Intenzita osvětlení záznamového media
1. minimum
1. maximum
2. minimum
2. maximum
difrakce na kruhovém otvoru o poloměru R:
rozlišovací mez objektivu
rozlišovací schopnosti jednotlivých médií:
oko (1 úhlová minuta), negativ (100 čar/mm), CCD (velikost pixelu)
Stejné úvahy se aplikují při zachytávání dynamických dějů:
pohyb částic nemá způsobit pohybovou neostrost (proudění krve atd)
Rayleighovo kritérium rozlišení:
dva body zdroje považujeme
za rozlišitelné,
pokud vzdálenost jejich
obrazů je větší, než
poloměr Airyho stopy.
Airyhostopa
polohy minim intnezity na stínítku:
3.83, 7.02, 10.17, 13.32, 16.47…
)/( 0
2
rkRfI 
Přepočteno na úhlovou vzdálenost objektů:
 mm
414
D
k

=
první maximum obsahuje cca
80% energie prošlého světla
Aplikovaná optika II – přednáška
osvětlovací soustavy mikroskopů
žárovky: wolframové vlákno,
halogenové žárovky (wolframové vlákno + kapka jodu v baňce)
výbojky: nezanedbatelná emise v UV oblasti:
intenzivní zdroj + dobře budí fluorescenci
filtry: barevné (monochromatické)
šedé ND (regulují intenzitu světla) – může být provedeno též nezávisle
elektricky ve zdroji světla
Lieberkuhnovo zrcátko
kondenzor
úlohy: homogenizovat světlo, popříp. vyrobit rovinnou vlnoplochu,
zvýšit numerickou aperturu objektivu (a tím rozlišení mikroskopu)
umožnit pozorování metodou, vhodnou pro daný vzorek
profesionální kondenzory mívají revolverový měnič clonek
( nic - světlé pole, terčík - temné pole, disk - fázový kontrast..)
vlákna žárovek mají tvar, který je difrakcí kopírován:
místo kroužků se obraz skládá ze spirálek
v rámci eliminace tohoto jevu může být po cestě navíc matnice
0
0
0
0
min
A
C
AA
d
C

=
+
= 15.0 C
Aplikovaná optika II – přednáška
optické soustavy obsahující dva optické členy
numerická apertura: ohybový obrazec závisí na vlnové délce
jedním ze způsobů ja ktento limit omezit, je změna vlnové délky:
imerzní kapalina (vzduch má index lomu roven jedné)
Jiným způsobem je použití kondenzoru
(aplikací všech možných zlepšení se dá rozlišit až cca jedna vlnová délka )
Používané kapaliny mívají index lomu přes 1,5:
vzduch 1,0003
voda 1,33
im. olej 1,515
bromnaftalen 1,658
metylenjodid 1,740


sin
22,1
min
n
d =
Jedná se o speciálně přizpůsobené objektivy (bývají označeny proužkem)
Aplikovaná optika II – přednáška
temné pole na odraz a na průchod
HRT pracuje na principu metody temného pole
jsou-li indexy lomu vzorku a jeho okolí srovnatelné, rozdíl v kontrastu
při pozorování běžným způsobem (světlé pole) je minimální
Jednou z metod zlepšení situace je odstranění paprsků jdoucích
přímo do objektivu: není-li přítomen vzorek, pozorované pole je temné;
po vložení vzorku se na tvorbě obrazu podílejí jen rozptýlené paprsky.
Technicky je třeba vyřešit, aby ztráta světla zacloněním přímé cesty
nebyla zbytečně velká (tedy přeorganizovat chod paprsků)
Ještě komplikovanější schéma má temné pole na odraz…
Na konstrukci obrazu se podílejí téměř všechny paprsky, při pozorování bez vzorku vidíme světlé pole:
podle směru, odkud na vzorek světlo pomocného osvětlení dopadá,
označujeme světlé pole na odraz/průchod
Aplikovaná optika II – přednáška
fázový kontrast (Zernike 1930, Nobelova cena 1953)
objekty, které mají jen rozdílné indexy lomu ns od prostředí nm, nemusí být dobře viditelné
ve světlém poli:
proměnný index lomu způsobuje rozptyl, změnu úhlu odrazu ale také změnu rychlosti
takové vzorky tedy puchod světlo zpomalí, nebo zrychlí: dochází k fázovému posunu
úkolem zobrazovacího zařízení je změny fáze přeměnit na změny intenzity
průhledné a bezbarvé vzorky je možné obarvit, ale buňky většinou hynou
)(
2
0
ms nnd −=



Aplikovaná optika II – přednáška
fázový kontrast (Zernike 1930, Nobelova cena 1953)
teoreticky pro každou propustnost vzorku by bylo třeba volit jiné parametry:
v praxi se volí parametry pro nepohlující vzorky
fázový posuv je razantně ovlivněn při použití dvou různých vlnových délek:
musí se používat monochromatický filtr (zpravidla žlutozelený 540 nm – kvůli citlivosti oka)
Nevýhoda metody: hrany mají složité stíny – halo při velkých změnách indexu lomu (např. na hranici vzorku)
Vhodného účinku se dosahuje omeznením vstupního svazku světla
způsobem, který oddělí záření prošlé vzorkem od jasu pozadí:
clona v kondenzoru + fázová destička
Přidáním čtvrtvlnné destičky dochází k destruktivní interferenci jasu pozadí
dalšího zvýšení kontrastu lze dosáhnout aplikací absorpční vrstvy
Aplikovaná optika II – přednáška
DIC (diferenciální interferenční kontrast)
wollastonův hranol
obvykle krystal kalcitu CaCO3,
slepený kanadským balzámem (n=1,55)
Nevýhoda: rozbíhavé svazky nutí používat v kondenzoru šterbinu: rapidně klesá osvětlení
Dvojlomný materiál vytváří řádný a mimořádný paprsek,
které díky tvaru hranolu vystupují rozbíhavé a se stejným fázovým posunem
Vylepšení metody fázového kontrastu: odstranění halo
Používá se u vzorků, které způsobují fázový rozdíl oproti pozadí cca čtvrt vlny
Vzorek je v každém bodě osvětlován jakoby dvěma zdroji, posunutými přibližně 0,2 μm od sebe.
Za objektivem se tak vlastně šíří dva obrazy světlého pole, o kousek posunuté, ovšem s fázovou informací
(uvnitř vzorku světlo neinterferuje kvůli kolmým polarizacím)
Druhý Wollastonův hranol kažtdé dva svazky opět slučuje
Interferuje světlo prošlé vzorkem a okolním prostředím: kontrast je způsoben fázovým rozdílem
Konkrétních provedení je mnoho: Nomarského kontrast, de Senarmont, DIC v odraženém světle
Podobně jako u fázového kontrastu, vzniká dojem 3D vzorku, zde jakoby šikmým osvícením vzorku
Aplikovaná optika II – přednáškaPrincip vzniku pseudo 3D obrazu:
Efekt bočního osvětlení, „směr“ závisí na orientaci hranolů
Diferenciální konktrast lze skutečně simulovat excentrováním kondenzoru:
vznikající efekt šikmého osvětlění ovšem místo fázového posunu
kombinuje intensity prošlých svazků:
rozlišovací schopnost a kontrast jsou velmi nízké .
Slabě světlo pohlcující vzorek
Za prvním hranolem vzikají dva prostorově oddělené paprsky
Rozdíl fází obou paprsků je ovšem nezanedbatelný
Po rekombinaci dochází ke konstruktivní nebo
destruktivní interferenci
Aplikovaná optika II – přednáška
Nomarského kontrast
Nomarského hranol:
Vylepšený Wollastonův hranol: světlo se blízko za koncem hranolu kříží
(clona kondenzoru se může stáhnout)
nevýhoda: obraz je pouze pseudo 3D;
¨
i zde je potřeba rozvažovat hodnocení
největší počet optických členů: nejvyšší cena
Polarizátor a analyzátor používají ve zkřížené poloze
Justace zařízení komplikovaná, zahrnuje Kohlerovo osvětlení před
vložením hranolů
Konkrétní rozměry hranolu se musí přizpůsobit použitému objektivu
Aplikovaná optika II – přednáška
nomarského hranol