ELISA Mgr. Jana Gottwaldová OSNOVA • Øpoužíváné protilátky, antigeny Øenzymové konjugáty, enzymy používané ke značení ØELISA techniky podle typu reakce antigen –protilátka: §Kompetitivní heterogenní imunoanalýza §Nekompetitivní heterogenní imunoanalýza (sendvičová) ØVyužití ELISA metod ØTechnická instrumentace :vertikalní fotometry, automatizované linky ØPříklad praktického využítí ELISA metod při monitorování biologických léčiv Ø • • Ø Ø Ø Ø • ELISA= Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay •imunochemická analytická metoda určená ke kvantitativnímu stanovení analytu v neznámém vzorku. •má vysokou citlivost a specificitu. •v typické imunochemické reakci je stanovován antigen jako analyt a protilátka je použita jako reagencie. •ELISA patří do skupiny metod EIA (enzyme immunoassay), které používají enzym ke značení protilátky ( nebo antigenu). •enzym po přidání substrátu do reakční směsi katalyzuje reakci, na jejímž konci je barevný produkt vhodný k fotometrické detekci. •heterogenní imunochemické stanovení - vyžadují separaci volné a vázané frakce ELISA techniky •Pro správné provedení ELISA techniky: • antigen nebo protilátka musí být navázán na povrch nosiče bez ztráty imunoreaktivity. •stabilita enzymů a také imunologická reaktivita konjugátu (komplex AbAg*) musí být během reakce stabilní. •aktivita enzymů, které jsou použity při značkování, se nemůže přirozeně vyskytovat v analyzovaných biologických tekutinách. •použité enzymy musí mít vysokou specifickou aktivitu, tj. přeměňují velká množství substrátu na detekovaný produkt. ELISA techniky - enzymové konjugáty •Enzymové konjugáty jsou buď antigeny nebo protilátky kovalentně navázané na vybraný enzym. •Při přípravě konjugátu lze postupovat tak, že protilátky jsou nekovalentně značkovány biotinem a pak se využívá jeho silné vazebné afinity k streptavidinu, který je vázán na enzym. Enzymy používané ke značení •musí být stabilní, •struktura enzymu musí umožnit vytvoření kovalentní vazby s protilátkou či antigenem, •nesmí dojít k výraznému ovlivnění katalytické aktivity enzymu. •měl by mít co nejnižší molekulovou hmotnost, •by měl mít co nejvyšší katalytickou aktivitu •měl by být dostupný v potřebné čistotě • •Produkt enzymové reakce musí být snadno •detekovatelný i ve velmi nízkých koncentracích. • Enzymy používané ke značení •Křenová peroxidáza (HRP – peroxidáse, EC 1.11.1.7) Substrát: 3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidin (TMB), detekce produktu při 450 nm • •Alkalická fosfatáza (EC 3.1.3.1) • Substrát: p-nitrofenylfosfát,detekce produktu při 405 nm • •β – D - galaktosidáza (EC 3.2.1.23) • Substrát: o-nitrofenyl – β – D –galaktopyranosid, detekce • produktu při 420 nm • ELISA techniky podle typu reakce antigen –protilátka • • •Kompetitivní heterogenní imunoanalýza • •Nekompetitivní heterogenní imunoanalýza (sendvičová) ELISA - Kompetitivní heterogenní reakce 1.protilátka je pevně vázána na stěnu jamky mikrotitrační destičky 2. 2. přidání stanovovaného vzorku a značeného antigenu 1 2 ELISA - Kompetitivní heterogenní reakce •3. inkubace: kdy o vazebné místo na protilátce soutěží značený antigen a neznačený antigen (analyt) ze vzorku •4. promývání: přebytek nenavázaného antigenu (značeného i neznačeného – tzv. volná frakce), který nezreagoval, se vymyje pomocí promývacího roztoku • 3 4 ELISA - Kompetitivní heterogenní reakce •6. přidání substrátu • • • • •7. Měření intenzity barevného zbarvení vytvořeného barevného produktu Spektrofotometrická detekce barevného produktu 6 7 ELISA - Kompetitivní heterogenní reakce •Platí zde nepřímá úměra: čím vyšší koncentrace analytu (neznačeného antigenu), tím nižší intenzita zbarvení (tím méně navázaného značeného antigenu). •Kompetitivní ELISA metodu lze použít i ke stanovení protilátek: • na povrchu jamky mikrotitrační destičky je •ukotven antigen a v tomto případě soutěží •neznačené protilátky z analyzovaného •vzorku se značenými protilátkami •(z reagencie, o známé koncentraci) •o vazbu na antigenu , opět zde platí •nepřímá úměra ELISA - Nekompetitivní (sendvičová) heterogenní reakce 1.první protilátka je navázana v nadbytku na stěně jamky mikrotitrační destičky • •2. přidání vzorku (antigenu) • •3.první inkubace: vytvoření imunokomplexu (antigen – 1. protilátka) 1 2 3 ELISA - Nekompetitivní (sendvičová) heterogenní reakce •4.promývání: z reakční směsi promytím odstraní nenavázaná frakce • • •5. přidá se druhá protilátka: značená enzymen (tzv. konjugát), která je namířena proti druhé antigenní determinantě na stejném antigenu • 4 5 ELISA - Nekompetitivní (sendvičová) heterogenní reakce • •6. druhá inkubace: je vytvořen „sendvičový“ komplex • • • •7. druhé promytí: dojde k separaci nadbytečného nenavázaného konjugátu 6 7 ELISA - Nekompetitivní (sendvičová) heterogenní reakce • •8. přidání substrátu • • • • •9. měření: změření intenzity zbarvení vytvořeného barevného produktu Spektrofotometrická detekce barevného produktu 8 9 ELISA - Nekompetitivní (sendvičová) heterogenní reakce • •nejvíce používaná ELISA metoda •platí zde přímá úměra: čím vyšší koncentrace analytu, tím vyšší intenzita zbarvení. Využití ELISA metod •ELISA metody lze použít pro stanovení nízkomolekulárních látek, jako jsou : • proteiny, • karbohydráty, • nukleové kyseliny, • lipidy aj. •Stanovení se provádí různých typech biologického materiálu.. Využití ELISA metod •Nejčastěji jsou analyzovány vzorky: • séra, plazmy, • moče, • mozkomíšního moku, • tkáně nebo lyzáty buněk. • •ELISA metody mají široké uplatnění ve zdravotnických laboratořích hlavně v imunologii a mikrobiologii (méně v biochemii nebo hematologii), kde se používají pro stanovení např. infekčních agens nebo protilátek. • Využití ELISA metod •Výhody: •jsou citlivé a specifické •mají nízké pořizovací náklady na technickou instrumentaci. •Nevýhody: •analýza vzorků pouze v sériích, •časová náročnost (doba jedné inkubace je více než 30 min., obvykle 1-2 hod. ) •manuální pipetování •vzorky nelze ředit během analyzované série ELISA - Technická instrumentace •Provádí se ve speciálních nádobkách uspořádaných do tzv. mikrotitračních destiček. • • • •Každá destička obsahuje 96 jamek uspořádaných ve 12 řadách po 8 jamkách. • ELISA - Technická instrumentace •Mikrotitrační destičky vyžadují při promývání: • použití speciálních osmikanálových pipet • automatických ELISA promývaček. •Pokud to metoda vyžaduje, lze během inkubace mikrotitrační destičku umístit do třepačky s možností nastavení intenzity třepání a inkubační teploty. •Pro měření výsledného produktu detekční reakce se používají speciální vertikální spektrofotometry - ELISA readry mikrotitračních destiček. ELISA - Technická instrumentace • •Pro měření výsledného produktu detekční reakce se používají speciální vertikální spektrofotometry - ELISA readry mikrotitračních destiček: je uspořádán tak, že světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru. ELISA reader (vertikální spektrofotometr) •Princip: světelný paprsek ze zdroje prochází přes zvolený interferenční filtr (podle požadované vlnové délky) do optických kabelů, •které zabezpečují distribuci do 9 oddělených kanálů: 8 z nich vedou přes jamky mikrotitrační destičky a dopadají na pole fotodiod, které detekují intenzitu světla. •Devátý optický kabel je použit na kontrolu intenzity záření vycházejícího ze zdroje (obrázek č.8). • Ve zlomku vteřiny se změří celá řada jamek (8), mikrotitrační destička se posune a může se měřit řada následující. ELISA reader (vertikální spektrofotometr) • ELISA reader (vertikální spektrofotometr) •Součásti vertikálního fotometru: •zdroj záření: nejčastěji používá halogenová žárovka nebo xenonová výbojka. •Interferenční filtry: jsou umístěny v posuvném držáku filtrů,obvykle se používá 6 filtrů (pro λ 400-800 nm). •Optický systém: se skládá 9 optických kabelů (světlovodiče), štěrbin a zrcadel pro vedení světelného paprsku ze zdroje do optického prostředí (jamka mikrotitrační destičky). •Detektor: používají se fotodiody. •Rychlost měření je 5s (celá mikrotitrační destička - 96 •jamek). Vertikální fotometrie •Vztah mezi změřeným signálem (absorpcí) a koncentrací se určuje kalibrací. Obvykle se změří absorbance 6-ti standardních roztoků o známé vzrůstající koncentraci a blank ( slepý pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky) při určité vlnové délce. Vertikální fotometrie •Při ELISA metodě se vyžaduje měření všech vzorků v duplikátech. •Poté software přístroje sestrojí kalibrační křivku (naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y,hodnoty koncentrace na ose x), ze které odečte hodnoty koncentrací neznámých vzorků • Při vertikální fotometrii závisí dosažené výsledky měření pouze na přesnosti pipetování kalibrátorů, kontrolních materiálů a vzorků. ELISA automatická linka •Automatická linka provádí: • automatické pipetování vzorků, reagencií, kalibrátorů a kontrol pomocí pipetovacího systému (2, 4, 8 jehel). •Má zabudovanou čtečku čárového kódu, což umožňuje pozitivní identifikaci pacientských vzorků. •Linka má obvykle 3-4 místa pro umístění mikrotitračních destiček. •Dále sestává z inkubátoru (místo pro inkubaci vzorků), • promývačky a readeru mikrotitračních destiček. •Transport destiček mezi jednotlivými částmi provádí pomocí robotického ramene. S •systém provádí automatické ředění vzorků a je opatřen softwarem pro automatické vyhodnocení měření. ELISA automatická linka •Velkou výhodou automatické linky je použití čárových kódů, a tím zabránění záměny mezi vzorky. Dále je to přesnost pipetování vzorků a reagencií, vysoká kapacita přístroje. •Nevýhodou je vyšší spotřeba používaných reagencií. • laboratorní monitorování hladin léků a protilátek ELISA technikou Praktické využití ELISA metod: Biologická léčba – inhibitory TNFα •Infliximab (Remicade) •Adalimumab (Humira) •Etanercept (Enbrel) • • Laboratorní monitorování biologické léčby •Stanovení hladin léků •Stanovení hladin protilátek proti lékům •U léčených pacientů dochází k vytvoření •protilátek proti lékům: •u léku remicade asi 40% •u léku Humira asi 18% •u léku enbrel asi 5%. Promonitor ELISA kits (Proteomika, Spain) •6 diagnostických souprav určených ke kvantitativnímu stanovení hladin léků a protilátek v séru pacienta •Nekompetitivní imunoanalýza (sendvičová), analyt je vázán mezi dvě vysoce specifické protilátky •Doba stanovení: asi 3,5 hodiny (2,5 hod. inkubace) •Vysoká specificita 100 % a senzitivita > 90% •Určeno pro max 40 stanovení (2 ředění) • Preanalytické požadavky •Vzorky: sérum (pro plazmu není diag. souprava validována) •Minimální množství: 300 µl séra •Odběr: zkumavky bez aditiv, nebo zkumavky s gelem •Stabilita po centrifugaci: 48 hod. při 2-8 °C, pro delší skladování -20 °C (nesmí se opakovaně rozmrazit) •Transport: do 48 hod. při 2-8 °C, > 48 hod. při-20 °C Analytické znaky stanovení •Detekční limit: •Remicade: 1 ng/ml, anti –remicade: 2 AU/ml •Humira: 1,25 ng/ml, anti-humira: 3,13 AU/ml •Enbrel: 3,1 ng/ml, anti-enbrel: 60 AU/ml • •Měřící rozsah: • Remicade: 2-72 ng/ml, anti –remicade: 2-144 AU/ml •Humira: 1,25-60 ng/ml, anti-humira: 3,13-200 AU/ml •Enbrel: 3,1-200 ng/ml, anti-enbrel: 60-450 AU/ml • • • • • • Počty stanovení pro 1 diag. soupravu •1 série vzorků = max 40 pacientů •2 série vzorků = max 36 pacientů •3 série vzorků = max 24 pacientů •4 série vzorků = max 16 pacientů •Každý vzorek je analyzován při 2 různých •ředěních. •Každá série zahrnuje analýzu standartních a •kontrolních vzorků v duplikátu. •Stabilita soupravy po otevření je 6 měsíců Mikrotitrační destička - 1 série vzorků • http://www.myassays.com • http://www.myassays.com • • http://www.myassays.com • http://www.myassays.com Interpretace výsledků •Hladina léků: •Negativní = lék nebyl detekován •Slabě pozitivní = sub-terapeutická hladina léku •Pozitivní = terapeutická hladina léku •Hladina protilátek: •Negativní= negativní pro protilátky proti léku •Pozitivní = pozitivní pro protilátky • Cut-off hodnoty •Remicade: ≥1,5 µg/ml (pozitivní), ≤ 0,035 µg/ml (negativní), 0,035-1,5 µg/ml (slabě pozitivní) •anti remicade: ≤ 2 AU/ml (negativní), >2 AU/ml •Humira: ≥ 0,8 µg/ml (pozitivní), ≤ 0,024 µg/ml (negativní), 0,024-0,8 µg/ml (slabě pozitivní) •anti-humira: ≤ 3,5 AU/ml (negativní),>3,5 AU/ml •Enbrel: ≤ 0,035 µg/ml (negativní), ≥ 0,035 (pozitivní) •anti-enbrel: ≤ 142 AU/ml, >142 AU/ml • Děkuji za pozornost