Mgr. Jana Gottwaldová Elektroforetické systémy pro gelovou elektroforézu na agaróze •Systémy HYDRASYS ( Sebia) •Systémy SAS (Helena) •Interlab G 26 (Interlab) SAS-3-front-right-[web] •HYDRASYS 2, HYDRASYS 2 SCAN: • 30 SPE vzorků na gel ( až 54 vzorků s kratším průběhem stopy) • kapacita přístroje: 162 SPE /hod. • •Poloautomatizované systémy: •Automatizované kroky – nanesení vzorku, migraci, inkubaci, sušení, barvení. •Manuální kroky: manipulace s gely, pipetování vzorků, antisér, reagencií…. •Pro vyhodnocení: densitometr Gelscan nebo scaner (software Phoresis) • • Helena (Anglie) •SAS -1/2 : 24 SPE vzorků na gel •SAS -3/4 : 60 SPE vzorků na gel (až 80/100 vzorků s kratším průběhem stopy) •Poloautomatizované systémy pro gelovovou •elektroforézu s odděleným barvícím modulem, 20 •programů, k nanášení vzorků speciální aplikační •hřebínky • •Pro vyhodnocení: scaner (software Platinum 4) • universal features Interlab (Italie) •Interlab G26 • 26 (39) SPE vzorků na gel • Kapacita: 117 SPE / hod. •Plně automatizovaný systém pro SPE, využívá primární zkumavky s čárovým kódem •Pro vyhodnocení: scaner (software Elfolab) Nabídka testů §nosné médium: agarózový gel –konc. 8 g/l, saturováno alkalickým pufrem (pH 8,5) §množství vzorku: 10 µl §migrace: probíhá při konst. výkonu 20W, s časem migrace asi 7 min.(napětí 240 V, teploty 20 º),sušení gelu při t=65ºC, asi 10 min., §barvení gelu: amidočerň (c= 4 g/l, t = 23 min.) §Denzitometrické skenování: při 570 nm §vzorky: sérum, zahuštěná moč • HYDRAGEL 30 β1 – β2 SAS SPE β1 – β2 (HELENA) §nosné médium: agarózový gel v tris/barbitálovém pufru §Množství vzorku: 35 µl §migrace: probíhá při napětí 100 V s časem migrace asi 23 min.( při t= 20 º), sušení gelu při t=54ºC, asi 8 min. §barvení gelu: kyselé modré barvivo (doba barvení: 57 min.) §Denzitometrické skenování: při 595 nm §vzorky: sérum, zahuštěná moč • G 26 SPE ( β1 – β2) v séru §nosné médium: agarózový gel §barvení gelu: kyselé modré barvivo §vzorky: sérum, zahuštěná moč a CSF ( CB ≥ 20g/l) • • • Parametry metod Normální hodnoty • • • • • • AKS 2/2017 AKS 2/2018 Spec. úprava vzorků před aplikací na gel §vzorky séra s konc. CB > 100 g/l,vizkózní nebo zkalené: ředění s fluidilem §vzorky séra s přítomností kryoproteinu: 37ºC,15 min. inkubace s BME §vzorky moče: zakoncentrování na U/CB 15-20 g/l - koncentrační zkumavky •VIVASPIN Sartorius Stedim: •Membrána je vyrobena z polyethylensulfonátu (PES), triacetátu celulózy (CTA) nebo ze stabilizované celulózy (Hydrostat), má cutoff hodnotu podle molekulové hmotnosti pro kterou je nepropustná.(5,10 a 30 kDa). § CB=112,5g/l mIg=25,7 g/l mIg (fluidil)=54,8 g/l CB = 123,0 g/l mIg= 34,7 g/l mIg (fluidil)= 58,9 g/l fluidil fluidil CB=89,6 g/l Inkubace s BME, 37 ºC Inkubace s BME,37 ºC UCB=1,76 g/l UCB=0,08 g/l UCB=0,22g/l UCB=0,79 g/l HYDRAGEL 2,4, 9 IFE (SEBIA) §nosné médium: agarózový gel –konc. 8 g/l, saturováno alkalickým pufrem (pH 9,1) §migrace: probíhá při konst. výkonu 20 W, s časem migrace asi 7 min.(t= 20 ºC) §imunofixace: antiséra, fixační rozrok (inkubace při 20 ºC, trvá 5 min.) §Sušení gelu při t=50ºC, asi 6 min., §barvení gelu: kyselá violeť (c= 2 g/l) §hodnocení: vizuální §vzorky: naředěné vzorky séra, zahuštěné moče §k dispozici antiséra: IgD, IgE,kappa free,lambda free • SAS -3 IFE 2,4,9 (HELENA) §nosné médium: agarózový gel v tris/barbitálovém pufru §migrace: probíhá při napětí 650 V, s časem migrace asi 6,5 min.(t= 21 ºC) §imunofixace: antiséra, fixační rozrok (inkubace při 21 ºC, trvá 10 min.) §Sušení gelu při t=54ºC, asi 8 min. §barvení gelu: kyselá violeť §hodnocení: vizuální §vzorky: naředěné vzorky séra, nativní moče (aplikace 10x), zahuštěné moče §k dispozici antiséra: IgD, IgE,kappa free,lambda free, kontrola kvality • • G26 IFE 2,4 (Interlab) •nosné médium: agarózový gel §barvení gelu: kyselá violeť, kyselá modř § hodnocení: vizuální §vzorky: naředěné vzorky séra, zahuštěné moče § • Fixace sérum - negativní Fixace moč -pozitivní Fixace sérum - negativní Fixace moč -pozitivní sérum moč Fixace IgD, IgE,λ,λfree sérum moč Fixace IgD, IgE,λ,λfree Sérum:IgM kappa, IgG lambda Moč: kappa free, lambda free Sérum:IgG kappa, IgG lambda Moč: IgG kappa, kappa free sérum moč Nemoc těžkých řetězců (heavy chain diseases) - lymfoproliferativní neoplastická onemocnění s produkcí monoklonálních těžkých řetězců Biologická léčba -interference •Daratumumab- první monoklonální protilátkou schválenou k léčbě MM byl Je to lidská IgG1κ monoklonální protilátka cílená proti CD38 znaku plazmatické buňky. Sérové koncentrace daratumumabu dosahují až 1 g/l. • Biologická léčba- interference •Imunofixační postup HYDRASHIFT (SEBIA) s použitím antidaratumumabu provedený na gelu HYDRAGEL IF 2/4 je založen na vytvoření komplexu daratumumab/antidaratumumab a jeho posunutí mimo oblast gamaglobulinů. Biologická léčba- interference Ømůže mít stejnou elektroforetickou pohyblivost jako MIg přítomný v séru pacienta, a tak může vést k arteficiálnímu nadhodnocení jeho množství. Ømůže simulovat přítomnost patologického MIg, který ve skutečnosti není přítomen, a tak falešně podhodnocovat odpověď na léčbu. HYPRAGEL 6 IF PENTA (SEBIA) §nosné médium: agarózový gel –konc. 8 g/l, saturováno alkalickým pufrem (pH 9,1) §migrace probíhá při konst. výkonu 20 W, s časem migrace asi 9 min.(při 20 ºC) §imunofixace: antiséra (pentavalentní), fixační roztok (inkubace při 20 ºC, trvá 5 min.) §Sušení gelu při t=50ºC, asi 6 min. §barvení gelu: amidočerň (c= 4 g/l) §hodnocení: vizuální §vzorky: séra, zahuštěné moče • • SAS 3 §nosné médium: agarózový gel v tris/barbitálovém pufru §migrace probíhá při napětí 650 V, s časem migrace asi 6,5 min.(při 21 ºC) §imunofixace: antiséra (pentavalentní), inkubace při 21 ºC, trvá 10 min. §sušení gelu při t=50ºC, asi 6 min. §barvení gelu: kyselá modř §hodnocení: vizuální §vzorky: séra, zahuštěné moče • SAS - IF PENTA (HELENA) •nosné médium: agarózový gel •barvení gelu: kyselá violeť §hodnocení: vizuální §vzorky: séra, zahuštěné moče • • G 26 - IF PENTA (Interlab) Gelová elektroforéza moče na agarózovém gelu v kombinaci s monoklonálními protilátkami proti vybraným proteinům (SEBIA) •Postup:Vzorek zahuštěné moče je současně podroben •elektroforéze v 9. stopách na alkalicky pufrovaném •agarózovém gelu (pH 9.1) : Ø po elektroforéze slouží jedna stopa (ELP) jako referenční pro znázornění elektroforetického uspořádání bílkovin ve vzorku. Øzbývajících osm stop je imunofixováno příslušným antisérem. Ønevysrážené, rozpustné proteiny jsou z gelu odstraněny pomocí odsávání a promývání. Ø precipitovaný komplex antigen-protilátka je zachycen v matrici gelu. Øvysrážené bílkoviny jsou vizualizovány barvením kyselou violetí, přebytečné barvivo se odstraňuje kyselým roztokem. Gelová elektroforéza moče na agarózovém gelu v kombinaci s monoklonálními protilátkami proti vybraným proteinům (SEBIA) SDS – elektroforéza moče na agarózovém gelu (SDS AGE) (SEBIA) •Používají se neutrálně pufrované SDS gely - separují močové bílkoviny podle jejich molekulové hmotnosti a zcela jasně odlišuje bílkoviny tubulární od bílkovin glomerulárního původu. •Výsledek elektroforetického dělení proteinů obarvených kyselou violetí je vizuálně porovnáván s proteinovými markery v referenční stopě. •provádí se v nezahuštěné moči, •minimální detekční hladina je 15 mg/L na frakci. SDS – elektroforéza na agarózovém gelu (SDS AGE) •V přebytku detergentu SDS jsou bílkoviny změněny v komplexy kde dochází k rozrušení nativní struktury bílkovin a zaujetí uniformní struktury o stejném negativním elektrickém náboji na jednotku hmotnosti. •Používají se gely s vysokou koncentrací – 10%, kde dochází k rozdělení močových bílkovin dle jejich molekulární hmotnosti. •Jednotlivé bílkoviny tubulárního původu (M.V. < 65 - 70 kDa) jsou jasně odlišeny od glomerulárních (M.V. > 65 - 70 kDa). SDS – elektroforéza na agarózovém (SDS AGE) nebo polyakrylamidovém gelu (SDS PAGE) • • HYDRAGEL ISO ALP (SEBIA) §nosné médium: agarózový gel –konc. 10 g/l, saturováno alkalickým pufrem (pH 9,1) §migrace: probíhá při konst. výkonu 20 W, s časem migrace asi 18 min. Séra jsou nanášeny v duplikáty, v průběhu migrace v jedné dráze procházejí zónou s aplikovaným lektinem. (kostní-frakce precipituje,zůstáva na startu) §vizualizace:pomocí specifického substrátu (t=37 º, 45 min.) §sušení gelu: při t=50ºC, asi 6 min. §hodnocení: denzitometrické při 570 nm §vzorky:séra SAS – ALP ISO (HELENA) §nosné médium: agarózový gel v tris/barbitálovém pufru §migrace: probíhá při 220 V, s časem migrace asi 13 min. §Separace izoenzymů:pomocí neuraminidázy (oddělení jaterní a kostní izoformy) , inkubace 10 min. při 15-30 ºC §vizualizace:pomocí specifického substrátu (t=37 ºC, 30 min.) §hodnocení:vizuálně, denzitometrické scanování během 2 hod. od dokončení gelu §vzorky:séra • §nosné médium: agarózový gel §Separace izoenzymů: pomocí neuraminidázy •vizualizace:pomocí specifického substrátu •hodnocení: vizuálně •vzorky:séra • G 26 – ALP ISO (Interlab) HYDRAGEL 3,6,9 CSF ISOFOCUSING (SEBIA) §metoda zahrnuje izoelektrofokusaci na agarózovém gelu – 10g/l,s následovanou immunofixací s anti-Ig G antisérem značeným enzymem (peroxidáza, 100x vyšší citlivost). §Vzorky CSF a séra od téhož pacienta jsou pak vizuálně porovnány. §Do roztoku pro přípravu gelu se přidávají 2-2.5% amfolyty. Jedná se o směs nízkomolekulárních oligoamino-oligokarboxylových kyselin, které mají rozdílné pI hodnoty. §lineární gradient pH (v rozmezí pH 3-10) s nejnižší hodnotou pH při anodě a nejvyšší při katodě. Tato souprava je určena k detekci oligoklonálních pásu. SAS – IgG IFE (HELENA) §metoda zahrnuje izoelektrofokusaci na agarózovém gelu s gradient pH v rozmezí pH 3-10. §Proteiny jsou poté přeneseny na nitrocelulózu a poté následuje immunofixace s anti-Ig G antisérem značeným enzymem (peroxidáza) §Vzorky CSF a séra od téhož pacienta jsou pak vizuálně porovnány. • 260px-Oligoklon%C3%A1ln%C3%AD_p%C3%A1sy •Základní typy : •Typ 1 – v séru i v moku pouze polyklonální IgG – normální nález; •Typ 2 – oligoklonální proužky pouze v likvoru – lokální syntéza IgG (např. u roztroušené sklerózy); •Typ 3 – oligoklonální proužky v likvoru a další oligoklonální proužky v likvoru i v séru – lokální syntéza IgG a produkce protilátek v organismu (např. chronická infekce CNS, roztroušená skleróza); •Typ 4 – identické oligoklonální proužky v séru i moku (tzv. „zrcadlový“ obraz proužků v séru a v likvoru – dochází k průniku protilátek z krve do likvoru) – systémová imunitní aktivace bez lokální syntézy IgG v CNS; •Typ 5 – identické monoklonální proužky v séru i moku v krátkém úseku pH gradientu, jde o přítomnost monoklonálního paraproteinu v likvoru sérového původu (myelom, monoklonální gamapatie) 260px-Oligoklon%C3%A1ln%C3%AD_p%C3%A1sy Imunofixace séra Imunofixace séra Typ 5 – identické monoklonální proužky v séru i likvoru v krátkém úseku pH gradientu Elektroforéza bílkovin v sekretu – průkaz likvorey (SEBIA) •průkaz přítomnosti mozkomíšního moku (likvorey) provádíme v tekutině z ucha, nosu, úst nebo z operační rány •nejčastěji se jedná o pacienty po úrazech, operacích nebo po komplikovaných infekčních zánětech centrálního nervového systému •dříve se pro detekci likvorey využívalo stanovení glukózy nebo celkové bílkoviny •mezi specifické markery elektroforetické stanovení beta 2 transferin • HYDRAGEL 6 β2 TRANSFERRIN (SEBIA) •Princip: elektroforéza s následnou imunofixací s ANTI-Transferin –PER §množství vzorku: 10 µl bez předchozí úpravy, zároveň analýza séra pacienta (kontaminace příměsí krve) §stabilita: při 2 až 8 °C 1 týden §doba analýzy: 2,5 hod. §mez detekce: 80-100 µg/l §vyhodnocení: •kvalitativní, kvantitativní • Kvantitativní hodnocení 2-sialo 0-sialo Hodnocení poměr vzorek sekretu vzorek séra hodnocení asialo/disialo -transferin > 1 analýza není požadována pozitivní asialo/disialo -transferin ≤ 1 poměr asialo/disialo –transferin ze séra ≥ poměr asialo/disialo –transferin ze vzorku sekretu negativní (znečištění plazmou) poměr asialo/disialo –transferin ze séra < poměr asialo/disialo –transferin ze vzorku sekretu pozitivní (část asialo –trasnsferinu pochází z CSF 2-sialo = 3,6 % 0-sialo = 10,5% R = 0-sialo/2-sialo = 2,9 Vzorek č.1 – sekret z ucha 2-sialo 0-sialo Poměr 0-sialo/ 2-sialo TRF v sekretu > 1- pozitivní 1 2 3 4 5 6 1- neg. kontrola – sérum 75x řeď. 2 - poz. kontrola – likvor 3 - sérum pacienta: 10 řeď. 4 - sekret pacienta: neř. 5 - sekret pacienta: řeď.1:1 6 - sekret pacienta: řeď. 1:2 4 HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBINE (SEBIA) •stanovení frakcí hemoglobinu •určen k separaci normálních hemoglobinů (A a A2) •pro detekci hlavních variantních forem hemoglobinu : S nebo D, C nebo E, •elektroforéza na agarozových gelech o pH 8.5 •10 µl hemolyzátu krve, doba analýzy 30 min. (migrace + sušení), barvení amidočerň •denzitometrické skenovaní jednotlivých hemoglobinových zón (při 570 nm) •Normalní hodnoty : Hemoglobin A ≥ 96.5 %, Hemoglobin F < 2.0 % (*), Hemoglobin A2 ≤ 3.5 % • HYDRAGEL 5/11 von WILLEBRAND MULTIMERS (SEBIA) •k detekci deficitu multimerů von Willebrandova faktoru (vWF) v lidské plazmě •Von Willebrandova choroba (vWCH) je krvácivá choroba způsobená vrozeným defektem koncentrace, struktury nebo funkce von Willebrandova faktoru (vWF) •elektroforetická separace vWF multimerů se provádí po inkubaci vzorků s detergentem, který nese vysoký náboj, po vazbě na bílkovinu vyrovnává nábojové rozdíly bílkovin, separace bílkovin v gelu jen podle rozdílné molekulové hmotnosti •po separaci proteinů probíhá imunofixace s protilátkou proti vWF, dále s protilátkou IgG, která je značena peroxidázou. Vizualizace vWF se provádí přidáním substrátu HYDRAGEL 5/11 von WILLEBRAND MULTIMERS •vzorky plazmy musí být ihned po odběru zamraženy při -70/-80 °C •Inkubace s detergentem, nanesení na gel, migrace, inkubace s antisérem, imunofixace s IgG, promývání, hydratace gelu visualizace se sustrátem….celkem 29 kroků - doba analýzy asi 7 hod. •U normálních vzorků - na gelu jsou jasně viditelné frakce multimerů vWF s LMW, IMW a HMW •U vzorků s typem 1, 2M a 2N – frakce na gelu mají normální rozložení, u typu 1 je snížena intenzita •U vzorků s typem 2A - na gelu jsou snížené nebo chybí frakce multimerů vWF s, IMW a HMW •U vzorků s typem 2B - na gelu jsou snížené nebo chybí frakce multimerů vWF s HMW •U vzorků s typem 3 - chybí všechny frakce multimerů vWF • • Kapilární elektroforéza- CAPILLARYS (SEBIA) •Plně automatizovaný systém pro kapilární elektroforézu provádí elektroforetickou separaci současně na osmi kapilárách • je schopen analyzovat 80 vzorků za hodinu • •Životnost kapiláry je 3000 vzorků/1 kapilára, tzn. 24 000 vzorků pro celý systém. • •Pro detekci se používá optický UV – VIS detektor s detekcí vlnové délky v závislosti na stanovovaných parametrech Kapilární elektroforéza- CAPILLARYS (SEBIA) •elektroforéza séra a moče •imunofixace séra a moče • glykovaný hemoglobin •variantní formy hemoglobinu •karbohydrát deficientní transferin (CDT) Elektroforéza séra CDT • Děkuji za pozornost