Chromatografické metody RNDr. Alena Mikušková FN Brno – Pracoviště dětské medicíny, OKB Mikuskova.alena@fnbrno.cz chrom-panoráma CHROMATOGRAFIE §Separační (dělící) metoda a současně §Analytická metoda - poskytuje kvalitativní a kvantitativní informaci o vzorku §Využívá distribuce látek mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze •Stacionární (nepohyblivou), SF – pevná látka nebo na povrchu pevné látky fixovaná kapalina •Mobilní (pohyblivou), MF – kapalina nebo plyn • • Fáze = homogenní část heterogenního systému oddělená od okolí fázovým rozhraním §MF proudí přes nosič nebo kolonu obsahující SF §Distribuce komponent směsi mezi obě fáze dle rozdílné afinity ke SF, MF §jednotlivé složky směsi procházejí systémem různou rychlostí: •látky s vyšší afinitou ke SF migrují pomaleji •látky s nižší afinitou ke SF migrují rychleji § §Objevitel - ruský botanik Cvět –přelom 19. a 20. století –dělení rostlinných pigmentů chrom Klasifikace chromatografických metod - Podle uspořádání systému •Chromatografie plošná (planární) –SF (voda nebo polární rozpouštědlo) zakotvená na vláknech papíru (papírová chromatografie) –SF (silikagel, alumina, celulóza, aj.) rozprostřená na inertní podložce (chromatografie na tenké vrstvě, TLC) •Chromatografie kolonová (sloupcová) -SF (silikagel, polymer,…) tvoří náplň kolony -SF nanesená / chemicky navázaná na nosné částice -SF nanesená přímo na vnitřní povrch kolony -dle mobilní fáze - LC, GC column2 hplc_column gc_column packed GC dělení papír Klasifikace chromatografických metod •- Podle skupenství mobilní fáze –plynová (gas chromatography, GC) – plynná MF –kapalinová (liquid chromatography, LC) – kapalná MF – – •- Podle způsobu vymývání frakcí vzorku z kolony –frontální –vytěsňovací –eluční – – – – – •- Podle složení mobilní fáze –izokratické dělení - mobilní fáze má po celou dobu dělení konstantní složení –dělení s proměnlivým složením mobilní fáze •stupňovitá eluce •gradientová eluce • •- Chromatografie podle účelu –Preparativní - pro přípravu většího množství čistých látek –Analytická - pro určení identity a koncentrace látek ve směsi frontální Ch Vytěsňovací Ch Eluční Ch Klasifikace chromatografických metod • Podle separačního mechanismu: • §Iontová výměna - rozdílná afinita nabitých částic k opačně nabitým funkčním skupinám SF § §Rozdělování – interakce kapalina – kapalina § §Adsorpce – interakce kapalina – pevná látka § §Gelová permeační chromatografie – omezení transportu látek pórovitým materiálem § §Afinitní chromatografie – interakce ligand – vázaná látka § §Kombinace metod Klasifikace chromatografických metod • Iontoměničová chromatografie (ionexová, ion-exchange, IEC) §výměna iontů elektrostaticky vázaných na nabitém povrchu SF a iontů v roztoku §SF - iontoměnič (ionex): částice gelu s navázanými nabitými funkčními skupinami: •Katexy (umožňují výměnu kationtů) •silně kyselé sulfonové skupiny –SO3-H+ •slabě kyselé karboxy-, karboxymethyl-, sulfomethyl-, fosfo-, apod. skupiny •Anexy (umožňující výměnu aniontů) •silně bazické triethylaminoethylové skupiny •slabě bazické aminoethyl-, diethylaminoethyl-, guanidoethyl- apod. skupiny §na těchto skupinách vázán opačně nabitý ion (zachování elektroneutrality) §tento je na začátku analýzy vyměněn za ionty analytů ze vzorku §složky dělené směsi pak z kolony eluovány §postupnou změnou pH §a/nebo změnou iontové síly MF §IEC umožňuje dělit ionty •nízkomolekulární - aminokyseliny, nukleotidy •vysokomolekulární - peptidy, proteiny, oligonukleotidy, – nukleové kyseliny ionexová chromatografie orez Klasifikace - Podle separačního mechanismu •Rozdělovací chromatografie * Distribuce látek mezi dvě nemísitelné tekutiny –rozdíly v rozpustnosti složek vzorku v MF a SF (LC) –rozdíly hodnot rozpustnosti složek vzorku ve SF (GC) * SF - vždy kapalina: –naadsorbovaná / chemicky navázaná na nosiči •- (např. na vláknech papíru u papírové chromatografie, na nosných částicích u HPLC) –nanesena na vnitřním povrchu kapilární kolony (GLC) * MF – kapalina nebo plyn –plynová (gas-liquid, GLC, zjednodušeně GC) –kapalinová (liquid-liquid, LLC, zjednodušeně LC) ve dvou provedeních: •LLC s normální fází - SF polární, MF méně polární •LLC s obrácenou fází - SF nepolární, MF polární (častější provedení) » - vhodnější pro separaci méně polárních látek * Rozdělovací koeficient (K) - rozhoduje o pohyblivosti jednotlivých složek směsi •K = c org / c vod – c org ... koncentrace rozpuštěné látky v organické fázi c vod ... koncentrace rozpuštěné látky ve vodné fázi rozdělovací orez Klasifikace chromatografických metod •Adsorpční chromatografie * Dělení založeno na rozdílech v adsorpci a desorpci látek směsi na pevný povrch sorbentu (elektrostatické síly, vodíkové můstky, disperzní síly) * Adsorpci popisuje tzv. Langmuirova adsorpční izoterma (závislost množství analytu ve stacionární fázi na koncentraci v mobilní fázi) – CS = w . z . CM / (1 + w . CM) §w … adsorpční koeficient pro daný analyt §z … počet volných interakčních míst na povrchu §CS, CM… koncentrace analytu v obou fázích §nízké koncentrace analytu v MF - lineární závislost CS na CM §vysoké koncentrace CM - vysycení interakčních míst sorbentu, závislost se zakřivuje Bez názvu adsorbční Klasifikace chromatografických metod •Gelová permeační chromatografie §Umožňuje dělit molekuly podle jejich velikosti a tvaru: §SF - gelové částice kulovitého tvaru (na bázi polysacharidů nebo polyakrylamidu) s póry definovaných rozměrů §Malé molekuly - difusním pohybem vnikají do vnitřních prostor gelových částic - na koloně zadržovány §Velké molekuly - nedostanou se do pórů, jsou unášeny proudem MF a vytékají z kolony dříve gel filtrace gelová permeační orez Klasifikace chromatografických metod •Afinitní chromatografie * využívá specifické interakce molekul: §interakce biologické povahy •enzym - substrát •enzym - inhibitor •antigen - protilátka •receptor - hormon apod. §biologickou interakci napodobující •bílkovina - triazinové barvivo •bílkovina - kovové ionty apod. • * Jeden z partnerů (tzv. ligand) - pevně navázán na nosič (náplň kolony) * V dělené směsi (v MF) - přítomna řada molekul, z nich jen některé mají afinitu k ligandu → naváží se, ostatní složky směsi se z kolony vymyjí * změna složení mobilní fáze tak, aby se oslabila interakce ligand – navázaná molekula → uvolnění z kolony * separace, izolace, čistění složek vzorku affinitní Přehled chromatografických technik •Chromatografie ■planární §papírová rozdělovací §tenkovrstvá TLC •tenkovrstvá rozdělovací (SF kapalina) •tenkovrstvá adsorpční (SF pevná látka) ■kolonová §plynová GC •plynová rozdělovací GLC (SF kapalina) •plynová adsorpční GSC (SF pevná látka) §kapalinová LC •kapalinová rozdělovací LLC (SF kapalina) •kapalinová adsorpční LSC (SF pevná látka) §gelová permeační GPC §iontově výměnná IEC §afinitní (a další) • Planární chromatografie §Nanesení chromatogramu - vzorky na startovní pozici blízko okraje plošného nosiče (papíru, tenké vrstvy) ve formě malých kapek nebo tenkých čar §Vyvíjení chromatogramu – v chromatografické vaně: §spodní konec nosiče ponořen do MF pod úrovní startovací linie §MF v důsledku kapilárních sil migruje přes SF, unáší s sebou složky směsi v závislosti na jejich afinitě ke SF •papírová chromatografie umožňuje i sestupné uspořádání - dle směru pohybu MF §Vizualizace skvrn - usušený chromatogram lze vizualizovat •barvotvorným činidlem •osvícením UV světlem •fluorescenčně §Charakteristikou látky je retenční faktor Rf §hodnota Rf - pro dané uspořádání experimentu stálá • Rf = A / B – A…vzdálenost start – střed skvrny – B…vzdálenost start – čelo rozpouštědla rf dělení dělení barviv Planární chromatografie §Dvourozměrná TLC •Vyvíjení chromatogramu první mobilní fází •otočení usušené destičky o 90 st. •vyvíjení druhou mobilní fází •dokonalejší separace §HPTLC (high perfomance thin layer chromatography) - tenká vrstva sestává z částic o malém průměru (4,5 μm) • • §Planární techniky - metody kvalitativní nebo semikvantitativní s vizuálním hodnocením - srovnáním se skvrnami standardů chromatografovaných na témže nosiči 2D TLC glyko a fosfolipidů 2D TLC lipidy TLC3 Kolonová chromatografie •Chromatogram §grafický záznam odezvy detektoru jako funkce času, případně objemu: •Při postupu vzorku kolonou se jednotlivé složky vzorku separují, tj. dospějí do detektoru v různých retenčních časech •eluované analyty graficky znázorněny jako série vrcholů (píků) §data reprezentovaná chromatogramem slouží k identifikaci a kvantifikaci analytů: •- retenční čas tR – kvalitativní charakteristika analytu •- plocha chromatografického vrcholu – kvantitativní charakteristika • - koncentrace analytu vypočítána na základě porovnání • plochy píku analytu s plochou píku standardu • - plochu píku lze vypočítat jako: výška x poloviční šířka (h x w1/2) chromatogram chrom Dělení Kolonová chromatografie •Základní pojmy – popis chromatografického píku •tRj (min)…retenční čas j-tého analytu (celkový čas, který příslušný analyt stráví v koloně) •tM (min)…mrtvý čas kolony (retenční čas analytu, který není v koloně zadržován, tj. pohybuje se stejnou rychlostí jako MF) •W1/2j…šířka píku j-tého analytu v polovině výšky •Wj…šířka píku j-tého analytu u základny •t’R,j (min)…redukovaný retenční čas j-tého analytu (čas, který příslušný analyt stráví ve stacionární fázi) » t’R,j = tR,j – tM » » Obdobně: » - retenční objem VRj » - mrtvý objem VM » - redukovaný retenční objem V‘Rj » V’R,i = VR,i – VM šířka píku Kolonová chromatografie •Termodynamika a kinetika separace na koloně §Postup vzorku kolonou → jednotlivé složky vzorku (analyty) se separují, tj. dospějí do detektoru v různých retenčních časech • – tento děj popisují termodynamické pojmy Ødistribuční (rozdělovací) konstanta KD Økapacitní faktor (retenční faktor, kapacitní poměr) k §Při postupu vzorku kolonou se zóny analytů postupně rozšiřují vlivem difůze –- tento děj popisují kinetické pojmy Øpočet teoretických pater dané kolony n Øvýškový ekvivalent teoretického patra H §Termodynamika a kinetika spolu úzce souvisí –obě určují, jak dokonale budou zóny sousedních analytů odděleny Kolonová chromatografie •Termodynamika separace na koloně ØDistribuční (rozdělovací) konstanta KDi Ø Ø Ø •(ci)s, (ci)m...koncentrace i-tého analytu ve SF a MF ( c = n / V) •(ni)s, (ni)m…látkové množství i-tého analytu ve SF a MF •Vs (ml)…objem SF kolony •Vm (ml)…objem MF v koloně – ØKapacitní faktor (retenční faktor, kapacitní poměr) ki • Ølze zjistit přímo z chromatogramu Kolonová chromatografie Kinetika separace na koloně Ø ØTeoretické patro chromatografické kolony –pomyslná část kolony, ve které dojde k jednomu ustavení rovnováhy mezi SF a MF –Délka této části kolony = tzv. výškový ekvivalent teoretického patra • –vyšší počet teoretických pater → vyšší účinnost kolony Ø Ø Øpočet teoretických pater dané kolony – n Ø §wj…šířka píku analytu při základně Ø Ø Ø Ø Øvýškový ekvivalent teoretického patra – H (mm) Ø ØL…délka kolony (mm) Kolonová chromatografie Termodynamika a kinetika separace na koloně §Výškový ekvivalent teoretického patra (H) závisí na lineární rychlosti mobilní fáze (u) §Závislost vyjadřuje Van Deemterova rovnice –H = A + B / u + C . u §A…vířivá difůze, §B…podélná molekulární difůze, §C…odpor proti přenosu hmoty v SF a MF * * •Vířivá difůze (1) – úměrná velikosti částic SF (hlavně u HPLC) -různé molekuly urazí při pohybu kolonou různé vzdálenosti •Podélná molekulární difůze (2) - molekuly putují z místa o vyšší koncentraci do místa s nižší koncentrací •Odpor proti přenosu hmoty ve SF (3) - různé molekuly difundují různě hluboko do SF (závisí na typu SF), hlavně u GC •Odpor proti přenosu hmoty v MF (4) • • •minimum Deemterovy křivky odpovídá optimální průtokové rychlosti, při které –daná kolona vykazuje největší účinnost (má největší počet pater) –minimálně rozšiřuje zóny analytů obr29 obr28 Kolonová chromatografie Termodynamika a kinetika separace na koloně * Rozlišení R - míra chromatografické separace –pro dobré rozdělení dvou sousedních analytů) je nutné, aby analyty měly - dostatečně rozdílné retenční časy (správná volba SF, MF - termodynamika) •- dostatečně úzké zóny (délka kolony, velikost částic SF, u - kinetika) • * Ri,j…rozlišení i-tého a j-tého analytu * * * * * * * * –Zlepšení špatného rozlišení látek A, B (a) •změnou termodynamických faktorů (b), •kinetických faktorů (c) •zkrácení analýzy změnou průtokové rychlosti MF obr30b1 obr30b2 LC rozliseni orez Plynová chromatografie, GC §Mobilní fáze - nosný plyn (nejčastěji inertní plyn - dusík, helium, argon) §Separace u GC je založena §na rozdílech tlaku par analytů §interakcích se stacionární fází -těkavější analyty se pohybují kolonou rychleji než analyty méně těkavé a navíc analyty interagující se stacionární fází procházejí kolonou pomaleji než analyty se slabší interakcí §GSC - separace na základě adsorpce analytů na pevný povrch náplně kolony §GLC - separace na základě rozdělení mezi plynnou MF a kapalnou SF (netěkavá kapalina zakotvená na částicích náplně nebo přímo na vnitřním povrchu kapilární kolony) §Plynový chromatograf •zdroj mobilní fáze a zařízení pro kontrolu průtoku nosného plynu systémem •dávkovač pro nanesení analytu na kolonu •chromatografická kolona pro separaci analytů •termostat (pec) pro regulaci teploty kolony •on-line detektor pro detekci separovaných analytů vycházejících z kolony •PC pro kontrolu systému a vyhodnocení dat GC obrázek Plynový chromatograf •Zdroj nosného plynu a systém kontroly průtoku §nosný plyn - např. He, Ar, N2, H2 (dle typu kolony a detektoru) §nosný plyn musí být velmi čistý a suchý •trubice s molekulovým sítem odstraňují H2O, uhlovodíky, O2 §nutná řízená rychlost průtoku nosného plynu (pro získání reprodukovatelných retenčních časů) •regulace průtoku plynu z tlakové nádoby - programovatelné elektronické regulační systémy –náplňové kolony: průtok 10 - 60 ml/min –kapilární kolony: 1 - 2 ml/min (stabilní !) • •Dávkovač §vnáší alikvot vzorku (µl) do kolony §vzorky v org. rozpouštědle dávkovány injekční jehlou přes septum do vyhřívaného prostoru - ihned převedeny do plynné fáze a vneseny do kolony nosným plynem §split - splitless technika dávkování vzorku na kolonu: –split mód - do kolony vstupuje pouze malá část zplyněného vzorku - pro kapilární kolony –splitless mód - do kolony vstupuje většina vzorku GCMS 010 GCMS 008 Plynová chromatografie, GC - kolony •Náplňové kolony - starší typ, již málo používané –trubice (vnitřní průměr řádově mm, délka 1 m a více, sklo nebo nerez ocel) naplněné nosnými částicemi –částice náplně jsou samy o sobě stacionární fází (GSC – sorbenty: modifikovaný silikagel, aktivní uhlí, alumina, molekulové síto, porapaky,…) –částice jsou stacionární fází potaženy (GLC) §užší kolony •vyšší účinnost •menší kapacita pro vzorek §delší kolony •vyšší účinnost •nutné zvýšené tlaky nosného plynu •Kapilární kolony - WCOT (wall-coated open tubular column) –kapiláry z křemenného skla (vnitřní průměr 0,1 - 0,5 mm, délka 10 - 150 m) –na povrchu potaženy polyimidem (pevnost a pružnost) –vnitřní povrch potažen tenkým filmem SF –velmi účinné –malá kapacita pro vzorek packed GC Sorbenty gc_column Plynová chromatografie, GC - kolony •Stacionární fáze pro GLC §netěkavé chemicky inertní kapaliny: methylsilikonové polymery, substituované silikonové polymery, silikonové polyestery, polyethylenglykoly apod. §naneseny nebo chemicky navázány přímo na vnitřním povrchu kapilární kolony * * * • * * * * * * * * * • • * • §Dostupné i GC mikrokolony na bázi silikonového čipu SF pro GLC GCMS 011 GC-chip Plynový chromatograf - detektory §Univerzální detektory - detegují většinu analytů §Selektivní detektory –kombinace více detektorů •Plamenově ionizační detektor (flame ionization detector, FID) –univerzální detektor pro GC –efluent z kolony smísen s H2 a vzduchem, eluované analyty jsou spáleny v plameni –v plameni dochází k ionizaci a vzniklé ionty zvyšují vodivost plamene •NPD (nitrogen – phosphorus detector) modifikace FID –nad plamen umístěna vyhřívaná kulička soli alkalického kovu (Rb, Cs) –přítomnost iontů alkalického kovu v plameni zvyšuje signál pro analyty obsahující dusík a fosfor •Fotoionizační detektor (photoionization detector, PID) –ionizace intenzivním UV zářením –selektivní pro UV absorbující látky •Termovodivostní detektor • (thermal conductivity, TCD) –v přítomnosti analytu v nosném plynu • se zvyšuje tepelná vodivost plynu –univerzální, jednoduchý, horší citlivost •Detektor elektronového záchytu (electron capture, ECD) –snížení ionizace nosného plynu v důsledku vychytávání elektronů z ionizujícího β-zářiče elekronegativními skupinami •Hmotnostní detektor (mass spectrometry detector, MSD) FID PID ECD TCD Plynová chromatografie •Příprava vzorků pro GC analýzu: §extrakce sledovaných analytů ze vzorku biologického materiálu do organického rozpouštědla – + odpaření rozpouštědla z extraktu § §chemická derivatizace - zvýšení těkavosti a termostability látek pro GC analýzu (klinicky významné látky jsou zpravidla netěkavé) –silylace – substituce atomu vodíku funkčních skupin látek silyl-skupinou (R3Si–) –oximace – tvorba oximů kondenzací aldehydů nebo ketonů s hydroxylaminem NH2OH –acylace, esterifikace Odpařování Kapalinová chromatografie - LC §Separace založena na rozdělení látek mezi kapalnou mobilní fázi a fázi stacionární §High perfomance liquid chromatography (HPLC) - jako nosič použity částice malého průměru (5 µm), §HPLC je v klinické laboratoři nejrozšířenější forma LC (všechny principy dělení) •Kapalinový chromatograf •kolona pro separaci analytů •zásobníky rozpouštědel (mobilní fáze) •čerpadla pro zajištění průtoku mobilní fáze systémem •dávkovač pro nanesení vzorku na kolonu •on-line detektor pro detekci separovaných analytů •PC pro kontrolu systému, sběr a vyhodnocení dat * Schema HPLC ukázka HPLC Alliance Kapalinový chromatograf •Zásobníky s mobilními fázemi §v nejjednodušší formě skleněné lahve s přívodními hadičkami k čerpadlům §MF připraveny z čistých rozpouštědel určených pro chromatografii (HPLC grade) §MF přefiltrovány přes membránový filtr pro odstranění případných pevných částic §MF zbaveny rozpuštěných plynů – sonikace, vakuové degassery (odplyňovače) •Čerpadla •čerpadla zajišťují reprodukovatelný, konstantní a bezpulzní průtok MF systémem •v systému je nutné vyvinout vysoké tlaky (až 250 bar) – (1 bar = 105 Pa = 1,02 atm = 14,5 psi) Øbezpulzní tzv. lineární dávkovač - pro malé průtoky MF – - pracuje na principu injekční stříkačky Øpulzní pístová dvojúčinná (reciproká) čerpadla – - činnost je fázově posunutá pro minimalizaci pulzů –Vyhlazení pulzů •tlumič pulzů na principu svinuté odporové kapiláry •nebo redukce pulzů změnou rychlosti pohybu pístů • üizokratický mód práce čerpadla – - složení MF zůstává konstantní během celé analýzy ügradientový mód – - změna složení MF s časem - až čtyři složky MF programovatelně směšovány gradientovým – ventilem * duapiston pump Kapalinový chromatograf •Dávkovací zařízení –šesticestný ventil s vyměnitelnou smyčkou •objem od desítek nanolitrů po mililitry •plnící pozice (poloha A) - vzorek se nasaje ze vzorkové nádobky (tzv. vialky) dávkovací injekční stříkačkou do smyčky •otočením ventilu do polohy B je obsah smyčky vnesen do proudu mobilní fáze •dávkovací ventil je přesný, programovatelný §Další možnosti –dávkovače s děličem (obdoba splitovacího zařízení v GC) –dávkovače s možností smísení vzorku s derivatizačním činidlem před nadávkováním na kolonu (předkolonová derivatizace) šesticestný ventil HPLC kolona •Náplňové kolony §běžné kolony - vnitřní průměr 0,1 - 5 mm, délka 50 - 250 mm §tzv. nanobore kolony - vnitřní průměr 25 - 100 µm §open-tubular kolony - průměr pod 25 µm §částice náplně různé velikosti - průměr 1,8 - 10 µm * Obecně platí: –kolony s malým vnitřním průměrem a malým vnitřním objemem - vyšší účinnost, nižší limit detekce, malé objemy MF –čím menší částice náplně, tím větší je účinnost kolony (ale tím větší je odpor vrstvy náplně proti pohybu MF) * Typy částicových náplní LC kolon –náplně s navázanou fází - SF chemicky navázána na povrch částic silikagelu (C18, C8,…) –polymerní náplně - SF na povrchu polymerních částic – vysoká pH odolnost –chirální náplně - pro separaci enantiomerů –restricted-access náplně - analýza biologických směsí s vysokým obsahem proteinů •Monolitické kolony –vysoká účinnost a nízké zpětné tlaky –kolona zcela vyplněna pórovitým polymerem • •Kapilární kolony pro LC (0,1 - 1 mm vnitřní průměr, 10 - 50 cm délky) •dostupné jsou i analytické HPLC čipy * Předkolona –ochrana kolony před ireverzibilní adsorpcí proteinů ze vzorku –naplněna stejnou nebo podobnou SF jako analytická kolona hplc_column monolyt kapilára HPLC Agilent HPLC čip Kapalinový chromatograf - detektory ØDetektor (s výjimkou MSD) obsahuje průtokovou celu - zde detegovány separované analyty Øgenerovaný elektronický signál zaznamenán ve formě chromatogramu • §Fotometry a spektrofotometry - měření absorbance UV a VIS záření –Detektory s fixní vlnovou délkou –Detektory s variabilní vlnovou délkou –Detektory diodového pole (PDA) - schopné měřit v celé oblasti λ -průtokovou kyvetou prochází polychromatické světlo -prošlé světlo je za kyvetou rozděleno difrakční mřížkou -světlo dopadá na diodové pole §Fluorometry - pro detekci fluorescenčních látek -často nutná před- nebo postkolonová derivatizace analytů §Elektrochemické detektory –amperometrické el.-chem. detektory •oxidace nebo redukce elektroaktivního analytu v průtokové cele na povrchu elektrody s konstantním potenciálem → zaznamenám vzniklý elektrický proud •př. analýza katecholaminů v moči –coulometrické detektory -oxidace nebo redukce analytu → měření elektrického náboje -př. stanovení metanefrinů, vanilmandlové kyseliny, homovanilové kyseliny nebo 5-hydroxy-indoloctové kyseliny v moči §Refraktometrický detektor měří změny indexu lomu eluátu v závislosti na koncentraci analytu §Hmotnostní detektor Výstup HPLC, UPLC •Výrobci HPLC systémů •např. Waters, Agilent Technologies, Thermo, PerkinElmer, Shimadzu, Varian, Amersham Pharmacia, Dionex, Jasco, Gilson, Hitachi, BioRad a další… * •UPLC, UHPLC §Ultra high-perfomance liquid chromatography §vyšší separační účinnost než klasická HPLC §UHPLC využívá chromatografické kolony s částicemi < 2µm §přístroje schopné pracovat s ultravysokými tlaky (100 MPa) §práce s širokým rozsahem průtoků §významné zkrácení doby analýzy §Výrobci UPLC - např. firma Waters, Thermo, Perkin-Elmer, Dionex, BioRad a další. § §UPLC Waters Acquity (s MS detektorem) * uplc Příprava vzorků pro HPLC analýzu •Deproteinace, čištění vzorku a zakoncentrování analytů •Srážení proteinů – org. rozpouštědlo, kyselina •Ultrafiltrační techniky - úprava roztoků pomocí polopropustných membrán –hustota membrány limituje velikost separovaných molekul –technika je vhodná pro deproteinaci vzorků – •Extrakční techniky §Kapalinová extrakce analytů do organického rozpouštědla –L-L extrakce při vhodném pH –organický extrakt se odpařuje v proudu inertního plynu (N2) –odparek se rozpustí v nezbytném objemu mobilní fáze * Extrakce pevnou látkou (solid phase extraction, SPE) §využití kolonek naplněných médiem dle charakteru látky - - sorbent, iontoměnič, gel atd. §vzorek v roztoku se kolonkou prolévá pod tlakem §nezachycené složky (proteiny,…) se vymyjí §zachycené složky se uvolní vhodným rozpouštědlem §SPE je automatizovatelná Odpařování SPE Pozn.: Možnost přímé HPLC analýzy vzorků s obsahem proteinů • •Restrict – access material RAM RAM2 Pozn.: Možnost analýzy látek iontové povahy pomocí RPC •Iontově párová chromatografie (IPC) •modifikace RPC (LLC s obrácenou fází, revers-phase chromatography) –zlepšuje separaci sloučenin iontové povahy •přídavek do MF: iontově párující činidlo mající hydrofobní část (alifatický řetězec) a hydrofilní část –např. N-alkyl kvartérní amoniové soli pro separaci látek aniontového typu • soli alkylsulfonových kyselin pro separaci látek kationtového typu • + vhodné pH MF, aby bylo dosaženo úplné ionizace dělených analytů •dělená látka iontové povahy a opačně nabitý ion vytvoří iontový asociát –asociáty jsou neutrální, vykazují zvýšenou retenci na nepolární SF ion pár Derivatizace analytů •zlepšení separace na koloně •umožnění nebo usnadnění detekce analytů • –předkolonová derivatizace •např. derivatizace aminokyselin a jiných primárních aminů •vznik fluorescenčních sloučenin → detekce fluorometrem •Vznik UV absorbující látky → detekce v UV • • • • • • • – • –postkolonová derivatizace •např. u analyzátorů aminokyselin •eluované aminokyseliny za kolonou derivatizovány ninhydrinem fotometrická detekce • – – PITC Chromatografie - kvantitativní analýza •Kalibrační techniky: • •Externí kalibrace (kalibrace s vnějším standardem): –provedení analýz referenčních vzorků se známým obsahem analytu –sestavení kalibrační křivky - velikost ploch píků analytu v závislosti na jeho koncentraci –použití kalibrační závislosti pro vyhodnocení koncentrací analytu v reálných vzorcích * Interní kalibrace (kalibrace s vnitřním standardem): –provedení analýzy referenčních vzorků se známým obsahem analytů s přídavkem konstantního množství vnitřního standardu * vnitřní (interní) standard – sloučenina s podobnými vlastnostmi jako stanovované analyty, ale nevyskytující se v reálných vzorcích –do kalibrační křivky se vynáší poměr plochy píku analytu a plochy píku vnitřního standardu v závislosti na koncentraci analytu –do reálných vzorků se přidává interní standard ve stejném množství jako do referenčních roztoků –koncentrace analytu se vyhodnocuje na základě poměru plochy (výšky) odpovídajícího píku a píku vnitřního standardu * Externí kalibrace interní kal Praktické aplikace chromatografických technik v klinické biochemii - příklady •Tenkovrstvá chromatografie (TLC, HPTLC) §kvalitativní, příp. semikvantitativní analýza §flexibilní levná matoda §umožňuje souběžně analyzovat více vzorků §nevyžaduje přístroje a náročnou přípravu §velmi časté využití v toxikologii průkaz THC –cílené průkazy nejrůznějších nox (jedů, škodlivin) –orientační screening léků a drog –pozitivní výsledky z toxikologického screeningu musí být konfirmovány pomocí dalších chromatografických metod (př. HPLC, často ve spojení s hmotnostní spektrometrií) – –HPTLC – sacharidy HPTLC – lipidy dvojrozměrná TLC – složené lipidy TLC canabis 2D TLC lipidy TLC cukry chromatographie lipidy Praktické aplikace chromatografických technik v klinické biochemii - příklady •Papírová chromatografie §jednoduchá, již málo používaná technika př. screening aminokyselin v moči •Ionexová chromatografie (IEC) ØAnalýza aminokyselin –vzorek - deproteinovaná plazma resp. sérum, moč, CSF - směs volných aminokyselin (AMK) –AMK vneseny na kolonu s katexem ve formě kationtů (při nízkém pH) –AMK postupně eluovány z kolony pufry o zvyšující se eluční síle (rostoucí pH a iontová síla) –postkolonová derivatizace ninhydrinem –kvalitativní vyhodnocení chromatogramu - na základě retenčních časů –kvantitativní vyhodnocení pomocí vnitřního standardu (syntetická AMK norleucinu) – – – – – – – – – Analyzátor AMK (Perkin – Elmer) ØDalší využití IEC •nukleotidy, peptidy, proteiny, oligonukleotidy, nukleové kyseliny papír graf3 orez AAA 024 Praktické aplikace chromatografických technik v klinické biochemii - příklady • HPLC rozdělovací §z chromatografických metod nachází nejširší uplatnění v klinické biochemii §většina aplikací využívá HPLC s reverzní fází §lze ji aplikovat na široké spektrum analytů v závislosti na způsobu detekce –sacharidy - karboxylové kys. - aminokyseliny –lipidy - steroidy - katecholaminy –léky - drogy - homocystein –pteriny - CDT - glykovaný hemoglobin atd. §HPLC se uplatňuje jako standardní metoda v toxikologii, hlavně v kombinaci s hmotnostní spektrometrií •Analýza •7-dehydrocholesterolu (prekursor cholesterolu – endogenní syntéza): -záznam z PDA -chromatogram při λmax - • Karboxylové kyseliny - • dynamika přeměny kys. benzoové na kys. hippurovou (detoxikační reakce) 7DHC 7DHC ex benzo Praktické aplikace chromatografických technik v klinické biochemii - příklady • Záznam HPLC analýzy katecholaminů v moči z HPLC Agilent série 1200, elektrochemický detektor Coulochem • • • • • • • • • • • • • • Katecholaminy – adrenalin, noradrenalin, dopamin • Metanefriny – metanefrin, normetanefrin (metabolity katecholaminů) • Kys. vanilmandlová (metabolit katecholaminů) • - markery feocytochromu (nádor sympatoadrenálního systému, nejčastěji dřeně nadledvin) • • Agilent coulochem Praktické aplikace chromatografických technik v klinické biochemii - příklady •Analýza CDT (karbohydrát-deficientní transferin) §detekce nadměrného užití alkoholu §monitorování abstinence v průběhu léčby § ØTransferin - glykoprotein vázající železo –obsahuje 2 polysacharidové řetězce –variabilní množství kyseliny sialové –podle počtu skupin kyseliny sialové - 6 izoforem * a-, mono-, di-, tri-, tetra- a penta-sialotransferin –disialotransferin - cílová sloučenina pro stanovování CDT HPLC analýzou – – – – – – – – - pozitivní pacient - negativní pacient CDT pozit CDT negat Sialotransferiny Praktické aplikace chromatografických technik v klinické biochemii - příklady •HPLC analýza glykovaného hemoglobinu §HbA1c - stabilní adukt glukózy s N-terminální aminoskupinou valinu β–řetězce hemoglobinu §Diferenciální diagnostika diabetu §Určení kompenzace a stability glukózového metabolismu §Monitorování terapie • §Izolace a hemolýza erytrocytů - EDTA krev – - izolace erytrocytů centrifugací, promytí fyziologickým roztokem – - lyzace erytrocytů – - HPLC analýza (ionex. – kolona) • HPLC Analyzátor HbA1c Tosoh HBa1c - výpis Hba1c tosoh Praktické aplikace chromatografických technik v klinické biochemii - příklady •Analýza těkavých látek v kapalných nebo pevných vzorcích: •GC v uspořádání head-space •„head space“ – dávkování z prostoru nad vzorkem (plynná fáze po ustavení rovnováhy) – např. - analýza zbytků rozpouštědel ve farmaceutických výrobcích - stanovení alkoholu v krvi, atd. analýza alkoholu head space Praktické aplikace chromatografických technik v klinické biochemii - příklady •Plynová chromatografie Østandardní technika v kvalitativních i kvantitativních analýzách v toxikologii –plynové chromatografy v toxikologických laboratořích vybaveny různými detektory k různým typům analýz, např. * GC s plamenovým ionizačním detektorem - stanovení alkoholu a těkavých látek v krvi * NPD detektor - screening většiny léčiv či drog * detektor elektronového záchytu - analýze benzodiazepinů nebo halogenovaných látek * hmotnostní spektrometr - cílené průkazy a stanovení nox – Ødiagnostika dědičných metabolických poruch (GC / MS) Ø – Organické kyseliny v moči – diagnostika dědičných metab. poruch GC-MS Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry) •MS - fyzikálně-chemická metoda – kvalitativní i kvantitativní analýza §převedení molekul analytů na ionty §separace iontů ve vakuu podle jejich hmotnosti při průchodu magnetickými a elektrickými poli § •MS řazena mezi spektrální techniky, i když v principu se liší (nesleduje • rozdíly energetických stavů molekul) • • §MS vyvinuta počátkem 20. století §klinická biochemie – detekce a stanovení nízkomolekulárních látek ve spojení s plynovou chromatografií (1980) •90. léta 20.století - nové techniky, které umožnily využívat metodu •ve spojení s kapalinovou chromatografií •pro látky vysokomolekulární •samostatně bez napojení na separační techniku – Hmotnostní spektrum • Výstup MS - hmotnostní spektrum – čarový diagram •Osa x - hodnota m/z (hmotnost / náboj iontu) •Osa y - odezva detektoru nebo relativní zastoupení daného iontu (%) mass 2 Hmotnostní spektrometr • –převádí molekuly analytů na ionty –separuje a rozlišuje ionty podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) –zaznamenává intenzity jednotlivých iontů •Složený ze tří funkčních celků: •Iontový zdroj: •molekuly analytů převedeny do plynné fáze (do vysokého vakua) •přitom se ionizují •Iontový separátor: •rozdělení iontů různých hmotností: -ionty urychleny -z charakteru pohybu vakuovaným prostorem - vypočet jejich m/z •Detektor: •detekce iontů podle hodnoty m/z •určení intenzity (četnosti) iontů Další části přístroje - vakuový systém - zařízení pro zavádění vzorků (dávkovač) - iontová optika k urychlení a fokusaci iontů - počítač na ovládání přístroje, sběr a ukládání dat Iontový zdroj - Ionizační techniky §Existuje celá řada ionizačních technik - vytvoření nabité částice, která je následně analyzována §Použitá technika záleží na – - charakteru analyzovaných látek – - separační metodě, na kterou je MS napojen (chromatografie, – elektromigrační techniky, bez napojení na separaci) ØGC/MS §Elektronová ionizace EI §Chemická ionizace CI • • ØLC/MS (CE / MS, MS s přímým nástřikem) §ESI Elektrospray §APCI Chemická ionizace za atmosférického tlaku (atmospheric pressure chemical ionization,) §APPI Fotoionizace za atmosférického tlaku (atmospheric pressure photoionization,) § ØMALDI (SELDI) …a další Elektronová ionizace, EI (GC / MS) ■V iontovém zdroji - ionizace molekul analytu v plynném stavu pomocí proudu elektronů –odtržení elektronu z molekuly při srážce s paprskem elektronů (molekula získává kladný náboj) –následně dochází k fragmentaci (rozpadu) molekuly přebytkem energie • •EI - tvrdá ionizační technika (fragmentace) • ØPříklad: fragmentace molekuly MeOH, hmotnostní spektrum MS electron impact nfragmenty rozděleny v další části analyzátoru podle hodnoty m/z a detegovány nEI - pouze pro teplotně stálé nízkomolekulární látky (50 – 800 Da) • Dalton – jednotka molekulové hmotnosti Schema fragmentace methanol tabulka fragmentace MeOH Chemická ionizace CI (GC / MS) ■„Měkčí“ varianta elektronové ionizace - šetrnější, nedochází k rozsáhlé fragmentaci –do iontového zdroje je přiváděn ionizační plyn (př.metan) –proud elektronů ionizuje nejdříve molekuly ionizačního plynu –tyto předávají energii molekule analytu (M) – •Srovnání hmotnostního spektra při elektronové a chemické ionizaci srovnání EI,CI Elektrospray ionizace, ESI (LC / MS) § „měkká“ ionizační technika §převod kapalného vzorku do plynné fáze při současné tvorbě (pseudo)molekulárních iontů §eluát z kolony prochází kapilárou, na niž je vloženo vysoké napětí §vytváří se sprej vysoce nabitých kapiček §odpařením rozpouštědla vznikají ionty • (i vícenásobně nabité) § § § § § § § §vhodná pro nízkomolekulární i vysokomolekulární látky (peptidy, sacharidy, proteiny, nukleové kyseliny,...) §Iontový separátor – kvadrupól, iontová past ESI ESI orez Kvadrupól (iontový separátor) quadrupole §konstrukce - 4 kovové tyče připojené ke zdrojům stejnosměrného a střídavého napětí §ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, začnou oscilovat §při vhodné kombinaci obou složek napětí projdou kvadrupolem v daném okamžiku pouze ionty o určitém poměru m/z §změnou vkládaných napětí projdou postupně kvadrupolem postupně ionty v celém rozsahu m/z §lze použít pro GC/MS i LC/MS GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 015 Iontové pasti * stejné fyzikální principy jako kvadrupól –regulace pohybu iontu v určitém prostoru elektrickými poli •Sférická iontová past §omezuje pohyb iontu ve všech třech směrech §ionty se pohybují po určitou dobu v prostoru iontové pasti §vypuzovány z pasti selektivně podle hodnoty m/z • •Lineární iontová past §podobný tvar jako kvadrupól §na oba konce vkládáno elektrostatické pole - zabraňuje iontům opustit vnitřní prostor • kvadrupolová past qad past Iontové pasti •Iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací (FT - ICR) §princip - pohyb iontu v magnetickém poli •ion se v silném magnetickém poli pohybuje po kruhové dráze s frekvencí ω • ω = B. z / m B...intenzita magnet. pole §Fourierova transformace - frekvence ω překonvertovány na hmotnostní spektrum §extrémně vysoké rozlišení, velmi přesné měření hmotnosti • •Orbitrap §nejnovější iontový analyzátor §vysoké rozlišení §ionty vlivem elektrických polí obíhají a oscilují okolo centrální elektrody §frekvence závislá na m/z §oscilace snímají vnější detekční elektrody §Fourierova transformace - konverze na hmotnostní spektrum ICR-FT Orbitrap Detektor •Fotonásobič §před vlastním fotonásobičem umístěna fosforová destička §dopad částice z konverzní dynody na P-destičku - emise fotonů §dopad fotonů na fotokatodu - fotoelektrický jev - emise elektronů §zmnožení elektronů stejně jako v elektronovém násobiči - detekce iontů po jejich separaci podle hodnoty m/z - určení relativní intenzity (četnosti) jednotlivých iontů Elektronový násobič § série dynod se vzrůstajícím potenciálem § ion narazí na povrch první dynody - emise elektronu § dopad elektronu na další dynodu - vícenásobná emise § kaskádový efekt - velké množství elektronů § detekce detektory orez 1 detektory orez 2 detektory orez 3 Tandemová hmotnostní spektrometrie, MS/MS §ionty podrobeny dvěma (nebo více) hmotnostním analýzám •zapojení dvou (nebo více) iontových separátorů v tandemu §MS/MS - rychlá a citlivá analýza i bez použití separačních metod ve složité matrici § -MS1 - výběr iontů s určitou hodnotou m/z - prekurzorové (mateřské) ionty -kolizní cela - fragmentace prekurzorových iontů – vznik produktových iontů -MS2 - záznam spektra produktových (dceřinných) iontů •různé režimy práce -sken produktových iontů - charakterizace struktury -sken prekurzorových iontů - pro analýzu určitých skupin látek § •Trojitý kvadrupól QqQ - nejčastější •Q1 - výběr prekursorového iontu •q - kolizní cela - fragmentace srážkou • iontu s atomy inertního plynu •Q2 - analýza fragmentů • • QQQ Příklady použití – GC/MS §Pro analýzu neznámých složek směsi -pro každou složku směsi se získá hmotnostní spektrum -Identifikace složky porovnáním s PC databází spekter §Potvrzení či vyloučení metabolitů svědčících pro určité metabolické onemocnění §Kvantifikace určitých metabolitů §Toxikologie – standardní metoda •léky •drogy •jedy § • Ukázka – organické kyseliny v moči GC-MS GC-MS2 schema gcms Příklady použití - LC/MS, LC/MS/MS §Toxikologie – standardní metoda •screening neznámých nox •konfirmace a kvantifikace speciálních nox §Farmakokinetické studie, stanovení léků §Proteomika / metabolomika • • Stanovení léků LC/MS (LC/MS/MS) • • • • • • Pozn.: Záznam v SIM módu • (Selected Ion Monitoring): • • - Hmotnostní detektor sleduje pouze vybrané hmotnosti, nikoli celé spektrum iontů • • LC-MS LC MS MS léky Příklady použití MS/MS •Novorozenecký screening dědičných poruch metabolismu §Stanovení analytů ve výluhu ze suché krevní kapky -koncentrace aminokyselin -koncentrace acylkarnitinů -10 různých metabolických poruch • např. fenylketonurie • • • §MS/MS analýza bez použití separační metody (GC, LC) • - uspořádání ESI – trojitý kvadrupol newborn_health tandem MS odběr MALDI - Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization §vzorek v roztoku smíchán s matricí •deriváty nízkomolekulárních aromatických kyselin - absorbují energii laserového záření ve VIS nebo blízké UV oblasti §roztok nakápnut a vysušen (vykrystalizován) na MALDI destičce ve formě spotu §pulsní ozáření směsných krystalů zábleskem laseru - prudké odpaření látek do vakua §ionizovaná matrice strhne sebou analyt §ionizace molekul analytu ion-molekulárními reakcemi s ionizovanou matricí §ionty urychleny stejnosměrným • elektrickým polem do TOF • analyzátoru • • • • Matrice schema maldi 2 matrix MALDI - Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization §Velmi měkká, šetrná technika •i pro vysokomolekulární látky (proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy) • • Spotovací destička • • • • • • • • • • • • • •Pozn.: Technika SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption / Ionization) • - kombinace afinitního principu a ionizace MALDI • • • •Ionizační techniky dle „tvrdosti“: ESI (nejšetrnější) < MALDI < CI < EI • Spotovací destička na monitoru maldi destička maldi destička na monitoru Spotovací destička orez 1 TOF – analyzátor „Time of Flight“ (průletový) §deteguje hmotnosti ionizovaných molekul na základě doby letu evakuovanou trubicí •rychlosti letu závisí na hodnotách efektivní hmotnosti m/z •– lehčí molekula letí rychleji »t…čas L…délka dráhy »m…hmotnost iontu E…kinetická energie » §lineární nebo reflektronový mód (reflektron - vyšší rozlišovací schopnost) maldi-tof-ms TOF vzorec TOF – analyzátor „Time of Flight“ (průletový) §TOF teoreticky použitelný pro neomezený rozsah hmotností §v praxi se mu dává přednost pro velké molekuly §MALDI - TOF spektrometry - hlavně pro analýzu proteinů §molekuly s hmotností až 100 000 Da §TOF v kombinaci s EI nebo ESI - i pro menší molekuly, v jiném provedení § § § § § § § § § § § –Bruker – Agilent Technologies TOF 2 TOF Příklady použití - MALDI-TOF * Analýza biomolekul –proteiny –peptidy –oligosacharidy –nukleotidy… – – – §Identifikace mikroorganismů • po extrakci proteinů z bakterií nebo i metodou celých buněk §MALDI - IMS (imaging mass spectrometry) zobrazení rozložení proteinů i nízkomolekulárních látek ve tkáních přímou „in-situ“ analýzou MALDI - tkáň proteiny z bakterie maldi proteiny SELDI – Surface Enhanced Laser Desorption Ionization •Analýza proteinů pomocí vazby na předpřipravený povrch pevné fáze proteinového čipu: §kombinace afinitního principu a ionizace MALDI §povrch čipu - tvořen protilátkou, receptorem, ligandem, chemickou úpravou… §nanesení vzorku - navázání proteinů adsorpcí, el.-stat. interakcí, na afinitním principu,… §promytí čipu - odstranění nenavázané složky §Analýza – viz MALDI - TOF §Vzorek - komplexní směs proteinů může být analyzován současně na několika různých sorbentech, aby byly navázány a analyzovány veškeré proteiny ve vzorku §Čipy mohou být vyrobeny dle požadavku zákazníka § §Technologie Ciphergen SuperSELDI Děkuji za pozornost… • …ale i těm, kteří se nudili ! •…těm, které problematika zajímala… pozornost a nuda