Dynamické změny teploty vzorku se automaticky měří pomocí
termistoru a hodnoty se zobrazují na displeji.
207
16. Molekulárně biologické vyšetřovací techniky
Molekulárně biologické metody postupně pronikají do mnoha odvětví. Využívají se
v biologických vědách, v lékařské genetice, mikrobiologii, biochemii, genetickém inženýrství,
ale také v antropologii, onkologii nebo v kriminalistice. V této kapitole je uveden princip
základních molekulárně biologických technik a jejich možné využití v klinické praxi.
16.1. Metody průkazu specifické nukleové kyseliny
16.1.1. Hybridizační techniky
Tyto techniky jsou založeny na principu spojování dvou jednořetězcových molekul
nukleových kyselin za tvorby hybridu DNA-DNA, DNA-RNA nebo RNA-RNA. Jednou
z této dvojice je obvykle tzv. hybridizační sonda, což je krátký úsek nukleové kyseliny (od
20-ti do několika tisíc nukleotidů) značený radionuklidem, chemiluminiforem, heptenem,
antigenem nebo enzymem, která je komplementární k hledané sekvenci DNA či RNA.
Hybridizační reakce může probíhat dvěma způsoby: buď jsou obě vlákna volně rozptýlena v
roztoku nebo je jedna z hybridizujících složek navázána na pevný nosič.
Obr.168 Hybridizace
16.1.1.1. Hybridizace v roztoku
Při této metodě jsou nukleová kyselina i hybridizační sonda rozptýleny v roztoku a mohou
spolu volně reagovat. Po přidání enzymu S1-nukleázy, který selektivně rozloží pouze
jednořetězcovou DNA, zůstanou v roztoku pouze dvouřetězcové hybridy. Ty mohou být
potom vysráženy z roztoku kyselinou trichloroctovou nebo vyvázány na hydroxyapatit. Pro
rutinní použití je však tato metoda příliš pracná a používá se tzv. HPA – Hybridization
Protection Assay, kde je sonda označená akridinesterem navázána na mikročástici
s kovovým jádrem, což usnadňuje separaci. Celá reakce probíhá v těchto krocích:
- extrakce nukleové kyseliny (výhodné je využití 16S ribozomální RNA pro vyšší
výtěžnost)
- hybridizace při teplotě 60°C
- separace hybridů a degradace nenavázaných sond
- promývání roztoku
- indukce luminiscence a měření její intenzity v luminometru.
208
16.1.1.2. Hybridizace na pevném nosiči
Na rozdíl od předchozí metody je zde hybridizační sonda navázána na pevný nosič a
kinetika této reakce je proto pomalejší a relativně málo efektivní. Tohoto principu se využívá
hlavně u testů, kde stanovujeme více markerů současně, např. více subtypů jednoho
infekčního agens (tzv. multiple tests), nebo při HLA typizaci. Můžeme testovat naráz až
dvacet rozdílných sond, které jsou navázány např. na nylonový proužek.
Mezi varianty hybridizace na pevném nosiči patří dot-, blot- a slot- hybridizace, Southernův
přenos (popsaný v kapitole věnované detekci mutací) a hybridizace RNA (Northern blotting).
Imobilizace vzorků se provádí nejčastěji na membrány z nitrocelulózy nebo nylonu.
Nukleovou kyselinu před testováním předem extrahujeme a zpravidla i amplifikujeme (pro
vyšší citlivost testu) a označíme např. biotinem (pro následnou vizualizaci). Další modifikací
této metody je tzv. Sandwich hybridization assay, kde primární sonda není značena a je
použita druhá označená sonda (komplementární s jiným úsekem nukleové kyseliny) nebo
přímo protilátka proti nukleové kyselině.
16.1.1.3. Hybridizace in situ
Je v podstatě variantou hybridizace na pevném nosiči s tím rozdílem, že hybridizace probíhá
přímo v morfologicky intaktní tkáni, v buňkách nebo na chromozomech, které jsou fixovány
na mikroskopickém sklíčku. To s sebou nese dva částečně protichůdné požadavky: co
nejdokonalejší uvolnění analyzované nukleové kyseliny a co nejšetrnější fixace tkáně pro
morfologickou analýzu.
Vyšetřovaná nukleová kyselina musí být nejprve denaturována. Na ni je pak podle pravidel
komplementarity bází navázána sonda. Navázání sondy na vyšetřovanou DNA se projeví jako
hybridizační signál, který můžeme pozorovat pod mikroskopem.
Značení sond může být přímé, což umožňuje pozorovat hybridizační signál ihned po
skončení hybridizace, ale nevýhodou je, že signál nelze zesílit. K přímému značení se
nejčastěji využívá fluorescenční barvivo fluorochrom (např. u metody FISH - Fluorescence
In Situ Hybridization) nebo radioaktivní izotop. Při nepřímém značení je sonda značena
haptenem, který je následně detekován pomocí značené protilátky. Hybridizační signál je
v tomto případě možné zesílit.
16.2. Metody pro stanovení pořadí nukleotidů
16.2.1. Sekvenování (sekvenace, sekvencování)
Sekvenační biochemické metody zjišťují pořadí nukleových bází (A, C, G, T) v sekvencích
DNA (jaderné, mitochonriální nebo plazmidové). Dnes je známo již velké množství metod
sekvenování DNA, které se liší jak některými základními principy, tak především cenou a
rychlostí. V této kapitole se budeme věnovat jen několika nejzákladnějším metodám
sekvenace.
Obr.169 Sekvenace dle Sangera vyhodnocená počítačem
209
16.2.1.1. Sekvenace dle Sangera
Od 70. let 20. století je používána metoda Fredericka Sangera, která využívá
dideoxynukleotidů a následné elektroforézy. Dideoxynukleotid se začlení do replikující se
DNA, ale vzhledem k absenci OH skupiny zastaví elongaci (prodlužování) řetězce.
Vybraná sekvence DNA se vloží do reakční směsi, jež obsahuje vhodný radioaktivně
označený primer (např. pomocí P32
), DNA polymerázu (Taq polymeráza), zásobu čtyř
esenciálních deoxyribonukleotidů (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), ale navíc také jeden ze čtyř
dideoxynukleotidů, např. ddATP. Elongace tedy v tomto případě skončí vždy adeninem, ale
na různých místech DNA řetězce. Do další zkumavky se přidá jiný dideoxynukleotid, celkem
budeme mít tedy čtyři zkumavky.
Různě dlouhé fragmenty DNA se pak rozdělí elektroforézou v gelu. Porovnáním čtyř vedle
sebe umístěných elektroforetických gelů snadno zjistíme, jak za sebou následovaly nukleové
báze ve zkoumané sekvenci DNA.
Sangerova metoda má také mnoho alternativ, nové modifikace této metody např. místo
označení radioaktivním primerem využívají fluorescenční barviva navázaná na jednotlivé
dideoxynukleotidy. Výhoda je v tom, že místo čtyř zkumavek lze použít jen jednu, protože při
elektroforéze jsou jednotlivé nukleové báze označené různými fluorescenčními barvami.
Obr.170 Princip sekvenace dle Sangera
16.2.1.2. Maxam-Gilbertova metoda
Sekvenace, kterou v roce 1977 vyvinuli Allan Maxam a Walter Gilbert, se označuje jako
degradační či chemické sekvenování. Principem této metody je specifická chemická
degradace purinových a pyrimidinových bází. Purinové báze jsou modifikovány pomocí
dimethylsulfoxidu, pyrimidinové pomocí hydrazinu. Poté je pomocí 1M piperidinu při 90°C
štěpena cukrofosfátová kostra v místě příslušné modifikované baze. Štěpení DNA je náhodné,
při poměru ve prospěch DNA se rozštěpí pouze každá 3-4 báze.
210
Rozštípaná DNA se následně nanese na polyakrylamidový gel a nechá se proběhnout
elektroforéza, která seřadí všechny sekvence podle jejich délky. Posledním krokem je
zviditelnění těchto sekvencí pomocí rentgenového záření (po prvotním označení jejich konců
radioaktivními značkami) a určení pořadí nukleových bází v původním vzorku DNA.
16.2.1.3. Pyrosekvenování (angl. pyrosequencing)
Jde o novější metodu sekvenování DNA, která vznikla v roce 1996. Je sice (podobně jako
Sangerova metoda) založena také na syntéze nových sekvencí DNA, ale liší se způsobem, jak
je detekováno začlenění daného nukleotidu a nevyžaduje elektroforézu. Ve směsi pro
pyrosekvenování musí být však přítomno velké množství enzymů, mimo DNA polymerázy
ještě ATP sulfuryláza, luciferáza a apyráza; ze substrátů pak adenosinfosfosulfát a luciferin.
Do této směsi jsou postupně vkládány nukleotidy různých typů (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Když se po přidání jednoho z nich uvolní světelné záření, znamená to, že se do vznikajícího
řetězce začlenil jeden nebo více nukleotidů tohoto typu. Toto světlo zde vzniká v důsledku
enzymatické reakce, na jejímž začátku je uvolnění pyrofosfátu z nově začleněného nukleotidu
a na jejímž konci je spotřeba vzniklého ATP luciferázou k oxidaci luciferinu.
Obr.171 Výsledek pyrosekvenování
16.2.1.4. Sekvenace nové generace (NGS – next generation sequencing)
Rozvoj molekulární biologie s nutností sekvenovat stále větší úseky DNA (nejlépe celé
geonomy) v krátkém čase a za nejnižší cenu vyvolal potřebu nových technologií. První
metodou nové generace se stala technologie tzv. masivního paralelního sekvenování (MPSS),
další metodou je pak pyrosekvenování (popsané výše).
Podstatou nových metod je vazba fragmentu nukleové kyseliny na mikrokuličky. Při
emulzní PCR pak dochází na každé kuličce ke klonální amplifikaci – všechny molekuly DNA
pochází z jediné molekuly templátu. Čtení sekvence je řešena buď sekvenováním syntézou
(např. u pyrosekvenování), nebo sekvenováním založeném na ligaci.
Nejnovější technologie, zatím pouze ve vývoji, jsou založeny na principu sekvenování
jednotlivých molekul DNA procházejících nanometrickým pórem v křemíkovém čipu. Tento
přístup slibuje výrazné výhody z hlediska nákladů, šíře aplikačního použití i rychlosti
sekvenování.
211
Obr.172 Princip klonální amplifikace
16.3. Metody založené na amplifikaci nukleové kyseliny
Amplifikace znamená obecně zesílení, v případě DNA zmnožení předem určeného úseku.
Jedinečným nástrojem pro amplifikaci nukleových kyselin je metoda nazývaná PCR
(Polymerase Chain Reaction).
16.3.1. PCR (Polymerase Chain Reaction, polymerázová řetězová reakce)
PCR jako laboratorní techniku objevil v roce 1983 v Kalifornii prof. Kary Banks Mullis.
Vynález PCR byl pro molekulární biologii skutečnou revolucí a v současné době je PCR se
svými modifikacemi jednou z nejpoužívanějších technik v tomto oboru.
Základním principem PCR je opakovaná řízená denaturace dvouřetězcové DNA a následná
renaturace jednotlivých řetězců se specifickými oligonukleotidy (tzv. primery) o velikosti 20-
30 nukleotidových bází, které jsou do reakční směsi cíleně přidány. Tyto oligonukleotidy
slouží jako počátky pro syntézu nových řetězců DNA, a tím v podstatě ohraničují nově
vznikající úseky z obou stran (primery bývají zpravidla dva a označujeme je z angličtiny jako
Forward a Reverse). Vlastní amplifikace DNA pak probíhá v opakujících se cyklech, které se
skládají ze tři kroků:
DENATURACE
Po zahřátí DNA na teplotu kolem 95°C se rozpadnou vodíkové můstky mezi vlákny DNA,
čímž se dsDNA (dvouřetězcová) rozdělí na ssDNA (jednořetězcové).
HYBRIDIZACE (navázání či nasednutí primerů)
V anglické literatuře se tato fáze označuje termínem annealing (to anneal = žíhat, kalit kov,
tzn. po rozpálení prudce ochladit). Probíhá nejčastěji při teplotách kolem 50– 60°C. Molekuly
jednořetězcové DNA po ochlazení na tuto teplotu opět renaturují. Pokud jsou ve směsi v
nadbytku specifické oligonukleotidy (primery), budou hybridizovat se svou komplementární
sekvencí rychleji než dlouhé jednořetězcové molekuly, jejichž koncentrace je mnohem nižší.
Teplota, při níž hybridizace probíhá, je pro výsledek PCR velmi důležitá a musí být
individuálně nastavena pro daný pár primerů. Při příliš nízké teplotě mohou primery nasedat i
na ne zcela komplementární sekvence a vytvoří se tím nespecifický produkt. Při příliš vysoké
teplotě zase budou primery málo hybridizovat a produkt se nevytvoří vůbec nebo jen v malém
množství.
ELONGACE (extenze, syntetická fáze)
Oligonukleotidy, které se navázaly na jednořetězcovou DNA v předchozím kroku, slouží v
tomto kroku jako primery (počáteční místa replikace). Při teplotě 70-75°C začne probíhat
syntéza nových vláken směrem od 5´-konce k 3´-konci. Tato syntéza je katalyzována DNA
polymerázou (zpravidla termostabilní Taq polymerázou původně izolovanou z bakterie
Thermus aquaticus z horkých pramenů Yellowstonského národního parku) a samozřejmě
212
probíhá pouze za přítomnosti čtyř esenciálních deoxyribonukleotidů (dATP, dGTP, dCTP,
dTTP), které slouží jako stavební kameny pro nově syntetizovaný řetězec (viz obr.173).
Obr.173 Syntéza nového řetězce DNA
Po prvním cyklu PCR se počet řetězců DNA ve směsi zdvojnásobí. V dalším cyklu slouží
jako templát pro polymerázu i nově vytvořené řetězce, takže se nasyntetizuje dvojnásobné
množství produktu. Při opakujících se cyklech tedy množství vytvořených řetězců přibývá
exponenciálně podle vzorce:
p = 2n
kde p je počet kopií daného úseku DNA a n je počet cyklů.
V prvním cyklu, kdy jako templát slouží původní dlouhá molekula DNA, vzniknou řetězce,
které z jedné strany přesahují úsek vymezený oběma primery (tzv. primární produkt). Pokud v
dalších cyklech jako templát slouží takto vytvořený primární produkt, vytvoří se podle něj
úsek DNA o délce přesně ohraničené polohou obou použitých primerů (od jednoho primeru
bude syntéza začínat a v místě druhého skončí, neboť v tomto místě končí primární produkt).
Právě těchto specifických produktů o přesně vymezené délce bude v průběhu PCR přibývat
exponenciálně, zatímco delších (primárních produktů) jen lineárně.
Obr.174 Schéma PCR
213
16.3.1.1. Alelicky specifická PCR
Modifikace PCR užívaná k přímé detekci bodových mutací či malých delecí. PCR směs
obsahuje alelicky specifické oligonukleotidy jako primery. V tomto schématu jsou používány
tři primery (na rozdíl od běžné PCR se dvěma primery). Jeden z nich představuje stabilní
hranici cílového amplifikovaného fragmentu DNA a druhé dva představují alternativní verze
druhého konce (mutovanou/nemutovanou). Mutace, kterou takto detekujeme, tedy tvoří
hranici amplifikovaného fragmentu a je kryta primerem. Využití alelicky specifické PCR bylo
poprvé popsáno v roce 1991 na detekci subtypů HLA (genů pro hlavní histokompatibilní
komplex u člověka).
16.3.1.2. Nested PCR
Tato modifikace PCR je využívaná v mnoha laboratořích k vědeckým i diagnostickým
účelům. Amplifikace zde probíhá dvoufázově. V první fázi se pomocí jedné dvojice primerů
namnoží delší sekvence nukleové kyseliny. Produkt první PCR reakce je potom použit
v druhé amplifikační reakci, kde se za pomoci jiné dvojice primerů namnoží kratší vnitřní
sekvence tohoto produktu. Výhodou je hlavně vysoká specificita daná dvěma dvojicemi
primerů. Aby se zabránilo riziku kontaminace při otevírání zkumavek při přenosu vzorků
mezi první a druhou PCR reakcí, byla pro rutinně diagnostický provoz vyvinuta tzv. Singletube
nested PCR. Při ní je dvojice primerů pro druhou PCR přítomna již v první reakci, ale je
oddělena pomocí silné vrstvy minerálního oleje. Po skončení první amplifikace se obsah
zkumavky promísí a zcentrifuguje a nechá se proběhnout druhá reakce.
Obr.175 Schématické znázornění Nested PCR
16.3.1.3. Kvantitativní PCR v reálném čase (Real-time PCR)
Real-time PCR slouží ke kvantifikaci amplifikovaného produktu. Jde o obdobu klasické
PCR s tím rozdílem, že probíhá na speciálním přístroji, který umožňuje kontinuálně
monitorovat přírůstky DNA během každého cyklu. Základní podmínkou této reakce je
přítomnost fluorescenčního substrátu, který se váže na syntetizovanou DNA. Úroveň
detekované fluorescence pak odráží množství nasyntetizované nukleové kyseliny. Reakce
probíhá na speciálních termocyklerech s optikou umožňující excitaci substrátů a následnou
detekci fluorescence v každé jamce. Standardně se používá 96ti jamkový formát, k dispozici
jsou však i 384 jamkové cyklery.
214
Obr.176 Schéma Real-Time PCR
Na obr.176 je schematicky znázorněna jedna z možností vizualizace RT-PCR. Specifické
sondy mají ve své struktuře sekvenci, kterou hybridizují k DNA (v oblasti mezi primery) a
pracují na principu FRET (fluorescence resonance energy transfer) mezi fluorescenčním
barvivem (fluorofor R) a zhášečem (quencher Q). Nárůst fluorescenční aktivity je způsoben
zvětšením vzdálenosti mezi molekulou R a Q po rozštípnutí navázané sondy polymerázou.
16.3.1.4. Reverzně transkripční PCR (RT-PCR)
Tato metoda je vhodná pro průkaz RNA (např. virové nebo mRNA vzniklé při transkripci
z DNA). Princip spočívá v tom, že před vlastní amplifikací musí být izolovaná RNA
překopírována pomocí enzymu reverzní transkriptázy do cDNA. Reverzní transkriptázy
izolované z virů jsou však termolabilní a nesnášejí teplotu nad 42°C. Proto se začalo využívat
reverzně transkripční aktivity, kterou má v přítomnosti Mg2+
iontů DNA polymeráza
z bakterie Thermus thermophilus. Ta je schopna pracovat i při teplotě 72°C. PCR reakce pak
probíhá běžným způsobem. RT-PCR se využívá při hledání nových genů, vyhledávání mutací
nebo ke zjišťování síly exprese jednotlivých genů.
16.3.2. LCR (Ligase Chain Reaction, ligázová řetězová reakce)
Technika ligázové řetězové reakce byla poprvé popsána v roce 1989 a princip vychází,
stejně jako u PCR, z replikace DNA in vivo. Na rozdíl od PCR však napodobuje tvorbu
opožďujícího se řetězce (tzv. Okazakiho fragmentů).
LCR používá specifické oligonukleotidové komplementární sondy, vždy ve dvojici pro
každý řetězec DNA. Vlastní reakce probíhá ve čtyřech fázích:
1. tepelná denaturace DNA
2. hybridizační annealing specifických sond, mezi nimiž zůstane krátký volný úsek
3. syntéza řetězce od 3´konce jedné k 5´konci druhé sondy DNA polymerázou I
4. spojení volných konců pomocí DNA lipázy.
215
16.4. Metody detekce mutací a polymorfizmů
16.4.1. RFLP + ELFO
16.4.1.1. Délkový polymorfizmus restrikčních fragmentů (RFLP)
Restrikční analýza DNA je metodou charakterizace nukleové kyseliny pomocí jejího štěpení
na menší fragmenty. Využívají se k tomu bakteriální endonukleázy (restriktázy) – enzymy,
které štěpí DNA v přesně definované sekvenci nukleotidů (většinou o velikosti 4-8 bp), např.
enzym s názvem EcoRI (produkt bakterie Escherichia coli) rozštěpí každou DNA sekvenci
„GAATTC“ mezi nukleotidy G a A. Pokud by byla v této sekvenci záměna třeba jen jediného
nukleotidu, enzym ji už nerozpozná.
Nyní je známo asi 1500 druhů bakteriálních endonukleáz, které si bakterie tvoří na ochranu
před infikujícími bakteriofágy (při napadení bakterie rozštěpí jejich DNA, jejich vlastní DNA
je chráněna metylací). Počet i délka fragmentů štěpených určitým enzymem je pro DNA
daného jedince specifická, proto můžeme na základě polymorfizmu délky restrikčních
fragmentů provádět odlišení DNA různých individuí. Kromě RFLP se pro DNA diagnostiku a
studium příbuzenských vztahů (například při průkazu otcovství) hojně využívá polymorfizmu
repetitivních úseků DNA - VNTR (variabilní počet tandemových opakování).
RFLP metodou se dají vyhledávat či detekovat mutace v konkrétní sekvenci určitého
enzymu. Pro rutinní diagnostiku mutací se však příliš nehodí a využívá se převážně ve
výzkumu.
Obr.177 Štěpení DNA enzymem EcoRI
16.4.1.2. Elektroforéza fragmentů DNA (ELFO)
Nepostradatelným nástrojem pro rozdělování makromolekul s různou velikostí a nábojem je
gelová elektroforéza. Nukleové kyseliny mají téměř konstantní negativní náboj na jednotku
hmotnosti, takže se dělí na gelech prakticky výhradně na základě své velikosti (nejkratší
doputují nejdál). V elektrickém poli se díky zápornému náboji tedy pohybují od katody
směrem k anodě. Elektroforetická analýza velikosti fragmentů DNA je nedílnou součástí řady
molekulárně biologických metod (RFLP, SSCP, Southern blot atd.).
Horizontální elektroforéza se provádí v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu, který
působí jako molekulární síto zpomalující průchod velkých molekul více než malých. Gel je
ponořen do pufru (TE, TBE, TAE). Nanášení vzorku probíhá za použití vkládacích pufrů roztoků
o vysoké hustotě, které umožňují vkládání vzorků DNA do jednotlivých jamek.
Manipulaci se vzorky pak umožňuje barvivo, např. bromfenolová modř, které má podobnou
pohyblivost v gelu jako DNA. Vizualizace fragmentů DNA na gelu se děje přes UV
216
transluminátor pomocí ethidium bromidu, který je však pro svou potenciální kancerogenitu
stále častěji nahrazován jinými barvivy (např. SYBRGreen, GelGreen atd.).
Obr.178 Elektroforéza DNA fragmentů
Na obr.178 je schematicky znázorněná elektroforetická vana pro agarózovou elektroforézu.
Obecně jde o nádobu s vyvýšeným středem pro uložení gelu a dvěma komorami pro
elektroforetický pufr po stranách. Gel je pod hladinou pufru. V nejvzdálenějším místě každé
komory je vždy podélně uložená elektroda v podobě tenkého platinového drátku. Ten je
propojen s vnějšími konektory, kterými se elektrody připojí ke zdroji napětí.
16.4.2. Analýza DNA pomocí Southernova blottingu
V roce 1975 publikoval Edwin M. Southern nový pracovní postup, který umožňuje zjistit
umístění genů a jiných sekvencí v restrikčních fragmentech DNA separovaných gelovou
elektroforézou na nitrocelulózové nebo nylonové membráně. Tato technika nazvána podle
autora "Southern blot" (později byly navrženy i analogické postupy pro přenos RNA, resp.
proteinů a byly vtipně pojmenovány jako "Northern blot", resp. "Western blot").
Jde o jednoduchý postup používající kapilárního vzlínání tzv. přenosového pufru.
Membrána je přiložena na horní plochu gelu, dolní plocha gelu je prostřednictvím houby nebo
jiného savého materiálu spojena se zásobníkem přenosového pufru. Horní plocha membrány
je poté pokryta větším množstvím savého materiálu (např. buničité vaty). Pro lepší kontakt
všech vrstev je soustava přiměřeně zatížena závažím. Přenosový pufr vzlíná kapilární silou
nahoru přes houbu, gel a membránu do buničité vaty. Přitom vymývá z gelu molekuly DNA a
přenáší je na membránu. Ta je pro molekuly DNA nepropustná, takže zůstávají na spodní
ploše membrány v přesně stejných polohách, v jakých se nacházely v gelu po roztřídění
gelovou elektroforézou. Přenosový pufr obvykle obsahuje chemikálie, které narušují stabilitu
vodíkových můstků v molekule DNA, takže dochází k její denaturaci. DNA je proto během
přenosu denaturována (je jednovláknová) a připravená k hybridizaci se sondou.
217
Obr.179 Přenos podle Southerna (Southern blot)
16.4.3. SSCP (single strand conformation polymorphism, polymorfizmus konformace
jednořetězcové DNA)
SSCP je rutinní metodou pro vyhledávání mutací. Je jednoduchou, velice senzitivní a
efektivní technikou k detekci mutací typu záměny jedné baze.
Podstatou metody je elektroforéza jednovláknové DNA na polyakrylamidovém gelu při
nízké teplotě. Konformace jednovláknového fragmentu DNA je dána intramolekulárními
interakcemi uvnitř DNA sekvence. Je závislá na teplotě a iontové síle. Již tak malý rozdíl jako
je záměna jedné baze způsobí změnu konformace a rozdílnou pohyblivost při elektroforéze.
Rychlost, jakou DNA putuje během elektroforézy, tedy závisí na její přesné konformaci.
Tato vysoce citlivá technika zachycuje 100% mutací v DNA fragmentech menších než 200
bazí a 80% mutací v DNA fragmentech menších než 400 bazí. Optimální velikost PCR
produktu pro detekci mutací je 150 bazí.
16.4.4. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)
Technika MLPA je relativně nová metoda molekulární cytogenetiky, poprvé publikovaná
v roce 2002, která je vhodná pro vyhledávání chromozomálních aberací. Principem je
hybridizace, tj. navázání oligonukleotidových sond na cílovou sekvenci DNA na základě
jejich komplementarity. Každá sonda se skládá ze dvou oligonukleotidů. Po hybridizaci na
cílové místo jsou oligonukleotidy spojeny ligací. Pouze spojené sondy jsou po denaturaci
amplifikovány pomocí klasické PCR reakce za použití jednotného páru primerů. Namnožené
sondy jsou rozděleny kapilární elektroforézou na základě jejich různé délky. Nakonec jsou
analyzovány pomocí speciálního počítačového programu.
Metoda MLPA dokáže detekovat pouze početní změny struktury DNA, jako jsou delece či
duplikace, neodhalí však balancované přestavby jako jsou translokace či inverze. K výhodám
patří jednoduchost, rychlost a nenáročnost na množství DNA, k nevýhodám patří vysoká
citlivost na kontaminaci. V praxi se používá např. v DNA diagnostice muskulární dystrofie.