datum___________ jméno__________________ Téma praktika: Radioimunoanalýza (RIA) - stanovení androstendionu 1. Nastavení metody na gamaměřiči LB 2111 Nadefinování metody, typu kalibrace, zadání cílových hodnot kalibrátorů, nastavení kontrol. Seznámení s přístrojem - princip, validace přístroje. 2. Vlastní provedení stanovení androstendionu v pacientských vzorcích Okruhy k nastudování a dotazy: 1. Jaká značenka se v RIA používá nejčastěji? 2. Co je to ionizující záření? 3. Jaká jsou specifika pro g-záření (jakých je energií, jaké vlnové délky, propustnost)? 4. Co se děje při „fotoefektu“ a při „Comptonově rozptylu“? Přístroje a pomůcky: Gama (g-) měřič LB 2111 multidetektorový gama měřič (g-counter) pro radioimunoanalýzu Souprava na stanovení androstendionu (Immunotech) Vzorky sér Teorie, princip stanovení Stanovení aldosteronu v séru nebo plazmě (heparin, EDTA) soupravou RIA (dodává Immunotech). Principem stanovení je kompetitivní radioimunoanalýza. Standardy, kontrolní vzorky a vzorky plazmy/séra se inkubují ve zkumavkách potažených monoklonální protilátkou společně s radioindikátorem ^125 I, který je navázán na antigen - anti-androstendion. Po inkubaci se odsaje obsah zkumavek a změří se vázaná radioaktivita vyjádřená v jednotkám cpm. Naměřená radioaktivita je nepřímo úměrná koncentraci analytu. Princip scintilačního detektoru g-counter Berthold (LB 2111) slouží ke kvantitativnímu měření radioaktivity g-záření (vyjádřeno v jednotkách cpm). g-counter Berthold je vybaven scintilačním detektorem, který je založen na vzniku luminiscence při průchodu ionizujícího záření vhodnou látkou (scintilátorem). Pro detekci g-záření se jako scintilační jednotky používají krystaly NaI/Tl. Při průchodu záření gama scintilačním krystalem dochází k fotoefektu a ke Comptonově rozptylu. Elektrony uvolněné z atomových obalů excitují atomy krystalu, přitom vzniká viditelné luminiscenční záření zvané scintilace. Pro přeměnu scintilací na elektrické impulsy se používají fotonásobiče. Systém LB 2111 je vybaven 12 scintilačními jednotkami a fotonásobičem. ReagencieOSN-E 1. Zkumavky potažené protilátkou proti androstendionu: 2x 48 zkumavek. 2. Radioindikátor - značený ^125I: 1 lahvička (26 ml); připravená k použití. Lahvička obsahuje androstendion o celkové aktivitě 111 kBq (ke dni výroby) značeného ^125I roztoku s bovinnými proteiny, obsahuje azid sodný. 3. Standardy: 6 lahviček (lyofilizáty; à 0,5 ml deioniz. H[2]O): kalibrační rozmezí 0 - 11,00 mg/l. Koncentrace lyofilizovaného androstendionu v lidském séru s azidem sodným (< 0,1%) jsou uvedeny na lahvičkách. 4. Kontrolní vzorky: 2 lahvičky (lyofilizáty; à 0,5 ml deioniz. H[2]O): před použitím rozpustit v deionizované vodě, její objem je uveden na lahvičce. 5. Promývací roztok (Wash Solution =WS[konc.]): 10 ml (k naředění 70x); Tris-HCl Všechny reagencie soupravy uschovávejte v lednici při 2-8 °C. Aktuální koncentrace standardů a kontrolních materiálů jsou zaznamenány na lahvičkách. Pracovní promývací roztok se připravuje vždy čerstvý z koncentrovaného promývacího roztoku (WS[konc.]). Naředí se potřebné množství. Ředí se 70x deionizovanou vodou. Pracovní postup 1. Nechte všechny reagencie vytemperovat na laboratorní teplotu. 2. Očíslujte duplikátní sérii potažených zkumavek. Do každé zkumavky napipetujte 25 µl kalibrátoru, kontrolních vzorků a pacientských sér. Nachystejte si zkumavku pro celkovou aktivitu (Total; T). 3. Do každé zkumavky napipetujte 250 µl radioindikátoru ^125I. 4. Zkumavky promíchejte na vortexu, zakryjte parafilmem a nechte inkubovat 1 h při 18-25^0C za stálého třepání (≥ 280 kmitů/min). 5. Odsajte obsah všech zkumavek, s výjimkou zkumavky pro celkovou aktivitu (T) a 1x promyjte zkumavky 2 ml čerstvě naředěného promývacího roztoku, promývací roztok odsajte. 6. Zvolte vyhodnocovací program RIA Andro a změřte radioaktivitu zkumavek – na g-counteru nastaveném na ^125I po dobu 1 minuty. Tím získáte vázané cpm (B) a cpm pro celkovou aktivitu (T). Schéma pracovního postupu Krok 1 Dávkování Krok 2 Inkubace Krok 3 Měření Do potažených zkumavek dávkujte: · 25 μl vzorku séra/plazmy, standardu, kontrolního vzorku · 250 μl radioindikátoru ^125I · zakryjte parafilmem Inkubujte 1 h při 18-25°C za stálého třepání (≥ 280 kmitů/min). Pečlivě odsajte obsah zkumavek, s výjimkou zkumavky pro celkovou aktivitu, 1x promyjte 2 ml čerstvě naředěného promývacího roztoku, promývací roztok odsajte. Ponechte okapat na savý podklad a pečlivě otřete okraj zkumavek. Změřte vázané cpm (Bound; B) a celkové cpm pro celkovou aktivitu (Total; T) po dobu 1 min. Vyhodnocení Vyhodnocení se provádí pomocí kalibrační křivky, kdy na osu x se vynáší koncentrace v mg/l a na osu y poměr B/B[o]. Total B[o] Std1 Std2 Std3 Std4 Std5 Impulzy c (teoretické) c (naměřené) Kontroly Impulzy c (naměřené) K1 K2 Vzorky Impulzy c (naměřené) 3. Klinická interpretace: referenční meze; uvést příklady ↓ a ↑ klinických hodnot. 4. Kdy jsou koncentrace androstendionu u pacientů mnohonásobně vyšší? 5. Popis bezpečnosti v RIA laboratoři (příklad kontrolní test ověření znalostí), monitorování pracovního prostředí v RIA laboratořích. 6. Fyzikální poločas rozpadu ^125I je? Jaké jsou výhody a nevýhody stanovení RIA?