ÚVOD DO LÉKAŘSKÉ VIROLOGIE, VIROLOGICKÉ A SEROLOGICKÉ VYŠETŘOVACÍ METODY MUDr. Markéta Hanslianová Masarykova univerzita, Katedra laboratorních metod [USEMAP] Viry •Virologie= vědní obor zabývající se studiem virů •1676- Anton van Leeuwenhoek- první pozorování baktérií vlastnoručně vyrobeným mikroskopem •1879 – 1882: první pokusný přenos virového onemocnění- Adolf Mayer (mozaiková choroba tabáku) •1892: Dmitrij Ivanovskij, filtrace viru •1898: první pokusný přenos živočišného viru (virus slintavky a kulhavky) •1939: první elektronoptické snímky viru mozaikové choroby tabáku •40. léta 20. století: mohutný rozvoj virologie • [USEMAP] 1168f03 mosaic Virus_diagram Schéma viru mozaikové choroby tabáku Elektronoptický snímek viru mozaikové choroby tabáku Mozaiková choroba tabáku [USEMAP] Povaha virů •viry nejsou organizovány jako buňky, ale jako částice (podbuněčné organismy) •obsahují jediný typ nukleové kyseliny: buď RNA nebo DNA •nemnoží se dělením, ale syntézou svých složek •syntéza je závislá na ribosomech hostitelské buňky [USEMAP] Stavba virionu • virion = virová částice -vnitřní část – dřeň neboli nukleoid obsahuje nukleovou kyselinu -zevní část – kapsida obsahuje bílkovinu, je sestavena z bílkovinných podjednotek (protomer) uspořádaných symetricky •kapsida s kubickou (ikosaedrální) symetrií – tvar dvacetistěnu (např. herpesviry, adenoviry) •kapsida se spirální (helikální) symetrií – tvar válce (např. orthomyxoviry) •kapsida s komplexní symetrií – např. bičíkaté fágy, poxviry • [USEMAP] Stavba virionu •nukleoid + kapsida = nukleokapsida (neobalené viry, např. pikornaviry, adenoviry) • •nukleokapsida může být uložena ve virovém obalu (obalené viry, např. herpesviry) • • • [USEMAP] 380px-Virion Neobalené viry Obalené viry 1 – kapsida, 2 – nukleoid, 3 – protomera, 4 – nukleokapsida, 5 – nukleokapsida s obalem, 6 – lipoproteinový obal, 7 - glykoproteiny [USEMAP] Velikost virů: 20 nm (pikornaviry) – 300 nm (poxviry) [USEMAP] Třídění virů a)dle charakteru genomu: RNA viry, DNA viry b)dle přítomnosti obalu: neobalené viry, obalené viry c)dle symetrie kapsidy: viry s kubickou symetrií, spirální symetrií, komplexní symetrií d)dle povahy hostitele: viry bakterií (bakteriofágy), kvasinek, prvoků, rostlin, hmyzu, obratlovců e)Dle vyvolávaných syndromů (klinicko-epidemiologické rozdělení): respirační viry, neuroviry, exantematické viry… f) [USEMAP] Reprodukce virů 1.Adsorpce (přilnutí) na vnímavou buňku •Receptory na povrchu buněk, tkáňový tropismus 2.Penetrace (průnik) virionu do buňky 3.Rozbalení virionu- ztráta kapsidy a virového obalu-uvolnění nukleové kyseliny (svlékání viru) [USEMAP] Reprodukce virů 4.Replikace virového genomu- virus využije metabolismus hostitelské buňky k tvorbě virových bílkovin a NK (fáze eklipsy) 5.Maturace (dozrávání) virionů- organizace virových bílkovin kolem NK viru, tvorba kapsidy 6.Uvolnění nových virionů z buňky • [USEMAP] viralreplication adsorpce penetrace replikace transkripce translace maturace uvolnění [USEMAP] Buněčné změny při virové infekci •Cytocidní infekce- hostitelská buňka odumírá ke konci cyklu množení viru; enteroviry (cytopatický efekt viru) •Necytocidní infekce- virová NK se množí nezávisle, ale dostatečně pomalu a nenarušuje metabolismus hostitelské buňky; herpesviry [USEMAP] Průběh a formy virových nákaz •Vstupní brána infekce: respirační trakt, sliznice GIT, kůže a podkoží, sliznice urogenitálního traktu, spojivka •Šíření viru- z buňky do buňky, pasivní šíření krví, lymfou, mozkomíšním mokem, sekrety •Vylučování viru- viriony nebo infikované rozpadající se buňky [USEMAP] Průběh a formy virových nákaz •infekce inaparentní (bezpříznaková) •infekce manifestní: •forma klinická – všechny typické příznaky •forma abortivní – jen některé příznaky •forma subklinická – nespecifické příznaky • •infekce lokální, systémová, generalizovaná •infekce akutní, chronická: •infekce perzistentní - nejsou klinické příznaky, virus lze prokázat •infekce latentní - nejsou klinické příznaky, virus nelze prokázat [USEMAP] Diagnostika virových infekcí 1.Přímá- mikroskopie, tkáňové kultury, průkaz antigenu nebo nukleové kyseliny viru 2. 2.Nepřímá- průkaz protilátek [USEMAP] Přímý průkaz viru 1.Mikroskopický průkaz- elektronový mikroskop 2.Izolace viru na tkáňových kulturách- pěstování viru na kulturách buněk (opičí ledviny)- cytopatický efekt • Viry nelze pěstovat na běžných kultivačních • půdách! 3.Průkaz antigenu- imunofluorescence (respirační viry, herpetické viry), ELISA (HBsAg) 4.Průkaz nukleové kyseliny viru- PCR 5. [USEMAP] PCR (Polymerase Chain Reaction) •polymerázová řetězová reakce •přímý průkaz NK virů •různé modifikace •výhody: vysoká specificita, rychlost, ATB nejsou kontraindikací vyšetření •nevýhody: vysoká cena, přístrojové vybavení, riziko kontaminace [USEMAP] Princip PCR •opakované cykly tří jednoduchých reakcí: •denaturace dvojšroubovice hledané DNA na dvě izolovaná vlákna (94 °C) •annealing - připojení dvou krátkých syntetických nukleotidů (primery) na tato vlákna (54 – 65 °C) •prodlužování primerů v přítomnosti vhodných reakčních složek a enzymu Taq-polymerasy za vzniku dvou kopií hledané DNA (72 °C) [USEMAP] http://kolweb.lf2.cuni.cz//Projekty/prusa-dna/pic/scan/pc01.gif [USEMAP] Serologické reakce • • Nepřímý průkaz • üprůkaz protilátek [USEMAP] Přehled serologických metod 1.Precipitace 2.Aglutinace 3.Komplement fixační reakce (KFR) 4.Neutralizace 5.Reakce se značenými složkami: • - imunofluorescence • - enzymová imunoanalýza • - Western blot (imunoblot) • • • [USEMAP] Precipitace •antigen koloidní povahy •precipitační neboli vločkovací testy na lues • VDRL, RRR, RPR • • kardiolipin + protilátky v séru precipitace P5280008 vdrl2 [USEMAP] Aglutinace •antigen korpuskulární povahy •antigen + hledaná protilátka viditelný shluk (aglutinát) •průkaz protilátek u salmonelózy (Widalova reakce), yersiniózy, listeriózy, tularémie •přímá, nepřímá (na nosičích)- antigen je navázán na povrch vhodné částice (pasivní hemaglutinace- TPHA) • [USEMAP] Komplement fixační reakce • ükomplex antigen + hledaná protilátka ükomplement üindikátorový neboli hemolytický systém (beraní erytrocyty senzibilizované králičí protilátkou) ü ü • zábrana hemolýzy hemolýza • pozitivní reakce negativní reakce [USEMAP] Zábrana hemolýzy, ery beze změny cf_test2 Komplement fixační reakce pozitivní negativní [USEMAP] Neutralizační reakce •protilátka brání biologickým účinkům antigenu •ASLO – průkaz antistreptolyzinu O • • přítomnost ASLO ve vyšetřovaném séru • • zábrana hemolýzy • pozitivní reakce [USEMAP] P2090016 Neutralizační reakce - průkaz ASLO [USEMAP] Reakce se značenými složkami-Imunofluorescence •jedna složka značena fluorescenčním barvivem, průkaz pomocí fluorescenčního mikroskopu •přímá – průkaz antigenu: T.pallidum •nepřímá – průkaz protilátek: syfilis, anaplazmóza, HHV6 • trepon01 Nepřímá imunofluorescence - protilátky proti T.pallidum [USEMAP] Reakce se značenými složkami-enzymová imunoanalýza •jedna složka značena enzymem, který rozloží přidaný substrát za vzniku barevného produktu •Výsledek: barevná reakce •Hodnocení: měření absorbance •ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) •průkaz antigenu: HBsAg, respirační viry, chlamydie •průkaz protilátek: univerzální použití [USEMAP] Princip metody ELISA elisa3 [USEMAP] Obrázek2 P2080015 ELISA – průkaz HBsAg Souprava pro vyšetření metodou ELISA [USEMAP] Reakce se značenými složkami -Western blot • Antigen rozdělený na jednotlivé polypeptidy dle molekulové hmotnosti na nitrocelulózovém pásku 1.vazba hledaných protilátek ze séra na příslušné antigenní frakce 2.přidání protilátky značené enzymem 3.přidání substrátu 4.výsledná reakce – barevný proužek [USEMAP] P5280005 Western blot T.pallidum IgG [USEMAP] Interpretace serologických výsledků •průkaz protilátek svědčí pro setkání s antigenem (kdy ?), k diagnóze infekce většinou nestačí • •dynamika imunitní reakce: • • setkání s antigenem průkaz protilátek 10 dní [USEMAP] Serologický průkaz infekce •vyšetření dvou vzorků séra: akutní na začátku onemocnění, rekonvalescentní za 10 až 14 dní •průkazný nález: čtyřnásobný vzestup titru nebo serokonverze •vzorky nutno vyšetřit zaráz ! • • titr protilátek = nejvyšší ředění, v němž ještě došlo k prokazatelné serologické reakci [USEMAP] •IgM – první protilátky, přetrvávají týden až několik měsíců, svědčí pro čerstvou infekci •IgA – přetrvávají o něco déle, svědčí pro čerstvou nebo nedávnou infekci •IgG – nejvyšší hladina měsíc po začátku onemocnění, mohou přetrvávat roky abtime [USEMAP] Virologie- shrnutí •Virion •Stavba virionu •Reprodukce virů •Průběh a formy virových infekcí •Diagnostika virových onemocnění: • Přímá • Nepřímá • [USEMAP] Děkuji za pozornost