(III.) Sedimentace červených krvinek (IV.) Stanovení osmotické rezistence červených krvinek Fyziologie I - cvičení Fyziologický ústav LF MU, 2015 © Michal Hendrych, Tibor Stračina Sedimentace erytrocytů • fyzikální proces usazování erytrocytů (krevních elementů) v neproudící nesrážlivé krvi • vyšetřuje se sedimentační rychlost • nespecifická laboratorní metoda - říkající nám pouze “něco se děje” • měříme rychlost poklesu ery ve sloupci nesrážlivé krve (v kapiláře) • Sedimentační rychlost je nepřímo úměrná suspenzní stabilitě krve Suspenzní stabilita krve. Helmholtzova elektrická dvojvrstva • na vnějším povrchu membrány ery se nachází záporný náboj, nesený zejména zbytky sialových kyselin membránových proteinů • v těsném okolí membrány se elektrostatickými silami udržují kladně nabité ionty (především Na+) – tvoří 1. vrstvu iontů • ke kladně nabité vrstvě jsou přitahovány záporně nabité ionty, které tvoří převážnou část 2. iontové vrstvy • ery se díky svému „elektrickému obalu“ vzájemně odpuzují, což zabezpečuje, že neproudící nesrážlivá krev po jistou dobu setrvává jako suspenze krevních elementů v plazmě (suspenzní stabilita) ERY + - + + + + ++ + + + + + + + - - - - - - - - + + + + + - - - -- - - - - - - - - - - - - + Mechanismus sedimentace erytrocytů • gravitace – pod vlivem této síly se erytrocyty v neproudící nesrážlivé krvi postupně usazují (sedimentují) • při narušení Helmholtzovy elektrické dvojvrstvy dochází ke skládání ery do válečků – penízkovatění (tvorba rouleaux, agregátů) – které mají velký objem, ovšem relativně malý povrch, a proto klesají rychleji • narušení elektrické dvojvrstvy tak způsobí zvýšení sedimentační rychlosti Faktory ovlivňující rychlost sedimentace • Velikost ery: větší ery rychleji sedimentují • Počet ery: čím více ery, tím pomaleji sedimentují • Plazmatické bílkoviny • Albumin – má záporný náboj, udržuje suspenzní stabilitu • t.j. hypoalbuminémie = zvýšená sedimentační rychlost • Imunoglobuliny, fibrinogen – kladný i záporný náboj, narušují suspenzní stabilitu krve • t.j. při zvýšené plazmatické koncentraci Ig (např. při zánětu) stoupá rychlost sedimentace ery Metody měření sedimentační rychlosti • dle Fahraeus-Westergrena (FW, přímá metoda): • kapilára postavená kolmo • odečítá se po 1 hodině • dle Wintroba (šikmá sedimentace): • kapilára sešikmená pod úhlem 450 • odečítá se po 15 minutách Nesrážlivá krev • Krev, ve které zabráníme koagulačnímu systému v jeho funkci • Možnosti • Vyvázáním Ca2+ iontů esenciálních pro koagulaci (chelatační antikoagulancia) • Citrát sodný • EDTA - kyselina ethylendiamintetraoctová • Oxalát sodný • Stimulací antikoagulačního systému • Aktivace antitrombinu III - heparin a jeho nízkomolekulární deriváty Fyziologické hodnoty sedimentační rychlosti • Muži: 2-8 mm/h • Ženy: 7-12 mm/h • Novorozenci: 2 mm/h • Kojenci: 4-8 mm/h • Mezipohlavní rozdíly jsou způsobené různým počtem ery a odlišnostmi v koncentraci plazmatických proteinů Změněné hodnoty FW • Zvýšené FW: • Těhotenství, menstruace • Makrocytémie • Infekce • Nádory • Záněty • Nekrózy tkání (infarkt, trauma) • Relativní/ absolutní ztráty albuminu (nefrotický syndrom) • Snížené FW: • Nepravidelný tvar ery – sférocytóza • Polycytemia vera • Leukocytóza • Dysproteinémie – hypofibrinogenémie, hypogamaglobulinémie • Dehydratace Difuze • Samovolný proces proudění částic po koncentračním gradientu Filtrace • Fyzikální separace rozpouštědla od „rozpuštěných“ částic přes membránu poháněná tlakovým gradientem Osmóza • proudění rozpouštědla přes semipermeabilní membránu po osmotickém gradientu • Osmotický tlak – tlak potřebný k zastavení osmózy • Osmolarita – udává koncentraci osmoticky aktivních částic na 1l roztoku • Osmolalita – udává koncentraci osmoticky aktivních částic na 1 kg rozpouštědla • Osmolalita plazmy (orientačně) = 2*[Na+] + [glc] + [urea] = 275-295 mmol/kgH2O Tonicita • Udává osmolalitu roztoku ve vztahu k buňce • Hypotonické prostředí • Isotonické prostředí • 0,9% roztok NaCl = fyziologický roztok • Hypertonické prostředí Hemolýza • zánik červené krvinky porušením její membrány • vede k vylití obsahu cytoplasmy erytrocytů • mechanismy: • Fyzikální • Osmotická • Chemická • Imunologická • Toxická Osmotická rezistence • testování rezistence ery vůči hypotonickému prostředí • specifická metoda užívající se v diferenciální diagnostice hemolytických anémii • Minimální osmotická rezistence – udává koncentraci hypotonického roztoku NaCl, při které dochází k hemolýze prvních ery – nad sedimentem pozorujeme růžové zakalení, zanikají nejméně odolné ery • 0,4-0,44% • Maximální osmotická rezistence - udává koncentraci hypotonického roztoku NaCl, při které ještě nedochází k úplné hemolýze ery – poslední zkumavka obsahující sedimentované ery, ty nejvíce odolné • 0,3-0,33% • Osmotická rezistenční šíře – rozdíl min. a max. osmotické rezistence • 10-14% Patologické hodnoty osmotické rezistence • Vyšší hodnoty minimální osmotické rezistence • Vrozené hemolytické anémie • Nižší hodnoty maximální osmotické rezistence • Polycytemia vera • Thalasemia • Srpková anemie • Nedostatek Fe2+ • Stav po splenektomii Izotonická hemolýza • v in vitro podmínkách • izotonický roztok glukózy: ery přijímají a metabolizují glc, roztok se stává hypotonický, dochází k osmotické hemolýze • izotonický roztok močoviny: močovina volně prostupuje přes membránu do ery (difuzí po svém koncentračním gradientu) a okolní roztok se stává hypotonický Zdroje obrázků • Slide 6 - http://www.medipos.cz/odberove-nadoby-pomucky/pipeta-zkumcitrat-jednorazphdispette.html [cited 30.8.2015] • Slide 7 - http://www.chemicalland21.com/lifescience/foco/CALCIUM%20CITRATE.htm + https://cs.wikipedia.org/wiki/%C5%A0%C5%A5avelan_v%C3%A1penat%C3%BD#/media/File:Cal cium_oxalate.png + https://cs.wikipedia.org/wiki/Heparin#/media/File:Heparin-2D-skeletal.png [cited 30.8.2015] • Slide 10 - https://en.wikipedia.org/wiki/Passive_transport#/media/File:Scheme_simple_diffusion_in_cell_ membrane-en.svg [cited 30.8.2015] • Slide 11 - https://en.wikipedia.org/wiki/Passive_transport#/media/File:Filtration_diagram.svg [cited 30.8.2015] • Slide 12 - https://en.wikipedia.org/wiki/Osmosis#/media/File:0307_Osmosis.jpg [cited 30.8.2015] • Slide 13 - https://en.wikipedia.org/wiki/Passive_transport#/media/File:Osmotic_pressure_on_blood_cells _diagram.svg [cited 30.8.2015] • Slide 14 - http://labmed.ascpjournals.org/content/41/4/209/F2.expansion.html [cited 30.8.2015]