Obecná virologie, sérologické vyšetřovací metody, základy imunologie MUDr. Markéta Hanslianová Masarykova univerzita, Katedra laboratorních metod •Dotazy k prezentaci: • •109293@mail.muni.cz • • Viry •lat. virus – „šťáva, jed“, v lékařské terminologii „infekční činitel“ •1676- Anton van Leeuwenhoek- první pozorování baktérií vlastnoručně vyrobeným mikroskopem •1879 – 1882: první pokusný přenos virového onemocnění- Adolf Mayer (mozaiková choroba tabáku), •Dimitrij Ivanovskij- filtrace viru •Beijerinck-použit termín virus •1898: první pokusný přenos živočišného viru (virus slintavky a kulhavky) •1939: první elektronoptické snímky viru mozaikové choroby tabáku •40. léta 20. století: mohutný rozvoj virologie • 1168f03 mosaic Virus_diagram Schéma viru mozaikové choroby tabáku Elektronoptický snímek viru mozaikové choroby tabáku Mozaiková choroba tabáku Povaha virů •viry nejsou organizovány jako buňky, ale jako částice (podbuněčné organismy) •obsahují jediný typ nukleové kyseliny: buď RNA nebo DNA •nemnoží se dělením, ale syntézou svých složek •syntéza je závislá na ribosomech hostitelské buňky Stavba virionu • virion = virová částice -vnitřní část – dřeň neboli nukleoid obsahuje nukleovou kyselinu -zevní část – kapsida obsahuje bílkovinu • • nukleoid + kapsida = nukleokapsida (neobalené viry, např. pikornaviry, adenoviry) • • nukleokapsida může být uložena ve virovém obalu (obalené viry, např. herpesviry) • • 380px-Virion Neobalené viry Obalené viry 1 – kapsida, 2 – nukleoid, 3 – protomera, 4 – nukleokapsida, 5 – nukleokapsida s obalem, 6 – lipoproteinový obal, 7 - glykoproteiny Nukleová kyselina •Typ a organizace virového genomu: • ▫RNA nebo DNA ▫jednořetězcová nebo dvouřetězcová ▫segmentovaná nebo nesegmentovaná ▫lineární nebo kruhová Kapsida •sestavena z bílkovinných podjednotek neboli protomer uspořádaných symetricky -kapsida s kubickou (ikosaedrální) symetrií – tvar dvacetistěnu (např. herpesviry, adenoviry) -kapsida se spirální (helikální) symetrií – tvar válce (např. orthomyxoviry) -kapsida s komplexní symetrií – např. bičíkaté fágy, poxviry 380px-Virion Neobalené viry Obalené viry 1 – kapsida, 2 – nukleoid, 3 – protomera, 4 – nukleokapsida, 5 – nukleokapsida s obalem, 6 – lipoproteinový obal, 7 - glykoproteiny AOMCHCAMBU042CA4FBZKKCAQ0B54ACAAOL4GOCAJCU2FUCACJZ95UCABD6KQBCAXLNUWCCAX3MU8CCAMZP1B9CAMYKAVKCAPBOA SACAHUH9KNCAXQ2ONFCAEP67M8CAL6BYVXCAYVRDH4CADL1H5PCAOKDNLX f11 SU13DCAOFL3C7CAY5N50OCABEBAS6CAFAEA35CASLXH9PCA8AP0ZKCAM04BE1CA1FKLTICAQ1YSN9CAKJKDKQCA4NMIYNCA2H38 BICAHURMTUCAHNVDTRCA12PMHJCAYFFY10CAM3ABBPCAU23Y0XCA7BMOFK UDS4BCA7Z4ESZCAQ6U27MCAWYVI04CAGJX74HCASUP013CAMS0CJLCAOQG64ACA0VSXKKCA4WARS4CATMC32OCAZKQXQ1CAWI85 CCCA1BK2U2CA6B2LN0CA7N4H2TCAYLD2O2CAJUUSIPCA1NCKCOCA731KC7 VIOSGCAT9F9LOCAYIZU0JCAW1NRD6CAU2BY3PCASY3W5NCA2CONE6CA3G4RRZCACB42RNCAQXSL4UCAW3IDX2CAF67WNVCA2Y5J CQCAND9YP9CAGY3JD3CAY7CH5VCAXJ8FM9CARX6J3PCA7EKBMCCA2KVMW6 WETLTCAS5Z1P0CAUD56NDCABC28VVCADR4F9DCAASXIFYCA3HECG2CAHHPXCLCA949EF0CAGHRWERCA05OU6HCAFN3EXFCAFLOF 4DCAV3RMJJCAR6UKOGCABLBY6ACA5WAQP3CAZY7NPICACYZAF1CAL9NVVY Komplexní symetrie Kubická (ikosaedrální) symetrie Spirální (helikální) symetrie Velikost virů: 20 nm (pikornaviry) – 300 nm (poxviry) Třídění virů a)dle charakteru genomu: RNA viry, DNA viry b)dle přítomnosti obalu: neobalené viry, obalené viry c)dle symetrie kapsidy: viry s kubickou symetrií, spirální symetrií, komplexní symetrií d)dle povahy hostitele: viry bakterií (bakteriofágy), kvasinek, prvoků, rostlin, hmyzu, obratlovců e)Dle vyvolávaných syndromů (klinicko-epidemiologické rozdělení): respirační viry, neuroviry, exantematické viry… f) Reprodukce virů 1.Adsorpce (přilnutí) na vnímavou buňku •Receptory na povrchu buněk, tkáňový tropismus •Vazba na buňky, ve kterých se viry nemnoží -erytrocyty- hemaglutinace 1.Penetrace (průnik) virionu do buňky 2.Rozbalení virionu- ztráta kapsidy a virového obalu-uvolnění nukleové kyseliny Reprodukce virů 1.Replikace virového genomu- viru využije metabolismus hostitelské buňky k tvorbě virových bílkovin a NK 2.Maturace (dozrávání) virionů- organizace virových bílkovin kolem NK viru, tvorba kapsidy 3.Uvolnění nových virionů z buňky • viralreplication adsorpce penetrace replikace transkripce translace maturace uvolnění Buněčné změny při virové infekci •Cytocidní infekce- virová buňka odumírá ke konci cyklu množení viru; enteroviry (cytopatický efekt viru) •Necytocidní infekce- virová NK se množí nezávisle, ale dostatečně pomalu a nenarušuje metabolismus hostitelské buňky; herpesviry Průběh a formy virových nákaz •Vstupní brána infekce: respirační trakt, sliznice GIT, kůže a podkoží, sliznice urogenitálního traktu, spojivka •Šíření viru- z buňky do buňky, pasivní šíření krví, lymfou, mozkomíšním mokem, sekrety •Vylučování viru- viriony nebo infikované rozpadající se buňky Průběh a formy virových nákaz •infekce inaparentní (bezpříznaková) •infekce manifestní: ▫forma klinická – všechny typické příznaky ▫forma abortivní – jen některé příznaky ▫forma subklinická – nespecifické příznaky • •infekce lokální, systémová, generalizovaná •infekce akutní, chronická: •infekce perzistentní - nejsou klinické příznaky, virus lze prokázat •infekce latentní - nejsou klinické příznaky, virus nelze prokázat Diagnostika virových infekcí 1.Přímá- , mikroskopie, tkáňové kultury, průkaz antigenu, nebo nukleové kyseliny viru 2. 2.Nepřímá- průkaz protilátek Přímý průkaz viru •Mikroskopický průkaz- elektronový mikroskop • •Izolace viru na tkáňových kulturách- pěstování viru na kulturách buněk (opičí ledviny)- cytopatický efekt • Viry nelze pěstovat na běžných kultivačních • půdách! Přímý průkaz viru •Průkaz antigenu- imunofluorescence (respirační viry, herpetické viry), ELISA (HBsAg) • •Průkaz nukleové kyseliny viru- PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) •polymerázová řetězová reakce •přímý průkaz NK virů (bakterií, kvasinek, parazitů) •různé modifikace •výhody: vysoká specificita, rychlost, ATB nejsou kontraindikací vyšetření •nevýhody: vysoká cena, přístrojové vybavení, riziko kontaminace Princip PCR •opakované cykly tří jednoduchých reakcí: ▫denaturace dvojšroubovice hledané DNA na dvě izolovaná vlákna (94 °C) ▫annealing - připojení dvou krátkých syntetických nukleotidů (primery) na tato vlákna (54 – 65 °C) ▫prodlužování primerů v přítomnosti vhodných reakčních složek a enzymu Taq-polymerasy za vzniku dvou kopií hledané DNA (72 °C) P2090017 PCR – LightCycler (Roche) Serologické reakce • • Nepřímý průkaz • üprůkaz protilátek Serologické reakce •Reakce mezi antigeny a protilátkami in vitro • •Srážlivá krev, likvor, synoviální tekutina Přehled serologických metod 1.Precipitace 2.Aglutinace 3.Komplement fixační reakce (KFR) 4.Neutralizace 5.Reakce se značenými složkami: ▫ - imunofluorescence ▫ - enzymová imunoanalýza ▫ - Western blot (imunoblot) • • • Precipitace •antigen koloidní povahy •precipitační neboli vločkovací testy na lues • VDRL, RRR, RPR • • kardiolipin + protilátky v séru precipitace P5280008 vdrl2 Aglutinace •antigen korpuskulární povahy •antigen + hledaná protilátka viditelný shluk (aglutinát) •průkaz protilátek u salmonelózy (Widalova reakce), yersiniózy, listeriózy, tularémie •přímá, nepřímá (na nosičích)- antigen je navázán na povrch vhodné částice (pasivní hemaglutinace- TPHA) • Komplement fixační reakce • ükomplex antigen + hledaná protilátka ükomplement üindikátorový neboli hemolytický systém (beraní erytrocyty senzibilizované králičí protilátkou) ü ü • zábrana hemolýzy hemolýza • pozitivní reakce negativní reakce Zábrana hemolýzy, ery beze změny cf_test2 Komplement fixační reakce pozitivní negativní Neutralizační reakce •protilátka brání biologickým účinkům antigenu •ASLO – průkaz antistreptolyzinu O • • přítomnost ASLO ve vyšetřovaném séru • • zábrana hemolýzy • pozitivní reakce P2090016 Neutralizační reakce - průkaz ASLO Reakce se značenými složkami-Imunofluorescence •jedna složka značena fluorescenčním barvivem, průkaz pomocí fluorescenčního mikroskopu •přímá – průkaz antigenu: T.pallidum •nepřímá – průkaz protilátek: syfilis, anaplazmóza, HHV6 • trepon01 Nepřímá imunofluorescence - protilátky proti T.pallidum Reakce se značenými složkami-enzymová imunoanalýza •jedna složka značena enzymem, který rozloží přidaný substrát za vzniku barevného produktu •Výsledek: barevná reakce •Hodnocení: měření absorbance •ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) •průkaz antigenu: HBsAg, respirační viry, chlamydie •průkaz protilátek: univerzální použití Princip metody ELISA elisa3 Obrázek2 P2080015 ELISA – průkaz HBsAg Souprava pro vyšetření metodou ELISA Reakce se značenými složkami -Western blot • Antigen rozdělený na jednotlivé polypeptidy dle molekulové hmotnosti na nitrocelulózovém pásku 1.vazba hledaných protilátek ze séra na příslušné antigenní frakce 2.přidání protilátky značené enzymem 3.přidání substrátu 4.výsledná reakce – barevný proužek P5280005 Western blot T.pallidum IgG Interpretace serologických výsledků •průkaz protilátek svědčí pro setkání s antigenem (kdy ?), k diagnóze infekce většinou nestačí • •dynamika imunitní reakce: • • setkání s antigenem průkaz protilátek 10 dní Serologický průkaz infekce •vyšetření dvou vzorků séra: akutní na začátku onemocnění, rekonvalescentní za 10 až 14 dní •průkazný nález: čtyřnásobný vzestup titru nebo serokonverze •vzorky nutno vyšetřit zaráz ! • • titr protilátek = nejvyšší ředění, v němž ještě došlo k prokazatelné serologické reakci •IgM – první protilátky, přetrvávají týden až několik měsíců, svědčí pro čerstvou infekci •IgA – přetrvávají o něco déle, svědčí pro čerstvou nebo nedávnou infekci •IgG – nejvyšší hladina měsíc po začátku onemocnění, mohou přetrvávat roky abtime Prevence a terapie virových nákaz •antivirová chemoterapeutika – antiherpetika, antiretrovirotika, protichřipková chemoterapeutika •pasivní imunizace (podání imunoglobulinů) – antirabické sérum, profylaxe hepatitidy A a B, varicelly, cytomegalovirové infekce •aktivní imunizace (očkování) • Obrana proti infekci •nespecifická • (vrozená, přirozená) • üproti mnoha různým patogenům üjiž při narození üpůsobí okamžitě üprobíhá vždy stejně •specifická • (získaná, adaptivní) • üproti konkrétnímu patogenu üvyvíjí se postupně ünástup účinku pomalejší üpři opakovaném kontaktu výraznější Nespecifická imunita 1.Bariéry vůči usazení a průniku mikrobů: kůže, ochranné reflexy, běžná mikroflóra 2.Vnitřní mechanismy nespecifické imunity (buněčné- fagocytóza, humorální- komplement, cytokiny) 3.Horečka 4.Zánět Bariéry proti usazení a průniku mikrobů •Kůže: pro mikroby neprostupná (výjimka leptospiry, papilomaviry, larvy parazitů) •Sliznice: hlen, sliny, slzy, obměna buněk •Ochranné funkce a reflexy: kýchání, kašel, zvracení, zrychlená střevní peristaltika, mrkání •Normální mikroflóra: brání usídlení patogenních mikrobů Vnitřní mechanismy nespecifické imunity • Buněčné • üfagocyty üNK buňky üeosinofily … • Humorální • ükomplementový systém üinterferony ücytokiny, proteiny akutní fáze… Fagocyty •Pohlcování a likvidace cizorodých částic •Neutrofily (polymorfonukleáry) – proti původcům hnisavých infekcí (většina bakterií) •Makrofágy – proti intracelulárně se množícím agens (intracelulární bakterie, viry) • • Macrophage 70px-Neutrophil 70px-Monocyte monocyt makrofág neutrofil Pohlcování a zabíjení cizorodých mikroorganismů Fagocytóza •1. Chemotaxe • pohyb fagocytů směrem k místu infekce; chemotaxiny: C5a, C3a, IL-8, bakteriální oligopeptidy •2. Adherence • přichycení cizorodé látky na povrch fagocytů; fagocytární lektiny, nespecifické opsoniny (C3b), specifické opsoniny (protilátky) •3. Vlastní pohlcení • fagosom-fagolysozom •4. Nitrobuněčné ničení • enzymy, laktoferin, bazické proteiny, reaktivní kyslíkové metabolity Komplementový systém •systém bílkovin přítomných v krevním séru C1 – C9 (fragmenty a, b) •kaskádový jev – produkt jedné reakce katalyzuje další reakci •aktivace klasickou, alternativní a lektinovou drahou •Význam: chemotaxe (C5a, C3a), opsonizace (C3b), lýza buněk (membránový útočný komplex C56789) MSIM-Imunitni-system-obr17-18072007 Mechanismy nespecifické imunity •Horečka: exogenní pyrogeny (mikrobiální produkty) endogenní pyrogeny (interleukiny, makrofágový zánětlivý protein) • • • •Zánět Specifická imunita • Buněčná • üT lymfocyty • Humorální • üB lymfocyty üprotilátky T lymfocyty •kmenové buňky z kostní dřeně •T - dozrávání v thymu • ücytotoxické T buňky (Tc) – zabíjejí antigenně změněné buňky (buňky infikované viry) üpomocné T buňky (Th) – produkují cytokiny, Th1 (aktivace makrofágů, intracelulární patogeny), Th2 (aktivace B buněk, extracelulární patogeny) üsupresorové T buňky (Ts) – tlumí imunitní reakci lymphocyte B lymfocyty •B – u ptáků dozrávání ve Fabriciově burse, u savců v kostní dřeni (bone marrow) • •lymfocyty B plazmatické buňky • • • produkce protilátek(imunoglobulinů) Bly Plasmacytoid IgG Protilátky •imunoglobuliny schopné specificky se vázat na antigen •tvořeny plazmatickými buňkami (plazmocyty) •třídy imunoglobulinů: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE imunoglobuliny_01 Význam protilátek •IgG: opsonizace, neutralizace toxinů a virů, aktivace komplementu klasickou drahou, přestup přes placentu •IgM: začátek imunitní reakce, aktivace komplementu klasickou drahou •IgA: slizniční imunita •IgE: ochrana proti parazitům •IgD: receptor B buněk pro příslušný antigen Imunizace = proces vedoucí ke vzniku imunity • • přirozená • • • • umělá • immunity Imunizace přirozená aktivní – po infekci Imunizace přirozená pasivní – transplacentární Imunizace umělá aktivní – po očkování Imunizace umělá pasivní – po podání imunoglobulinu Imunizace aktivní •Vakcíny: 1.Živé oslabené (TBC) 2.Inaktivované (celobuněčné, subjednotkové, polysacharidové, anatoxiny) 3.Rekombinantní (VHB) •Dotazy k prezentaci: • •109293@mail.muni.cz • •