(minimum přístrojové techniky a souvisejících analytických metod v krevním srážení) PRINCIPY VYŠETŘENÍ HEMOSTÁZY Andrea Štěpařová OKH FN Brno 10. 10. 2019 Hemostáza • proces, při kterém dochází k zástavě krvácení v místě poranění a při neporušeném cévním řečišti naopak udržuje tekutost krve • složky hemostázy:  Cévy  Krevní destičky  Plazmatické faktory • Faktory koagulační • Přirozené inhibitory • Faktory fibrinolýzy • zástava krvácení představuje skupinu dějů, které vedou ke vzniku nerozpustného fibrinu Koagulační kaskáda Vyšetřovací techniky v hemostáze • Dle principu stanovení • 1. Koagulační • 2. Zákalové • 3. Spektrofotometrické • 4. Imunochemické • 5. Parakoagulační (Gelifikační) • 6. POCT (point-of-care) • 7. Průtoková cytometrie • 8. PCR 1. Koagulační • dělení podle automatizace • Manuální – „háčkování“ • Přístrojové • Poloautomaty • Automaty – koagulometry • dělení koagulometrů dle typu detekce • Elektromagnetická • kulička • kovový plátek • háček • Optická • optický paprsek Koagulometry - kuličkové • Princip: • kovová kulička se pohybuje v magnetickém poli • vlivem změny viskozity prostředí po spuštění koagulačního procesu dochází ke zpomalení pohybu kuličky a k jejímu vychýlení z dřívějšího směru • změna magnetického pole po vychýlení kuličky je převedena na elektrický impuls, který zastaví ukazatel času • př. přístrojů: STA R Evolution, STA R Max (STAGO) • př. testů: PT, APTT, Fbg, TT • princip kuličkového koagulometru Koagulometry - kuličkové • STA R Max (STAGO) • STA R Evolution (STAGO) Koagulometry - kuličkové • Výhody • kývavý pohyb kuličky – mění se rychlost • v úvratích má kulička nulovou rychlost • velice vysoká citlivost • měření fibrinogenu od 0,2 g/l • Nevýhody • velký objem reagencií pro fotometrické testy • z důvodu přítomnosti kuličky Koagulometry - optické • Princip: • monochromatické světelné záření prochází kyvetou vzorkem, která na fotočlánek propouští nebo odráží jen určité množství záření • optická hustota dopadajícího záření odráží vlastnosti média v aktuálním stavu koagulačního děje • měří se snížení optické hustoty po vytvoření fibrinového vlákna nebo koagula • měří vznik zákalu nikoli přímo koagula Koagulometry - optické • problém vyhodnocení naměřené reakční křivky • různí výrobci mají rozdílné řešení • určení rozdílu před a po koagulaci • derivace koagulační křivky • určení počáteční rychlosti • Koagulometr Sysmex CA 7000 Koagulometry - optické • Citlivé na rychlost tvorby koagula • nízký fibrinogen – nepřesné výsledky • přítomnost inhibitorů (heparin) • Citlivé na zabarvení plasmy • ikterická plasma • chylózní plasma • hemolytická plasma 2. Zákalové (fotooptické) • Princip: • vyšetření zakalení testovacího systému z důvodu tvorby koagula, agregátů krevních destiček, reakce antigenu s protilátkou • zjišťuje se optická hustota rozptýleného světla procházejícího měřící kyvetou a dopadajícího na detektor • Turbidimetrie • změna průchodnosti světla kyvetou • př. Agregace PLT – agregometr APACT 4004 • Nefelometrie • rozptyl světla ve směru kolmém na dopadající paprsek (detektor je umístěn v úhlu 90 stupňů) 2. Zákalové (fotooptické) 3. Spektrofotometrické • Princip: • stanovení intenzity zbarvení (absorbance), ke kterému dochází v důsledku štěpení specifického chromogenního substrátu • detekce absorbance při vhodné vlnové délce o „end point“ (A) – měří se absorbance na konci reakce o kinetické (∆A/min) - měří se změna absorbance za časovou jednotku • Limitace: hemolytické a ikterické vzorky • př. AT • Chromogenní substrát • uměle připravený NO3NHArg bezbarvý paranitroanilid velkoobjemová koncovka aminokyselinové raménko zakončené Argininem • Princip • enzymy štěpí substrát – vzniká žluté zbarvení • měříme při 405 nm NO3NH2 Arg NO3NH paranitroanilin 4. Imunochemické (imunologické) • Sledování reakce antigenu s protilátkou • 4.1 Aglutinace • 4.2 LIA (Liquid Immuno Assay) • 4.3 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) • 4.4 EID (Elektroimunodifúze) • 4.5 RIA (Radioimunoanaláza) – detekce - gamačítač 4.1 Aglutinační metody • Princip: • sledování aglutinace (shlukování) viditelných částic (latex, červená krvinka) s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigenu • odečítání makroskopicky • pozitivní( +, ++, +++)/negativní • semikvantitativní metody (udaná mez detekce) • př. metod • latexaglutinační (např. FDP, D-Di) • hemaglutinační (např. SFM) Latexaglutinace Příklad vyšetření D-Dimerů Mez detekce = 0,5 mg/l neředěný vzorek vzorek ředěný 1:6 výsledek aglutinace - X << 0,5 mg/l aglutinace + - >> 0,5 mg/l a << 3,0 mg/l aglutinace + + >> 3,0 mg/l 4.2 LIA (liquid immuno assay) • Princip: • sledování aglutinace mikrolatexových částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigenu • odečítání optickým systémem • zeslabení světelného/laserového paprsku po průchodu měřící kyvetou (A/min) • kvantitativní metody (odečet z kalibrační křivky) • př. D-Di, vWF:Ag • Limitace: o Chylozita vzorku o Hookův jev (vysycení protilátky antigenem) LIA (liquid immuno assay)  Provedení (STA© Liatest© D-Dimer) 100 ml pufru 50 ml vzorku inkubace 240 s 150 ml latexového činidla měříme změnu absorbance mezi 12 s – 140 s 4.3 ELISA (enzym linked imunosorbent assay) (EIA (Enzym imunoassay)) • Princip: • kvantitativní stanovení antigenu (Ag) pomocí protilátky(Ab) značené enzymem (AbE = konjugát) • př. vWF:CBA, vWF:FVIIIB, MPK, PAI, ADAMTS-13 Aktivita, ADAMTS-13 Inhibitor, HIT • dle automatiazce: • Manuálně – manuální provedení + detekce pomocí spektrofotometrického systému na čtení mikrotitračních destiček • př. KIM (Microplate reader system) • Automaty – provádějící všechny kroky analýzy - dávkování vzorků, přidávání reagencií, inkubaci, promývání a detekci mikrotitračních destiček • př. DS2 DYNEX ELISA – přístrojová technika • KIM (Microplate reader systém) • DS2 DYNEX 4.3 ELISA - postup • inkubace vzorku (+ kalibrátory a kontroly) v mikrotitračních jamkách s navázanou Ab proti vyšetřovanému Ag – vazba Ag-Ab • odsátí vzorku + promytí jamek • inkubace konjugátu (AbE) v jamkách – vazba na Ag • odsátí AbE + promytí jamek • detekce enzymatické aktivity komplexu Ab-Ag -AbE po přídavku chromogenního substrátu (A) • odečítání výsledku: intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci Ag 4.3 ELISA - princip 5. Gelifikační (parakoagulační) • využívají schopnosti některých látek (etanol, protaminsulfát) parakoagulovat (gelifikovat) v plazmě přítomné monomery fibrinu • kvalitativní testy, hrubě orientační • hodnocení v plasmě – vločky, vlákna fibrinu nebo viditelný gel • př. ethanolgelifikační test protaminsulfátový test 6. POCT = point-of-care • přenosné přístroje • testování v místě péče o pacienta – přímo u lůžka (bed-side test), na ambulanci apod. • speciálně upravené testovací soupravy, jednorázové pomůcky • používají se k rychlé orientaci o parametrech koagulace • Př. CoaguCheck® XS HEMOCHRON Jr., Signature Elite 6. POCT pro stanovení protrombinového času (PT) • přístroje určené k monitorování léčby kumariny • praktičtí lékaři, kardiologové, angiologové • kapilární nebo venózní krev • př. CoaguCheck® XS (Roche) 6. POCT pro stanovení PT - princip • do přístroje se vkládá testovací proužek obsahující lyofilizovanou reagencii (tromboplastin a peptidový substrát) • tromboplastin po přídavku krve aktivuje koagulaci za vzniku trombinu • trombin štěpí substrát a přitom generuje elektrochemický signál, který je přístrojem převeden na obvyklé jednotky koagulace • vyhodnocený výsledek: PT – INR, %Quick, sekundy 6. POCT (Act+) • př. Hemochron® Jr., Hemochron Signature Elite ® • pro stanovení aktivovaného koagulačního času (ACT+) • k monitorování léčby heparinem ze vzorku plné krve • gynekologie, kardiochirurgie, koronární jednotky, hemodialýza • různé typy jednorázových kyvet: PT, APTT, Citrate PT(APTT) 6. POCT – ACT+ (HEMOCHRON) • odkápnutí krve do testovací jamky jednorázové kyvety s reagencií (aktivátor) a vložení do pokusné komory • pohyb vzorku po smíchání vzorku s reagencií v pokusném kanálku předurčenou rychlostí • začátek tvorby koagula je detegován na základě zpomalení toku vzorku v pokusném kanálku mezi optickými detektory LED Dělení koagulačních testů • A/ Globální • popisují celý systém srážecího procesu • doba krvácení, retrakce, TEG, aj. • B/ Skupinové (screening) • popisují určitou část koagulačního systému • umožňují odlišení poruch vnitřní a vnější cesty a přeměny fibrinogenu • aPTT, TT, PT, ProCGlobal, aj. • C/ Specifické • stanovuje se jeden z koagulačních činitelů (jednotlivé složky) • FII, FV, FVII, FVIII, FX, FIX, FXI, FXII, PC, PS, vWF:Ac, vWF:Ag, aj. C/ Specifické koagulační testy • Funkční aktivita • koagulační • jednofázové (jednostupňové) koagulační metody na principu PT nebo APTT • metody využívající chromogenních substrátů • dvoustupňové chromogenní metody • Množství látky • vyšetření antigenu • imunochemické metody • umožňují odlišení defektů • kvalitativních • kvantitativních PT - PROTROMBINOVÝ ČAS = tromboplastinový čas dle Quicka • monitoruje zevní koagulační systém – FF II, V, VII, X a fibrinogen • sledování času tvorby fibrinu po přídavku Ca2+ tromboplastinu (PL, Ca2+, TF) k vyšetřované plazmě PT - PROTROMBINOVÝ ČAS • Vyjádření výsledků: • koagulační čas v sekundách • poměr R = čas vyšetřované plazmy pacienta / čas normálu • INR – mezinárodní normalizovaný poměr • % koagulační aktivity odečtením z kalibrační křivky • INR = RISI – pouze při léčbě kumariny (warfarin) • ISI – mezinárodní index citlivosti • citlivost daného tromboplastinu stanovena vůči mezinárodnímu standardnímu tromboplastinu • hodnota ISI stanovena pro každou šarži reagencie, výrobcem reagencie • hodnota ISI by měla být < 1,5 • INR zajišťuje standardizaci a umožňuje porovnání výsledků PT z jednotlivých laboratoří PT - PROTROMBINOVÝ ČAS • Indikace PT • základní koagulační test • předoperační vyšetření • krvácivý stav • léčba kumariny – monitoring léčby • podezření na patologický inhibitor • Referenční rozmezí: • liší se dle typu reagencie • koagulační čas: 11 – 17 s • R = 0,8 – 1,2 • terapeutický rozsah INR = 2,0 – 4,0  Klinický význam: má prodloužení času • defekt faktorů vnějšího systému FVII, FX, FII, ale i FV a fibrinogenu • vrozený • získaný – snížená syntéza, zvýšená spotřeba, zvýšené ztráty • nedostatek vitaminu K • léčba kumariny (warfarin) • jaterní onemocnění • DIC • vyšší dávky heparinu (dle typu a dávky, dle citlivosti reagencie) • přítomnost inhibitoru (specifický, nespecifický – LA) • fyziologicky u novorozence APTT – aktivovaný parciální tromboplatinový test • monitoruje vnitřní koagulační systém – PK (prekalikrein), HMWK (vysokomolekulární kininogen), FF XII, XI, IX, VIII ale i II, V, X a fibrinogen • sledování času tvorby fibrinu po přídavku aktivátoru (př. kaolin), parciálního tromboplastinu (kefalin = fosfolipidy) a Ca2+ (CaCl2) k vyšetřované plazmě APTT – aktivovaný parciální tromboplatinový test • Vyjádření výsledků:  koagulační čas v sekundách  poměr R (čas vyšetřované P/čas normální P) • Referenční rozmezí:  koagulační čas - výrazně se liší dle typu reagencie (26 – 40 s)  poměr R = 0,8 – 1,2 • Indikace vyšetření APTT:  základní koagulační test  předoperační vyšetření  krvácivý stav  léčba heparinem – terapeutické rozmezí je závislé na typu reagencie  podezření na patologický inhibitor APTT – aktivovaný parciální tromboplatinový test • Klinický význam: má prodloužení koagulačního času  defekt faktorů vnitřního systému FXII, XI, IX, FVIII, PK, HMWK (při současném prodloužení PT i nedostatek FX, ale i FV, FII a fibrinogenu pod 0,6 g/l  vrozený – hemofilie A, B  získaný - snížená syntéza, zvýšená spotřeba, zvýšené ztráty  defekt vWF  přítomnost inhibitorů (specifický, nespecifický)  fyziologicky u novorozence  heparin  arteficiálně (odběr, zpracování)  má zkrácení koagulačního času  trombotické stavy  APTT je nejčastěji používaný test k monitorování léčby nefrakciovaným heparinem! Trombinový čas  monitoruje třetí fázi koagulace, tj. štěpení fibrinogenu trombinem  sledování času tvorby fibrinu po přídavku trombinu (nízká koncentrace) k neředěné vyšetřované plazmě Trombinový čas  Vyjádření výsledků: • koagulační čas v sekundách • poměr R (čas vyšetřované P/čas normální P)  Referenční rozmezí: • dle typu reagencie (< 24s)  Klinický význam: má prodloužení koagulačního času • hypo/afibrinogenémie • dysfibrinogenémie • heparin • přítomnost inhibitoru (myelom, revmatoidní artritida) • fyziologicky u novorozence Reptilázový čas  reptiláza je hadí jed vykazující aktivitu podobnou trombinu  na rozdíl od trombinu není však jeho působení ovlivněno přítomností heparinu  sledování koagulačního času po přídavku reptilázy k neředěné vyšetřované P  Referenční rozmezí: • dle typu reagencie (< 21s)  Klinický význam: • podobný jako u TT s výjimkou vlivu heparinu Fbg - Fibrinogen  funkční vyšetření – vyšetření schopnosti přeměny na fibrin = dle Clause  vyšetření množství – imunologické metody – LIA, ELISA  metoda dle Clause – sledování času tvorby fibrinu po přídavku nadbytku trombinu (vysoká koncentrace) k ředěné vyšetřované plazmě  Vyjadřování výsledků: • v g/l • nutnost opakování vyšetření • u nízkých hladin Fbg – opakovat v menším ředění a přepočet • u vysokých hladin Fbg – opakovat ve vyšším ředění a přepočet Fbg - Fibrinogen  Referenční rozmezí: • 1,8 – 4,2 g/l  Klinický význam: • snížení – vrozené hypo, afibrinogenémie, těžké poruchy jater (syntéza), zvýšená spotřeba, zvýšené ztráty, trombolytická léčba, dysfirbinogenémie • zvýšení – těhotenství, zánět, nádorová onemocnění, stavy po operaci AT - Antitrombin  stanovení funkční aktivity AT se provádí fotometrickou metodou  využívá se schopnosti AT vytvářet v přítomnosti heparinu ireversibilní komplexy  vyšetřovaná plazma je inkubovaná s nadbytkem trombinu v přítomnosti heparinu  následně se stanovuje množství zbytkového trombinu přidáním specifického chromogenního substrátu, který je trombinem štěpen za vzniku zbarvení, jehož intenzita je přímo úměrná množství zbytkového trombinu a nepřímo úměrná množství AT ve vzorku AT - Antitrombin AT - Antitrombin  Vyjadřování výsledků:  výsledky funkční aktivity AT se uvádějí v % a získávají se odečtením z kalibrační křivky  Referenční rozmezí:  80 – 120%  Klinický význam: má snížení inhibiční aktivity - představuje zvýšené trombofilní riziko  defekty AT  vrozené  získané – snížená syntéza (jaterní onemocnění, fyziologicky novorozenec), zvýšené ztráty (nefrotický syndrom), zvýšená spotřeba (DIC, TEN, rozsáhlé operace), jiné příčiny (těhotenství, kontraceptiva)  zvýšení inhibiční aktivity nemá klinický význam Testy primární hemostázy • Počet a morfologie PLT • Globální testy • Doba krvácení • Vyšetření retrakce plazmatického koagula • Funkční testy • Adheze • Agregace PFA  Materiál • plná krev  Princip • sledování tvorby destičkového trombu, který postupně vyplňuje otvor (štěrbinu) v membráně potažené buď kolagenem a epinefrinem nebo kolagenem a ADP • agregační a adhezivní funkce trombocytů  Reagencie • Jednorázové cartrdige: Col/Epi , Col/ADP • Trigger solution – startovací roztok • (nanášen na membránu v měřícím modulu) PFA  Vyhodnocení • výsledkem testu je čas potřebný k dosažení kompletního uzávěru otvoru membrány = CT (Closure time) • Col/Epi > 300s, Col/ADP > 300 s - VWD • Col/Epi > 300s , Col/ADP v normě – léčba ASA PFA Vyšetření agregace trombocytů • Turbidimetrická metoda  sledování změn průchodnosti světla (transmise - T), ke které dochází vlivem tvorby agregátů krevních destiček  Vyšetřovaný materiál: PRP (platelet-rich plasma)  př. APACT 4004 • Impedanční metoda  sledování změn vodivosti vyvolaných tvorbou agregátů krevních destiček  Vyšetřovaný materiál: plná krev  př. Multiplate® Vyšetření agregace trombocytů  agregace samovolná (sponatánní)  agregace indukovaná (stimulovaná)  Induktory: ADP, kolagen, adrenalin (epinefrin), ristocetin, kyselina arachidnová, trombin  primární agregace – vlivem vnějšího podnětu  sekundární agregace – vlastní příspěvek trombocytů Vyšetření agregace trombocytů (turbidimetrie)  Maximální amplituda A max (%)  Desagregace (%)  jen u ADP v případě reversibilní křivky  Doba latence (s)  časová prodleva před agregační odpovědí  jen u kolagenu  Strmost křivky Slope (%/min) Agregometr APACT 4004 Vyhodnocení agregace Vyšetření agregace trombocytů – impendance  vyšetření ve vzorku plné krve jednorázové testovací cartridge  široká paleta standardizovaných testů a reagencií (aktivátory: kys. arachidonová, kolagen, ADP, TRAP-6, ristocetin) Vyšetření agregace trombocytů (impendance) Vyšetření agregace trombocytů (impendance) - adheze a agregace trombocytů na povrchu drátů zvyšuje elektrický odpor mezi dráty (senzory) - plocha pod křivkou AUC (AU*min) - 2 senzory – 2 křivky Vyšetření retrakce plazmatického koagula  schopnost trombocytů retrahovat (smršťovat) plazmatické koagulum (metoda dle Bethause)  Materiál  PRP získaná sedimentací  Postup  ředění PRP + přídavek Ca2+ (Ca2+- tromboplastin)  vytvoření plazmatického koagula v graduované zkumavce a oddělení koagula od stěn zkumavky  odečtení délky koagula po 3 hod  odečtení % retrakce z tabulky Vyšetření retrakce plazmatického koagula  Klinický význam  snížení - upozorňuje na poruchu retrakční schopnosti trombocytů OKH FN Brno Děkuji za pozornost Andrea Štěpařová OKH FN BRNO Úsek koagulace Steparova.Andrea@fnbrno.cz