2.6.1 Biologické účinky ionizujícího záření
Biologické účinky ionizujícího záření jsou důležitým rizikovým faktorem diagnostických
metod pracujících s tímto zářením a základem pro vysvětlení a pochopení radioterapie.
Zdravotnický pracovník by měl být schopen též vyhodnotit rizika, která souvisí s přirozenou i
umělou radioaktivitou v našem životním prostředí. Musí být teoreticky připraven i na možnost
jakéhokoliv zneužití jaderných technologií či velké jaderné havárie.
Biologické působení ionizujícího záření se odvíjí od účinků tohoto záření na molekulární
úrovni. Jeho působení na biologicky významné molekuly, zejména DNA, je esencí prakticky
všech biologických efektů tohoto záření. Čtenář této kapitoly by si měl uvědomit, že jde o
problematiku neobyčejně složitou, která může být experimentálně zkoumána jen na modelech
dosti vzdálených našemu organismu. Klinické experimenty na lidech jsou prakticky vyloučeny,
musíme se spolehnout na náhodná pozorování, studium vedlejších účinků radioterapie nebo
epidemiologické studie, které se snaží vyhodnotit účinky malých dávek ionizujícího záření na
velkých populačních vzorcích.
Plný rozsah této kapitoly je k studentům (radiologickým asistentům a dalším zájemcům)
k dispozici v elektronické podobě.
2.6.1.1 Vybrané poznatky radiochemie
Již z řady jevů popsaných v učebnici v kap. 1.1.4. je jasné, že většina energie primárního i
rozptýleného, tj. sekundárního záření je nesena elektrony, které předávají svou energii
prostředí. Platí to i pro záření rentgenové a gama, s nímž se setkáváme nejčastěji.
Vysokoenergetické elektrony totiž vznikají např. při fotoelektrickém jevu nebo při Comptonově
rozptylu. Interakce těchto elektronů s molekulami prostředí vede k jejich chemickým změnám.
Pro nás podstatným prostředím je voda. První ionizační potenciál vody je 12,6 eV. Toto
množství energie postačuje pro „utržení“ elektronu z molekuly vody. Pro srovnání, elektrony o
energii 20 000 eV ztrácejí při interakci s vodou s největší pravděpodobností kvantum energie
22 eV (průměrná velikost ztráty je ovšem 60 eV - viz obr. 2.6.1.1a). Některé tyto elektrony však
přicházejí o svou energii postupně, vyrážením dalších, tj. terciárních elektronů, které mají
energii od jednotek do tisíců eV. Teprve tyto elektrony skutečně ve velké míře ionizují
molekuly vody.
Obr 2.6.1.1a. Ztráty energie elektronů (20 keV) při ionizačních událostech.
Výsledkem předání energie elektronu molekule vody může být ionizace, nebo jen excitace. V
obou těchto případech je důsledkem nestabilita molekul vody, která může vést ke změnám
jejich struktury (tvorba iontů, radikálů) a následným mezimolekulovým interakcím.
Jednotlivé nejmenší skupiny ionizačních událostí vyvolané terciárními elektrony ve vodě, jsou
od sebe vzdáleny průměrně 400 nm při vlastní velikosti ionizované skupiny molekul kolem 1
nm. Vodíkový radikál je schopen ve vodě difundovat do vzdálenosti průměrně 180 nm, dokud
nezanikne. Proto je interakce (rekombinace) volných radikálů vytvářených v různých místech
ionizačními událostmi prakticky nemožná.
Primární produkty radiolýzy vody objevující se po interakci s částicí záření v čase od 10-16
do 10-12
s:
• Excitovaná molekula vody H2O*
• Radikály H∙ a OH∙ (důsledek disociace excitované molekuly)
• H20+
a e(důsledek
přímé ionizace nárazem)
Okamžitě navazují tyto chemické reakce:
• H2O+
→ H+
+ OH∙
• e+
H2O → H2O•
e+
H+
→ H∙
• e+
nH20 → eaq
(solvatovaný či hydratovaný elektron, doba života asi 0,2 ms)
• H2O→
H∙ + OHProdukty
radiolýzy vody tedy jsou: H∙, OH∙, eaq,
H+
, OH.
Ionty H+
a OHvšak
nemají z
hlediska působení na živou hmotu valný význam, protože jsou ve vodě všudypřítomné. Část
volných radikálů i iontů rekombinuje (vznikají původní molekuly), ale následují i další
chemické reakce, takže souhrnná rovnice radiolýzy vody vypadá takto:
H2O (ozářená) → H∙, eaq,
OH∙, H30+
, H2, OH,
HO2∙, O2, O2
,
HO2
,
H2O2
Všechny takto vznikající chemické entity mají určitý chemický výtěžek G, který je definovaný jako počet molekul
vytvořených nebo rozpadlých v důsledku předání 100 eV energie sekundárního elektronu. Pro lepší představu
uvádíme vybrané hodnoty G zjištěné ve vodě pro běžné rentgenové záření při neutrálním pH: H∙ – 0,6, eaq
– 2,6,
OH∙ – 2,6, H2 – 0,45, H2O2 – 0,75.
Jsou-li místo molekul vody zasahovány přímo biologicky významné molekuly, zejména DNA,
hovoříme o přímém účinku.
Na základě úvah o pravděpodobnosti zásahů terčových molekul, je počet nepoškozených molekul E po působení
dávky D dán výrazem:
kde E0 je původní počet molekul a k je tzv. inaktivační konstanta s jednotkou Gy-1
, jejíž převrácená hodnota
udává dávku (D = 1/k), která sníží počet nepoškozených molekul faktorem 1/e, tj. na 37% původní hodnoty
(zdůvodnění: jestliže je D = 1/k, pak musí platit, že E = E0.e-1
čili E = E0/e). Tato dávka se označuje též D0 nebo
D37. Tyto úvahy platí, pokud biomolekulu inaktivuje již jediný zásah.
Nepřímý účinek je poškození terčové biomolekuly zprostředkované radikálovými produkty
radiolýzy vody. Rychlost tohoto procesu je dána difuzí radikálů k biomolekulám. Bylo
prokázáno, že největší význam má pro poškození biomolekul radikál OH∙.
To, že nastala interakce s biomolekulou (mechanismem přímého či nepřímého účinku), ještě
neznamená, že muselo dojít k jejímu poškození – existují tři způsoby obnovy stavu molekul
před ozářením: rekombinace, restituce a (enzymatická) oprava.
,.0
kD
eEE −
=
Rekombinace může nastat vlastně jen velmi krátce po interakční události – s ohledem na
rychlost difuze je tento čas kratší než 10-11
s. Rekombinace je prostým znovuspojením
iontového nebo radikálového páru.
Restituce je chemická (neenzymová) obnova původní molekuly. Dochází k ní v časech kratších
než 1 ms. Příkladem takového procesu je reakce radikálu neseného molekulou DNA s
molekulou obsahující sulfanylovou (sulhydrylovou či thiolovou) skupinu:
DNA∙ + RSH → RS∙ + DNA (s obnoveným H)
Opravy jsou enzymatické a vyžadují podstatně delší čas.
Hlavní terčovou biomolekulou je DNA, ať se jedná o účinek přímý nebo nepřímý. Ostatní
biogenní makromolekuly (bílkoviny, RNA) mohou být poměrně snadno nahrazeny. Důkazem
je korelace existence dvouvláknových zlomů DNA (viz dále) se ztrátou biologické aktivity.
Buňky neschopné oprav DNA nebo se zablokovanými opravami DNA jsou mnohem citlivější
na působení ionizujícího záření.
Není jisté, které z následujících radikálových reakcí jsou nejdůležitější pro nepřímé poškození DNA, kterou zde
zastupuje písmeno R, ale uplatňují se zřejmě všechny.
1. Vytržení vodíkového atomu
R-H + H∙ → R∙ + H2
R-H + OH∙ → R∙ + H2O
2. Disociační reakce
R-NH3
+
+ eaq
→ R∙ + NH3
R-NH2 + H∙ → R∙ + NH3
3. Adiční reakce
R-CH=CH-R + OH∙ → R-CHOH-CH∙-R
4. Fixace poškození (radikálu biomolekuly) vazbou kyslíku
R∙ + O2 → R∙-peroxid
Peroxidový radikál je dosti stabilní, nepodléhá restituci, ale není to ještě finální chemický produkt.
Konkrétně u DNA nastávají interakce s OH∙, H∙ a eaq,
přičemž nejdůležitější je interakce s
hydroxylem: Funkční skupiny na bázích a cukrech mohou být změněny a chybný nukleotid se
pak může špatně párovat. Poškození bází může být tak silné, že dochází k jejich ztrátám,
vznikají místa bez purinů nebo pirimidinů. Přesun radikálu (přesněji nesdíleného elektronu) z
báze na cukr-fosfátovou páteř může vést ke ztrátě báze. Vznikají i jednovláknové a
dvouvláknové zlomy. V experimentech s viry se zjistilo, že hydroxylový radikál nejčastěji
napadá vodík deoxyribózy v poloze 4. Odnímá jej cukrovému zbytku za vzniku vody.
Látky se sulfanylovými skupinami vznik radikálů na DNA tlumí (mechanismem restituce),
přítomnost kyslíku je naopak stabilizuje.
Zlomy dvoušroubovic DNA, jsou jednovláknové a dvouvláknové. Jednovláknový zlom –
single-strand break (SSB) – je snadno reparovatelný, v radiačním poškození buněk hraje proto
jen malou roli. Dvouvláknový zlom – double-strand break (DSB) – má reparaci obtížnou,
protože pro ni chybí templát (předloha). Časté jsou chyby projevující se mutacemi. Tento typ
zlomu vzniká třemi mechanismy, které mají různou pravděpodobnost, ovlivňovanou i druhem
působícího záření:
a) Jeden zásah DNA vede k přímému vzniku DSB v komplementárních místech řetězce.
b) Jeden zásah DNA může vést k tzv. kooperativnímu vzniku DSB v blízkých místech obou
řetězců.
c) Dva nezávislé zásahy komplementárních řetězců v místech vzdálených od sebe max. 10
bází. Při větší vzdálenosti udrží dvoušroubovici vcelku vodíkové i jiné vazby.
Jednovláknové i dvouvláknové zlomy mohou vzniknout i v důsledku nepřímého účinku, tj.
působení volných radikálů. Odhaduje se, že počet DSB v jedné buňce je 15-60 při ozářením
dávkou 1 Gy, zatímco počet SSB je více než 1000 na 1 Gy. Poškození DNA však působením
SSB vzniká jen v minimální míře.
Poškození DNA ionizujícím zářením tedy vede ke vzniku DSB a SSB v dvoušroubovici, chemickým změnám bazí
i cukrových zbytků. Mohou vzniknout spojky (cross-links) mezi bílkovinnou matrix a DNA nebo mezi různými
molekulami DNA. Tato poškození jsou opravována několika různými způsoby, jejichž detailní popis je předmětem
zájmu molekulární biologie. Stačí vědět, že excizní oprava je typická pro jednovláknové zlomy v nereplikujících
se molekulách DNA. Templát (předloha) komplementárního vlákna musí být k dispozici. Dochází k odbourání
dalších bází z okolí zlomu a pak se od 3‘-hydroxylového konce přerušeného vlákna doplňuje chybějící sekvence
(působením enzymu DNA-polymerázy I). Podobně se opravují poškozené báze nebo cukrové zbytky.
Opravy dvouvláknových zlomů patří mezi opravy náchylné k chybám. Klíčovou roli u nich hraje bílkovina recA
(mutace genu pro recA podstatně zvyšuje citlivost k radiačnímu poškození). Prokázáno to bylo u bakterií a
podobný mechanismus se projevuje i u savčích buněk. Pro částečnou rekonstrukci místa s DSB je využito
homologního duplexu párového chromosomu (u diploidní buňky). Rekombinační oprava začíná odbouráním
jednoho vlákna duplexu exonukleázou na obou fragmentech. Bílkovina recA se váže k obnaženým
„jednovláknům“ a iniciuje výměnu vláken s homologním duplexem, čímž vznikají dvě blízká rekombinační místa.
Další postup procesu vidíme na Obr. 2.6.1.1b.
Obr. 2.6.1.1b Rekombinační oprava DSB. A – dvouvláknový zlom, B – částečné odbourání jednoho z
vláken v okolí zlomu a asociace s homologní dvoušroubovicí, C – vlivem recA nastává rekombinace
poškozených a nepoškozených úseků, D – syntéza komplementárních řetězců (vláken) DNA
polymerázou, E – opravené dvoušroubovice
Excizní opravy SSB jsou považovány za téměř bezchybné. Pravděpodobnost chyb je vyjadřována poměrem 1 :
107
až 1 : 1011
. Pravděpodobnost bezchybného spojení DSB je odhadována na jen asi 75% a dochází k němu
zejména během prvních dvou hodin po poškození.
2.6.1.2 Základy buněčné radiobiologie
2.6.1.2.1 Křivky přežití
Klíčovým pojmem buněčné radiobiologie je přežití buněk. Teorie a modely přežití buněk
vycházejí především z rozboru závislostí přežití buněk na dávce záření, tj. tzv. křivek přežití.
Experimenty byly prováděny s buňkami in vitro, zpočátku mikroorganismy, a teprve od
padesátých let 20. století i s buňkami tkáňových kultur, které mohou být i buňkami nádorovými
nebo z nádorů odvozenými. Teorie a modely přežití buněk mají velký význam zejména pro
pochopení radioterapeutických zásad a postupů, včetně pochopení nežádoucích pozdních
následků ozáření.
Klonogenní (též reprodukční) přežití buňky je stav, kdy je buňka schopna dalšího
rozmnožování, například vytvoření kolonie na Petriho misce. Nejde tedy jen o přežití jednotlivé
buňky, nýbrž o zachování schopnosti reprodukce (za rozhodující kriterium je považována
schopnost buňky vytvořit 50 potomků). V opačném případě hovoříme o reprodukční smrti. K
usmrcení buňky ve smyslu jejího rychlého zániku by bylo nutno aplikovat dávky o několik řádů
vyšší, než postačuje k její reprodukční smrti.
Klonogenní přežití je však obtížně definovatelné u buněk diferencovaných tkání, které mají jen
malou mitotickou aktivitu a nemohou se dělit neomezeně. U těchto tkání musely být vyvinuty
jiné metody hodnocení radiosenzitivity.
Již v polovině 20. století byly navrženy teoretické modely vysvětlující více či méně úspěšně
tvar křivek přežití – obr. 2.6.1.2.1a a 2.6.1.2.1b. Teorie vycházela z toho, že uvnitř buňky
existuje určitý malý fyzikálně popsatelný prostor představující terč pro účinek ionizujícího
záření. Brzy byl tento terč ztotožněn s DNA. Předpokládejme, že v jedné buňce může existovat
více (předem neznámý počet) terčů a inaktivace n z nich vede ke ztrátě reprodukční schopnosti.
Veškeré zásahy terčů jsou náhodným (stochastickým) procesem, takže pravděpodobnost
zásahu jednoho místa neovlivňuje pravděpodobnost zásahu jiného místa. (Hovoříme o
nezávislých pravděpodobnostech zásahů).
Rozlišujeme jednoduché exponenciální křivky bez raménka a s raménkem.
Obr. 2.6.1.2.1a. Křivky bez raménka jsou typické pro haploidní buňky a prokaryota. Tento tvar
napovídá, že za biologický efekt odpovídají jednotlivé jednoduché události. Přežití S je podíl počtu
buněk přeživších určitou dávku a počtu buněk přeživších dávku nulovou.
Obr. 2.6.1.2.1b. Křivky s raménkem jsou typické pro diplodní buňky. Jejich tvar napovídá, že pro pokles
reprodukční schopnosti je nutná akumulace poškození. Existuje (teoreticky) určitá minimální dávka,
která musí být překročena, aby takovýto pokles nastal. S je definováno stejně jako v předchozím
obrázku.
Přiblížíme si nejjednodušší přístup k vysvětlení křivek na obrázcích. Předpokládejme, že
populace buněk je vystavena záření o nízkém LET, takže se ionizační události vzájemně
neovlivňují, jejich pravděpodobnost je malá v malém terčovém objemu. Předpokládejme též,
že buňka obsahuje terčový objem nebo objemy o velikosti v. Jako aktivní označíme takovou
událost, která může, ale nemusí vést k biologickému poškození. Tím vyloučíme události
završené např. rekombinací iontů nebo radikálů a chemickou restitucí (poškození biologické
funkce pak nemůže nastat). Aktivní události registrované v objemu v se nazývají zásahy. Jako
V označíme celkový buněčný objem ozářené populace. Bude to součin průměrného objemu
buňky a jejich počtu. Jako D označíme hustotu aktivních událostí – počet událostí (zásahů) v
jednotkovém objemu. D je úměrné dávce a jako dávku budeme tuto veličinu, hustotu událostí,
zatím označovat.
Je nutno si uvědomit, že i při velmi malých dávkách je počet aktivních událostí (v podstatě
jednotlivých excitací a ionizací) velký. Odpovídá-li aktivní události např. 60 eV přenesených
ze sekundárního elektronu, pak pro dávku 10 mGy vychází 4000 událostí v buňce o průměru
20 m.
Pravděpodobnost toho, že bude zaznamenána aktivní událost kdekoliv v ozářené populaci, je
dána poměrem terčového a celkového objemu v/V. Vyplývá to z toho, že z celkového počtu
událostí D =V.D (tj. hustoty událostí – zásahů - násobené celkovým objemem) v.D událostí je
zaznamenáno v citlivém objemu. Poměr těchto výrazů je roven v/V. Tento poměr je číslem,
které nazveme pravděpodobností zásahu r. Jde zpravidla o malé číslo.
Na základě teorie pravděpodobnosti lze formulovat tzv. všeobecnou rovnici přežití. Nelze
zacházet do matematických podrobností, proto tvar této rovnice uvedeme pouze pro tzv.
jednozásahový inaktivační model, který vede ke křivce přežití bez raménka. Buňka nepřežije
ani jediný zásah terče. Výše definované přežití buňky S je pak dáno výrazem:
D0 je převrácená hodnota inaktivačního koeficientu (D0 = 1/k) a dosazením do rovnice se lze
přesvědčit, že je to letální dávka potřebná pro zredukování frakce přeživších buněk na hodnotu
1/e, tj. 37% z hodnoty původní. Při této dávce (D = D0) je průměrný počet terčů zasažených v
buňce roven 1. Všimněme si, že po zlogaritmování posledně uvedeného výrazu dostaneme:
ln S = -kD,
což je samozřejmě analytické vyjádření přímky, tedy křivky bez raménka!
Matematicky mnohem složitější vyjádření mají modely, které počítají s nutností více než
jednoho inaktivačního zásahu buňky. Při jistých omezeních však všechny tyto matematické
přístupy vedou k vyjádření přežití buněk ve tvaru:
( )2
DDp
eS  +−
= , tj. po zlogaritmování lnS = -p(D + D2
),
kde p,  a  jsou specifické konstanty. Protože dávka záření vystupuje v posledním vztahu
v první i druhé mocnině, bývá tento výsledek označován jako lineárně kvadratický model
závislosti biologického účinku záření na dávce. Má širší význam, než je pouhé vysvětlení tvaru
křivky přežití, jak ještě ukážeme. Konstanta p bývá někdy zahrnována do koeficientů  a .
Posledně uvedená rovnice bývá někdy zapisována i v tzv. linearizované formě, kdy
vyjadřujeme výraz lnS/D v závislosti na dávce (parametry  a  lze nyní snadno graficky určit
z experimentálně zjištěné závislosti):
Lineárně kvadratický model (LQ model) plně vyhovuje pro popis experimentálních výsledků
pokud je frakce přeživších buněk větší než jedna tisícina. LQ model se plně osvědčil např. i
jako východisko pro plánování frakcionované terapie.
)(0/ kDDD
eeS −−
==
( )Dp
D
S
 +−=
ln
2.6.1.2.2 Radiosensitivita a radioresistence
Veškeré látky a faktory, o nichž je známo, že modifikují účinky ionizujícího záření, působí v
rámci chemické fáze interakce, tj. nemohou ovlivnit primární fyzikální interakci – přímé
zásahy DNA vedoucí ke zlomům atd. Nepřítomnost vody a snížená teplota zvyšují
radioresistenci.
Zvláštní postavení mezi látkami, které modifikují účinky záření, má voda, protože je v živé hmotě téměř
všudypřítomná. Určitý praktický význam mají úvahy o radiosensitivujícím účinku vody v případě působení na
biologicky významné molekuly v suchém stavu. Jedině za přítomnosti vody mohou vznikat nebezpečné produkty
radiolýzy vody. Veškeré radiační poškození biologických molekul nebo i buněk v dehydrovaném stavu je nutno
přisoudit přímému účinku, tj. zejména zásahům DNA, a to vysokoenergetickými elektrony.
Zabývat se musíme i vlivem teploty. Poškození molekuly, které pochází z přímé ionizace citlivého místa a vede
k nevratné destrukci biologických vlastností molekuly, je relativně málo citlivé na teplotu. Předávaná množství
energie jsou totiž podstatně vyšší než aktivační energie potřebné pro rozbití vazeb. V případě, že poškození pochází
spíše z excitace, je vliv teploty výraznější. S ohledem na nízké aktivační energie produktů radiolýzy vody je však
závislost účinků na teplotě za přítomnosti vody jen slabá.
Zdaleka nejvýznamnějším faktorem ovlivňujícím citlivost buněk a tkání k ionizujícímu záření
je koncentrace kyslíku. Hovoříme o kyslíkovém efektu.
Již v počátcích radiační biologie bylo zjištěno, že přítomnost kyslíku silně ovlivňuje schopnost
záření vyvolat poškození živé hmoty. Zvýšená pozornost je však těmto efektům věnována až
od 50. let 20. století, kdy si radiační biologové uvědomili význam kyslíkového efektu pro
odpověď nádoru na ozáření. V principu jde o to, že nedostatek kyslíku, tzv. anoxické
podmínky, pomáhá přežívat části nádorových buněk po ozáření.
Studium vlivu kyslíku nelze oddělit od studia vlivu některých jiných endogenních i exogenních látek. Tzv.
konkurenční model interakce senzibilizátorů a ochranných látek zahrnuje:
a) Primární tvorbu radikálů organických molekul jako výsledek přímého nebo nepřímého účinku:
RH → RH∙+
+ e→
R∙ + H+
+ e(přímý
účinek)
RH + OH∙ → R∙ + H2O (nepřímý účinek)
b) Chemická oprava thioly:
R∙ + R-SH → RH + R-S∙
c) Konkurenční reakce s kyslíkem, která fixuje radikál na biomolekule a pravděpodobně vede k biochemicky
neopravitelnému poškození. Je klíčová z hlediska senzitivujícího účinku kyslíku:
R∙ + O2 → RO2∙ (poškození fixované kyslíkem)
d) Řada elektronegativních látek může imitovat svými reakcemi přítomnost kyslíku (reakční produkt ovšem
nemusí být stejný jako při reakci s kyslíkem). Tyto senzitizéry mají praktický význam a bude o nich podrobněji
pojednáno dále. Příklad reakce tohoto druhu:
R∙ + X (senzitizér) + H2O → ROH + X∙
+ H+
e) Předchozím reakcím konkuruje vychytávání „vodních“ volných radikálů sloučeninami s –SH skupinami. Volný
kyslík ovšem reaguje s těmito thioly a tím snižuje jejich hladiny a ochranné účinky.
Účinek kyslíku lze popsat jako účinek modifikující dávku – poměr podílů přeživších buněk za přítomnosti a
nepřítomnosti kyslíku pro určitou dávku zůstává stejný i při odlišných dávkách. Stejně tak je konstantní poměr
absorbovaných dávek za přítomnosti a nepřítomnosti kyslíku, které vedou ke stejnému stupni přežití S. Konstantní
hodnoty obou poměrů jsou zřejmé z obrázku 2.6.1.2.2a. Druhý z uvedených poměrů je označován jako oxygen
enhancement ratio – OER:
SdanýproOvdávka
SdanýproNvdávka
OER
2
2
=
Obr. 2.6.1.2.2a
Kyslíkový efekt je všudypřítomný a uplatňuje se téměř všeobecně. Tvar křivky přežití se účinkem kyslíku většinou
nemění, mění se jen její strmost. Slaběji se projevuje u záření o vysokém LET. Ze závislosti přežití buněk na
parciálním tlaku kyslíku vyplynulo, že kyslíkový efekt je prahový jev. Při velmi nízkých koncentracích kyslíku
(setiny %) se ještě neprojevuje, ale maximální zcitlivění nastává již při koncentracích 2 – 3 %. Další zvyšování
koncentrace kyslíku má jen malý význam.
Klinický význam: Za příčinu radioresistence rychle rostoucích nádorů bylo vždy považováno
jejich nedostatečné cévní zásobení a z toho plynoucí ochrana nedostatkem kyslíku. Pokusy se
zvýšením účinnosti terapie lepší saturací nádoru kyslíkem však tuto tezi nepotvrdily jako
univerzálně platnou.
2.6.1.2.3 Radioprotektivní účinek thiolů
Endogenní nebo exogenní thioly slouží jako lapače volných radikálů a mohou odstranit radiační
poškození podle reakce:
R∙ + R-SH → RH + R-S∙
Thiolové radikály pak mohou reagovat vzájemně:
R-S∙ + R-S∙ → R-S-S-R
Thioly přítomné v buňce ovšem též reagují s kyslíkem (čili jsou inaktivovány) nezávisle na
přítomnosti radiolytických produktů. Roli aktivních thiolů nemohou hrát –SH skupiny bílkovin,
musí se jednat o malé molekuly. Významný je tripeptid glutathion, tvořený sekvencí glutamová
kyselina-glycin-cystein. Jeho redukovanou (aktivní) formu označíme jako GSH. Podobně se
uplatňují též cystein a cysteamin. Vzhledem k dosti nízkým nitrobuněčným koncentracím
těchto thiolů a též velké reakční rychlosti kyslíku s volnými radikály biologicky významných
látek, je význam endogenních thiolů pro opravu radiačního poškození omezený.
Prokazatelný význam mají exogenní thioly dodávané organismu v nadbytku. Zvýšená intracelulární koncentrace
thiolů jinak přirozeně se v buňkách vyskytujících má prokazatelný ochranný účinek – až 2x zvyšuje letální dávku,
zřejmě působením proti kyslíkovému efektu. Thioly reparují poškození a působí jako lapače volných radikálů.
Druhý mechanismus je patrně významnější. Reagují
a) s hydroxylovým radikálem:
RSH + OH∙ → RS∙ + H2O nebo RS+
OH∙ → RS∙ + OHb)
s vodíkovým radikálem:
RSH + H∙ → RS∙ + H2 nebo RSH + H∙ → R∙ + H2S
c) se solvatovaným elektronem:
RSH + eaq
→ R∙ + SHnebo
RSH + eaq
→ RS + H∙
Radioprotekce pomocí thiolů je v praxi omezena jednak jejich toxicitou a také potřebou jejich podání minimálně
minuty až desítky minut před ozářením. Toto může mít určitý význam v radioterapii a snad ve vojenství. Faktor
snížení účinku dosahuje u některých syntetických thiolů až hodnot kolem 3. Takovým thiolem je např. látka
označovaná jako WR2721. Její nevýhodou je nerovnoměrná distribuce ve tkáních, zejména nízká koncentrace a
tím i ochrana v mozku (což je pozitivní z hlediska ozařování mozkových nádorů!).
2.6.1.2.4 Sensitizéry na bázi aromatických nitrosloučenin a substituovaných pirimidinů
Vývoj sensitizérů na bázi aromatických nitrosloučenin byl motivován snahou o zvýšení účinnosti radioterapie.
Vesměs se jedná o elektrofilní činidla, která mohou v anoxických nádorech nahradit chybějící kyslík při fixaci
radiačního poškození nebo likvidaci thiolů, i když musí mít k témuž efektu podstatně vyšší koncentraci než kyslík.
V kyslíkem dobře zásobených tkáních se jako senzitizéry neprojevují. Problémem těchto látek je obecně jejich
toxicita. Jako první vzbudil pozornost 2-methyl-5-nitroimidazol-1-ethanol (metronidazol, má význačné účinky
proti některým infekcím), následoval 5-nitro-2-furalalsemikarbazon (nitrofurazon, baktericidní látka používaná na
rány).
5-halogen substituované pyrimidiny jsou skupinou látek, které senzitivují odlišně a nezávisle na kyslíkovém
efektu. Základním pyrimidinem je uracil. Uracil substituovaný halogenem v poloze 5 je inkorporován do DNA
místo thymidinu, musí tedy být k dispozici v době replikace buněk. Senzitivující účinek 5-bromouracilu, resp. 5bromodeoxyuridinu
je vysvětlován citlivostí atomu bromu k radiolytickému štěpení – bromový radikál se odštěpí
a v původní pozici bromu vzniká také volný radikál. K podobnému výsledku vede i reakce 5-bromouracilu se
solvatovaným elektronem a nelze vyloučit ani další nepřímé mechanismy.
2.6.1.2.5 Genetické efekty ionizujícího záření
Rozlišujeme genetické a somatické mutace. V obou případech jde o stochastické (náhodné)
poškození buňky, takže buňky si zachovávají schopnost dělit se. Vznik rakoviny je jednou z
významných tříd somatických mutací.
Téměř vždy platí, že závažnost změny fenotypu nezávisí na dávce záření.
Můžeme rozlišit dva hlavní typy genetických změn: (1) Změny struktury a počtu chromozomů
pozorovatelné v metafázi (mutace chromozómové a genomové). (2) Genetické změny, které se
neprojevují na struktuře chromozomů (genové, bodové mutace).
Nejprve se budeme zabývat prvním typem, především chromozómovými zlomy. Rozlišujeme zlomy:
a) Subchromatidové – obtížně zjistitelné, vznikají v profázi.
b) Chromatidové – vznikají jako důsledek ozáření v G2, tj. po replikaci. V následující metafázi jsou
pozorovatelné.
c) Chromozómové vznikající jako důsledek ozáření v G1, tj. před replikací.
Mějme níže uvedený chromozóm s genovou strukturou určenou velkými písmeny, přičemž © označuje polohu
centromery a  označuje místo, kde došlo ke zlomu:
A-B-C-©-D-E-F-G-H-I
Výsledkem je
A-B-C-©-D-E-F G-H-I
Tato léze je většinou opravena správně, avšak fragmenty se mohou spojit i chybně:
A-B-C-©-D-E-F-I-H-G
nebo I-H-G-A-B-C-©-D-E-F
nebo G-H-I-A-B-C-©-D-E-F
Může se vytvořit i např. kruhová struktura z fragmentu, který má centromeru, a fragment bez centromery zůstane
oddělen. Buňka se dělí, ale fragment bez centromery (acentrický) se nemůže účastnit normálním způsobem mitóz.
Jindy se na nezreplikované chromatidě chromosomu se objeví dva zlomy:
A-B-C-©-D-E-F-G-H-I, vzniká tedy:
A-B-C-©-D E-F G-H-I
Rekombinační oprava může být správná, avšak může vzniknout i mnoho chybných spojení. Produkt:
A-B-C-©-D-G-H-I
Má například intersticiální deleci a malý acentrický fragment E-F se bez centromery nemůže replikovat.
d) Chromozómové zlomy vzniklé po replikaci, tj. ve fázi G2. Některé typy a jejich následky vidíme na
následujících obrázcích Obr. 2.6.1.2.5a a Obr. 2.6.1.2.5b.
Obr. 2.6.1.2.5a Důsledky současných dvouvláknových zlomů (A, B) na obou chromatidách. V důsledku
chybné opravy se může vytvořit velký acentrický fragment (C).
Obr. 2.6.1.2.5b. Chybná oprava dvou poškození na různých chromosomech (A,B). Chybným spojením
se vytváří dicentrický chromosom (C) a acentrický zbytek (D).
Nejmenší a nejjednodušší genovou mutací je změna jediné báze nukleotidové sekvence v DNA – tzv. bodová
mutace. Může vzniknout v důsledku chemického poškození báze nebo jejího chybného vložení při reparaci
poškození či při replikaci.
Jiným typem genové mutace je tzv. posun čtení v důsledku delece nebo inzerce. Představme si sekvenci genů
přepisujících se do kodonů nesených RNA:
CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT….
Tučně zvýrazněné místo označuje deleci. Nové čtení bude:
CAT-CAT-CAT-CAT-TCA-TCA-TCA…..
Díky tomu nastane chybné vložení aminokyselin.
Většina mutací, včetně těch, které vyvolalo ionizující záření, má recesivní charakter, čili může se projevit jen u
homozygotů. Proto je poměrně obtížné mutace identifikovat, pokud nepoužijeme jako model bakteriální nebo
buněčnou kulturu. U mikroorganismů se mutace identifikují pomocí tzv. deficientních kmenů, které potřebují
nějaký specifický metabolit pro svůj růst v důsledku aktivity nějakého genu (který blokuje syntézu příslušného
metabolitu). Mutantní jsou pak ty kmeny, které mohou růst i v médiu, které neobsahuje daný metabolit. Buňky
deficientního kmene jsou ozářeny a po určité době jsou vysety do živného media bez příslušného metabolitu. Jejich
počet je znám. Malý počet mutantů umožní vznik kolonií na Petriho miskách. Podíl přeživších buněk a jejich
původního počtu ve výsevu určuje frekvenci mutací. Typická frekvence bodových mutací savčích buněčných
linií leží v rozmezí od 1 do 3·10-7
cGy-1
. Závislost na dávce má často podobu lineárně kvadratickou.
Mutagenní účinky ionizujícího záření popsal ve svých slavných experimentech u vyšších organismů poprvé Müller
(1927), a to u drozofil. Šlo o mutace na chromozómu X, které se mohly letálně projevit jen u samečků. Výsledky
této a navazujících studií lze shrnout takto:
1. V rozsahu od 0,25 do 40 Gy roste frekvence mutací lineárně s dávkou.
2. Přinejmenším u drozofil jde o bezprahový efekt.
3. Dávkový příkon a frakcionace nehrají v podstatě žádnou roli.
4. Citlivost samčí i samičí gamety je velmi závislá na vývojovém stadiu.
5. Frekvence mutací je 1,5 – 8·10-8
na lokus a cGy
Protože vznikly pochybnosti o přenositelnosti výsledků získaných na drozofilách na člověka, byly od 60. let
prováděny experimenty na myších, což je nejdostupnější savčí model. Bylo překvapující, že u myší byla frekvence
mutací 2,2·10-7
na lokus a cGy, tj. i desetkrát vyšší než u drozofil. U myší bylo dále zjištěno, že pro tutéž celkovou
dávku při nízkých dávkových příkonech (např. 0,1 mGy·min-1
) je frekvence mutací citelně nižší než při vysokých
dávkových příkonech (např. 1 Gy·min-1
). Vysvětlením je zřejmě dostatek času pro reparaci.
2.6.1.3 Účinky ionizujícího záření na normální tkáně i nádory
Nyní budeme aplikovat radiochemické poznatky a poznatky o růstových modelech a sensitizaci
buněk na tkáně a orgány (systémy tkání). Z hlediska odpovědi na ozáření je u tkání rozhodující
jejich reproduktivní-klonogenní aktivita, jež může být u různých tkání značně rozdílná: od
téměř úplné ztráty této schopnosti u mozkové tkáně až po ohromnou proliferační aktivitu
krvetvorné tkáně.
Zatím jsme za smrt buňky považovali její klonogenní smrt, tj. ztrátu rozmnožovací schopnosti.
Ve tkáních však musíme uvažovat vedle toho i normální stárnutí buněk a dochází i k
odstraňování buněk, které jsou „ve špatný čas na špatném místě“.
Rozlišujeme dva druhy buněčné smrti: (1) Nekróza – akutní patologická smrt buňky v důsledku
nedostatku kyslíku, zranění apod. Buňky napuchnou a lyzují, buněčný obsah se vylévá a v
důsledku toho vzniká zánětlivá reakce okolní tkáně. U nádorů je nekróza častá, když rychle
rostou, a proto mají nedostatečné cévní zásobení, málo kyslíku a živin. V tomto případě se však
zánětlivá odpověď neobjevuje. (2) Buněčná smrt způsobená stárnutím nebo řízená metabolicky
se označuje jako apoptóza. Projevuje se zmenšováním jádra a cytoplasmy, následuje
fragmentace a fagocytóza fragmentů sousedními buňkami nebo makrofágy, obsah buněčný se
nevylévá, nevzniká zánět.
Apoptóza má v souvislosti s nádorovými onemocněními klíčový význam, což se ukázalo po
objevu tumor-supresorových genů a onkogenů. Patrně nejvýznamnějším tumor supresorovým
genem je p53, který je transkripčním aktivátorem genů, které ovlivňují stabilitu genomu,
buněčný cyklus a reakci na poškození DNA. Je známo, že produkt tohoto genu vede k apoptóze,
i když není jedinou podmínkou pro její vznik. Mutace genu p53 je často provázena neschopností
zahájit apoptózu. Z hlediska patologie je důležité, že již mírné poškození DNA ve fázi G1
aktivuje prostřednictvím p53 apoptózu. Jiným důležitým genem řídícím apoptózu je bcl-2. Jím
kódovaný protein blokuje apoptózu (např. u neuronů, myeloidních buněk a lymfocytů), čímž
brání buněčné smrti.
Z hlediska předpokládané radiobiologické odpovědi na ozáření lze tkáně různě klasifikovat.
Jedním ze způsobů je členění zdravých tkání na:
a) Hierarchický typ H, charakterizovaný vysokou aktivitou kmenových buněk.
Jde o velmi radiosenzitivní tkáně, které reagují na ozáření akutními změnami –
důsledkem je časná radiační morbidita. Křivky přežití buněk těchto tkání mají jen malá
raménka.
b) Flexibilní typ F, charakterizovaný nízkou aktivitou kmenových buněk, jde o
radiorezistentní tkáně, jejich poškození je příčinou pozdní radiační morbidity. Křivky
přežití mají význačné raménko.
c) Existuje i smíšený typ, u kterého není časná a pozdní morbidita nezávislá – podle
síly akutní odpovědi lze usoudit na odpověď pozdní.
Pro pochopení radiačního poškození tkání je důležitá existence tzv. růstového podílu buněk.
Ne všechny buňky v populaci jsou zapojeny do procesů proliferace, tj. některé setrvávají ve
fázi označované jako G0. Růstový podíl je definován jako podíl klonogenně aktivních buněk v
populaci. Pro odlišení tohoto podílu od ostatních buněk bylo použito 3
H-značeného
(triciovaného, tritium je zářič beta) tymidinu, který musí být k dispozici v S-fázi buněčného
cyklu. Procento buněk, které inkorporovaly značený tymidin do svého genomu, pak představuje
růstový podíl. Obecně platí, že neaktivní (necyklující) buňky mají vyšší radioresistenci, což lze
vysvětlit např. tím, že mají více času na opravu poškození před zahájením svého dělení.
Důležitý je poznatek, že necyklující buňky se po změně vnějších podmínek mohou stát opět
klonogenně aktivními (cyklujícími).
U rychle rostoucích nádorů se mohou objevit rozdíly v zásobení kyslíkem a glukózou v jejich
různých částech. Je-li vzdálenost od nejbližší cévy větší než asi 100 m, nastává nekrotizace.
Růstový podíl je soustředěn do nejbližšího okolí cév. Ve zbývajícím kompartmentu nádorové
tkáně jsou necyklující buňky „podvyživené“ a anoxické.
Dosud diskutované modely přežití se týkaly buněk pěstovaných in vitro. Prvními tkáňovými modely, v nichž se
studovalo přežití buněk, byly nádory. Nádor byl ozářen v jednom živočichovi a pak transplantován do neozářeného
živočicha téhož druhu. Zvláštní zájem byl o necyklující buňky a o kyslíkový efekt v souvislosti s radioterapií.
Zmíníme se stručně o několika konkrétních experimentálních postupech.
Hewittův zřeďovací test. Prováděn pomocí nádorových linií pěstovaných v peritoneu myší. Zjišťuje se, kolik
neozářených nebo různě ozářených nádorových buněk je schopno usmrtit příjemce. Pro několik různých dávek
záření se určí podíl takto aktivních buněk a zjistí se jeho závislost na dávce. Tento test umožnil ověřit např.
kyslíkový efekt u savčích nádorů.
Postupovat lze i tak, že z ozářeného solidního nádoru se získají buňky, které jsou podány neozářeným myším téhož
kmene. Po 15-20 dnech jsou příjemci usmrceni a v jejich plících jsou spočteny kolonie nádorových buněk. Mezi
počtem injikovaných buněk a počtem kolonií je vztah přímé úměry.
Jiným způsobem hodnocení odpovědi nádoru na ozáření je sledování závislosti objemu nádoru na době od jeho
inokulace do hostitelské myši. Problém je nepřesnost měření objemu nádoru in situ s ohledem na jeho nepravidelný
tvar. Zatímco objem neozářených nádorů roste s časem alespoň zpočátku lineárně, objem ozářeného nádoru se
může nejdříve zmenšit a teprve pak může po čase opět růst. Tato doba charakterizuje odpověď na ozáření a nazývá
se zpoždění růstu.
Modifikací metody je měření doby potřebné k dosažení předem definovaného objemu nádoru nebo dávky záření
potřebné k vyléčení 50% nádorů.
V rostoucích nádorech lze očekávat různě silné hypoxické podmínky. Situace se mění během
„životních cyklů“ ozařovaného nádoru – vliv velikosti, vaskularizace a selektivního ničení
buněk dobře zásobených kyslíkem. Reoxygenace anoxických buněk nádoru je tak rychlá, že se
může projevit ještě před skončením ozařování.
Již v první dekádě dvacátého století byl formulován tzv. zákon Bergonié a Tribondeau, který praví, že k záření
jsou nejcitlivější buňky rychle se dělící a málo diferencované.
Testování radiosenzitivity normálních tkání (a jejího ovlivnění) in vivo se zaměřuje na ty tkáně, které jsou velmi
radiosenzitivní a jejichž poškození představuje pro člověka největší riziko. Jsou to zpravidla tkáně, v nichž se
buňky rychle obměňují: krvetvorná tkáň (kostní dřeň), kůže, epitel gastrointestinálního traktu a gonády (tvorba
spermií). Pro každou z uvedených tkání byly vyvinuty testy radiosenzitivity.
Zde uvádíme některé příklady, jak se k tomuto testování přistupuje. Metoda bývá označována CFU – colony
forming units, což znamená jednotky vytvářející kolonii buněk, např. ve slezině příjemce ozářených buněk. Buňky
krvetvorné tkáně mají totiž schopnost vytvářet počitatelné kolonie buněk ve slezině příjemce, jehož kostní dřeň
byla zničena ozářením. CFU mohou pocházet z femuru ozářené myši nebo je jejich suspenze ozařována in vitro,
což nemá zásadní vliv na jejich radiosenzitivitu. Pro buňky krvetvorné tkáně je charakteristické, že jejich křivky
přežití jsou téměř bez raménka a D0 je přibližně 1 Gy. Tyto buňky jsou vedle spermatogonií (vývojové stadium
spermie) nejcitlivějšími množícími se buňkami v savčím těle a přitom do značné míry určují přežití jednotlivců.
Působení na epitel GIT je dáno ovlivněním klonogenie kmenových buněk střevní sliznice, jež se nacházejí v
Lieberkühnových kryptách mezi střevními klky. U báze klků dochází k nejčastějšímu dělení buněk. Plně vyzrálé
buňky se nacházejí až v distální třetině klku. Proces zrání buněk trvá asi 4 dny. Poškození střevní sliznice zářením
se systémově jeví jako velká ztráta tekutin a elektrolytů. Z histologického hlediska přitom dochází až k úplné
likvidaci klků. Dávka záření může být nastavena tak, aby v jedné kryptě zůstávala v průměru jediná klonogenní
kmenová buňka. Na základě repopulace krypt kmenovými buňkami lze získat křivky přežití. Pro kmenové buňky
Lieberkühnových krypt je charakteristické velké raménko na křivce přežití, což asi souvisí s jejich velkou
schopnosti rychle reparovat poškození. Proto je poškození těchto buněk silně závislé na dávkové rychlosti.
Nicméně lze odhadnout, že letální poškození GIT nastává u myší již po překročení dávky kolem 9 Gy.
Spermatogeneze. Vývoj spermie z kmenové buňky trvá u člověka zhruba 60 dnů, u myši asi 40 dnů. Jednotlivá
vývojová stadia se značně liší svou citlivostí, nejvyšší citlivost mají u myší intermediální spermatogonie (LD50 =
0,2 Gy!), nejnižší již zralé spermie (LD50 = 500 Gy!). Měřítkem účinku záření na spermatogenezi je úbytek
hmotnosti varlete. Metoda vychází z představy, že závislost úbytku hmotnosti na dávce je dvousložková. Je to
způsobeno tím, že se varle skládá z tzv. senzitivního a nesenzitivního podílu tkání. Nesenzitivními, tj.
radiorezistentními buňkami varlete jsou Sertolliho buňky a buňky vazivové tkáně obklopující tubuly. Senzitivní
buňky jsou spermatogonie a další předchůdci spermií, ztráta hmotnosti varlete po ozáření je v tomto případě dána
přerušením spermatogeneze. Křivka „přežití“ nemá žádné raménko, což svědčí o nedostatku reparace poškození.
Dávkový příkon a frakcionace proto nemají žádný vliv na rozvoj poškození. U člověka bylo zjištěno, že sterilita
trvající několik let je navozena dávkou cca 2,5 Gy. K trvalé sterilizaci dochází po dávce 6 Gy.
2.6.1.4 Systémové účinky ionizujícího záření
V této kapitole se budeme věnovat jednak tzv. nemoci z ozáření čili akutní odpovědi na ozáření
a následně i pozdním účinkům, které mají převážně degenerativní a kancerogenní charakter.
Tyto účinky jsou výslednicí změn vyvolaných vlastním ozářením nebo sekundárně, nepřímými
mechanismy. S touto problematikou se seznámíme jen v hrubých rysech.
2.6.1.4.1 Akutní letální odpověď na ozáření u savců
Akutní letální radiační odpověď – nemoc z ozáření – je do značné míry předpověditelná na
základě různé citlivosti tkání a jejich zastoupení v životně důležitých orgánech. Smrt jedince
nastává v tomto případě v rozmezí desítek minut až několika měsíců. Jde o důsledek působení
na hojně se dělící buňky tkání, které jsou výše označovány jako tkáně typu H. Obecně
vysvětlujeme akutní účinky především působením na kmenové buňky proliferujících tkání.
Z hlediska akutní letální odpovědi nemá při celotělovém ozáření pronikavým zářením příliš
velký význam epidermis a vlasové váčky, i když jde o buňky hojně se dělící. Podobně můžeme
pominout i poškození gametogeneze.
Prvním nastupujícím syndromem je poškození krvetvorby. Kmenové buňky kostní dřeně jsou
velmi citlivé na ozáření, na rozdíl od diferencovaných buněk krevních (krvinek, destiček), jež
jsou citlivé jen minimálně. Poškození krvetvorby se tedy stává patrným až po odumření zralých
krevních buněk. Efekt se objevuje po dávce několika Gy.
Životní cyklus lidské červené krvinky trvá asi 100 dnů, avšak granulocyt (bílá krvinka se
zásadní důležitostí pro boj s infekcí) přežívá v krvi jen pár hodin, což je po ozáření jen částečně
kompenzováno prekurzory těchto buněk. Krevní destičky významně klesají asi po osmi dnech,
což souvisí s vyčerpáním zásoby jejich prekurzorů – megakaryocytů. Počet erytrocytů klesá
pomalu, ale po silném ozáření může klesat i v důsledku zvýšené krvácivosti.
K plnému rozvoji tzv. gastrointestinálního syndromu dochází po ozáření dávkami od zhruba
10 Gy během 4 – 6 dnů, což je doba, během které odumřou buňky epitelů klků, které nejsou
obnovovány mitózami v Lieberkühnových kryptách. Výsledkem narušení absorpce vody a
elektrolytů ze střevního obsahu jsou vážné průjmy. V případě méně závažného radiačního
poškození střevní sliznice dochází k plné obnově poměrně rychle – do 10 dnů.
Ozářením je závažně postižen i lymfatický systém, který zahrnuje mízní uzliny, slezinu a
brzlík, obsahuje tkáň typu H, koncovou buňkou je lymfocyt. Systém se z hlediska
radiosenzitivity ničím podstatným neliší od předchozích, s jedinou zvláštností – lymfocyty jsou
k ozáření velmi citlivé, i když se nedělí: během několika hodin po ozáření dávkami několika
desetin Gy odmírají. Vysvětlení spočívá v mimořádné citlivosti lymfocytů k apoptóze, gen p53
je v nich aktivován již velmi malými poškozeními DNA.
Centrální nervový systém odpovídá na ozáření na dvou úrovních. Již při poměrně malých
dávkách do 1 Gy se často objevuje neklid a zvracení, což může být důsledkem účinku záření
přímo na centrum zvracení v mozku. Při velmi vysokých dávkách nad 100 Gy se objevuje téměř
okamžitě dezorientace následovaná do několika hodin smrtí v důsledku selhání CNS a
kardiovaskulárního systému. Mechanismus tohoto efektu je rovněž nejasný (nejde o
usmrcování buněk).
Akutní odpověď na ozáření člověka – nemoc z ozáření – můžeme souhrnně popsat takto:
1. Při dávkách mezi 1 a 2 Gy jsou až do 3 – 4. týdne klinické projevy slabé objevují
se příznaky jako ztráta ochlupení, bledost, všeobecný neklid, průjmy a záněty
sliznic. K úmrtím nedochází, vyléčení může být spontánní, léčba podpůrná a
symptomatická.
2. Dávka 5 Gy je pro člověka LD50, pokud ozáření zasáhne rovnoměrně celé tělo.
Odpověď organismu je prakticky okamžitá a bez lékařského zásahu se projevuje
neklidem, nevolností a zvracením. Téměř okamžitě následuje druhá vlna těchto potíží.
Ve třetím týdnu se naplno projevují průjmy a rozvíjí se syndrom kostní dřeně – bledost,
krvácivost, záněty a infekce sliznic. Během 4. – 6. týdne nastává u poloviny neléčených
ozářených smrt v důsledku vyhubnutí, infekcí a zánětů. Léčba si žádá sterilní podmínky
a transfuze trombocytů i leukocytů, umělou výživu a antibiotika. Při intenzivní terapii
lze přežít ve většině případů celotělovou dávku 6 – 7 Gy.
3. 100% smrtelnou dávkou je i přes veškerou terapii 10 Gy. Ozáření se projevuje
zvracením, následují průjmy. Po týdnu se k tomuto přidávají rozsáhlé záněty, infekce a
krvácení. Vystupňování těchto příznaků vede k vyčerpání a smrti ve 3. týdnu. Tento
klinický obraz vzniká kombinováním tří klinických syndromů:
- neurologického, který rychle usmrcuje při dávkách nad 20 Gy
- gastrointestinálního, který usmrcuje již při dávkách nad 10 Gy
- kostní dřeně (hematologického), který bez léčby usmrcuje člověka od dávky
přibližně 5 Gy narušením krvetvorby a obranyschopnosti.
Rozložení v krátkém čase aplikované letální dávky na delší období (týdny) se projevuje
omezením projevů GIT syndromu, protože buňky v Lieberkühnových kryptách reparují
poškození během několika hodin a mohou obnovit klky. Toto však neplatí pro hematologický
syndrom, protože klonogenní prekursory buněk kostní dřeně reparují velmi pomalu.
Odděleně musíme pojednat o účincích na embryo a plod. Obecně lze předpokládat, že dělící se buňky lidského
embrya budou citlivé vůči ozáření. Embryo však nemá povahu neustále se obnovující populace (jako epitel) a
možnosti reparace nahrazením poškozených buněk jsou malé. Problém je, jak dlouho zůstávají embryonální buňky
„totipotentní“. Jasný je rozdíl mezi mutacemi způsobenými zářením již na úrovni gamet (jsou dědičné) a
usmrcením (poškozením) buněk plodu např. v základu nějakého tělesného orgánu, jehož výsledkem je vrozená
anomálie. Pro vážné poškození budoucího orgánu stačí zničení několika buněk. Vrozené anomálie se však
přirozeně vyskytují u několika procent novorozenců a na tomto pozadí se teprve objevují anomálie vyvolané
ionizujícím zářením.
Připomeňme si, že rozlišujeme tři stadia nitroděložního vývoje:
a) Předimplantační – před zahnízděním oplodněného vajíčka v děložní sliznici.
b) Embryogeneze – organogeneze – zahrnuje období diferenciace orgánů.
c) Fetální růst a vývoj – zahrnuje i pozdní organogenezi.
Odpověď na ozáření je v každém z těchto stadií trochu jiná. Během preimplantačního období sestupuje
oplodněné vajíčko vejcovody do dělohy. Za současné tvorby placenty se před uhnízděním vajíčko ještě několikrát
rozdělí. V tomto stadium může vést ztráta několika buněk (ne jedné či dvou) ke ztrátě celého embrya. U myší lze
případné ztráty embryí prokázat histologickými studiemi (pokud došlo k uhnízdění), u člověka toto nepřipadá v
úvahu.
Přežití myších zygot se řídí v podstatě jednozásahovou kinetikou (v závislosti log S na D není raménko),
převrácená hodnota inaktivační konstanty 1/k se blíží 1 Gy). Odolnost dvoubuněčného embrya je podstatně vyšší.
Dávka 2 Gy vede u myší ke ztrátě 80% embryí v preimplantačním stadiu. Vrozené abnormity jsou vzácné, embryo
přežívá nebo umírá.
Organogeneze: V tomto období vede k největšímu poškození zničení byť jen několika buněk v základu nějakého
orgánu (např. oka, mozku, hypofýzy atp.) – již nejsou k dispozici totipotentní buňky, které by mohly ztracené
buňky nahradit. Nejdříve se vyvíjející citlivé základy orgánů jsou základy CNS, nejpozději se zakládají kosti,
případně se dokončuje vývoj jiných struktur, který byl zahájen již dříve (oko, zuby, zevní utváření těla). Již v 50.
letech 20. století bylo zjištěno, že dávka 1 Gy vyvolává abnormity v podstatě u všech embryí ozařovaných v době
organogeneze, významné množství abnormit však vzniká již po dávkách 0,15 – 0,2 Gy. Lze odhadnout, že u
člověka je embryo nejcitlivější během 4. nebo 5. týdne těhotenství (kdy si žena ještě nemusí být těhotenství
vědoma). Jsou-li během organogeneze aplikovány dávky 1 – 2 Gy, vedou abnormity plodu často k jeho ztrátě.
Fetální růst: V tomto období vede aplikování dávek nad 2 Gy k úmrtí plodu a abnormity jsou málo výrazné. Spíše
se projevuje opoždění vývoje a malá porodní váha. U lidí je v tomto období po ozáření dávkou i pod 1 Gy
pozorována mikrocefalie.
Bylo zjištěno, že u člověka se nevyskytují orgánové malformace (abnormity) po ozáření v
takové míře jako u malých laboratorních živočichů. Na základě rozboru poškození plodů po
výbuších atomových pum byly u člověka identifikovány jako hlavní následky nitroděložního
ozáření mentální retardace a mikrocefalie. Je obtížné rozlišit, co dáno účinkem přímo na plod a
co je zprostředkováno poškozením těla matky.
2.6.1.4.2 Nestochastické pozdní účinky ozáření
Jako pozdní účinky jsou obecně označovány patologické změny tkání, které se objevují měsíce
až roky po ozáření. Pro pozdní nestochastické (nověji deterministické) účinky existuje
prahová dávka a velikost účinku závisí na dávce. Typicky se s těmito účinky setkáváme jako s
důsledkem frakcionované terapie. Frakcionace chrání spíše před účinky akutními než pozdními.
Existují v zásadě dvě teorie vysvětlující pozdní nestochastické účinky:
a) Deplece (vyčerpání) klonogenních buněk ve tkáni před delší dobou ozářené.
b) Porucha vaskularizace tkáně, která se projevuje fibrotizací a nedostatečným
cévním zásobením.
Cévní endotel jako terčová tkáň. Vzhledem k tomu, že pozdní účinky se objevují i ve tkáních s nízkou mitotickou
aktivitou, musíme hledat účinný mechanismus, který nezávisí na mitotické aktivitě buněk tkáně. Předpokládá se,
že poškození vzniká v důsledku změn mikrovaskulatury. Cévní endotel je tkání s obnovujícími se buňkami, která
proto může být citlivá k ozáření. Možný je i nepřímý mechanismus poškození v důsledku neprůchodnosti cév,
která může být způsobena proliferací buněk nebo trombotizací. Navržený mechanismus začíná zvýšenou
propustností stěn cév, po které následují zánětlivé procesy a poškození endotelu, fibrotizace a zesílení cévních
stěn, opět snížení krevního zásobení, zhoršená difuze látek, navození dalších zánětů a fibrotizace – cyklický
proces vedoucí k degeneraci a ztrátě funkce.
Pojivové tkáně a parenchym jako terčová tkáň. Poškození pojivové tkáně a parenchymů je alternativním
vysvětlením pozdní odpovědi na ozáření. Tyto systémy jsou totiž, byť zvolna, též obnovovány, mají tedy jistý
klonogenní potenciál. Délka tohoto cyklu se značně liší v jednotlivých orgánech a tkáních, což by mohlo
vysvětlovat, proč se pozdní účinky projevují u různých tkání/orgánů po různé době (pokud by vše záleželo jen na
poškození endotelu cév, vznikalo by pozdní poškození všude zhruba po stejné době). Ani toto vysvětlení však není
zcela vyhovující, protože nástup pozdního poškození mnohdy nekoresponduje s rychlostí obnovy buněk příslušné
tkáně. Je tedy pravděpodobné, že poškození endotelu, pojiv a parenchymu se projevuje současně.
Funkční podjednotky. Tento přístup ke vzniku pozdních účinků vychází z představy, že osud orgánu závisí na
osudu jednotlivé tzv. funkční podjednotky. Bylo zjištěno, že rozsah dávek, které vedou k významnému funkčnímu
deficitu, je dosti široký a že jedno z možných vysvětlení spočívá v uspořádání kmenových buněk ve funkčních
podjednotkách. Vezměme si nefron tvořený glomerulem, Bowmanovým pouzdrem a tubuly. Když jsou zničeny
všechny epiteliální buňky tubulu, nefron je ztracen navždy. V tomto případě je dávka potřebná ke zničení funkce
ledvin určena spíše počtem buněk nefronu než celkovým počtem terčových buněk v orgánu. Funkční podjednotkou
ledvin je nefron, v plicích to je alveolus, u míchy je skupina oligodendrocytů schopná zajistit myelinizaci příslušné
skupiny neuronů atp. Širší definice funkčních podjednotek říká, že jde o objem (někdy plochu – kůže) tkáně, který
může být regenerován z jediné přeživší buňky bez ztráty funkční integrity. Podle organizace funkčních
podjednotek rozlišujeme orgány „sériové“ a „paralelní“. V sériových orgánech je organizace taková, že zničení
jedné funkční podjednotky vede k vážnému poškození funkce celého orgánu (mícha, mozkový kmen, optické
nervy). V paralelních orgánech nevede ani úplné zničení funkční podjednotky ke zničení funkce orgánu jako
celku (plíce, hypofýza, dutina ústní, slinné žlázy, játry, ledviny, močový měchýř). Za „smíšené“ jsou považovány
orgány jako jícen, hltan, hrtan, tenké střevo, rektum, mozek.
Jak se projevují pozdní deterministické účinky u jednotlivých orgánů?
Začneme s GIT. Jícen (příčně pruhované svalstvo, roztažná pojivová tkáň a mnohovrstevný dlaždicový epitel).
Pozdním účinkem je striktura – zúžení jícnu až do úplného zneprůchodnění pro potravu – v důsledku patrně
poškození cév svalů a pojiva. Žaludek – kmenové buňky epitelu se chovají podobně jako buňky Lieberkühnových
krypt. Pozdní účinky na žaludek jsou popisovány jako fibrotická atrofie sliznice, ztráta motility, roztažnosti a
schopnosti trávit. Tenké a tlusté střevo – tenké střevo má na vnitřním povrchu klky, tlusté střevo má hladký
povrch, typické jsou pohárkové buňky produkující mukus. Pozdní účinky jsou podobné jako u žaludku a jícnu.
Rektum – fibrotické změny, ztenčení, perforace.
Významné pozdní účinky shledáváme i na kůži. Vnější vrstva kůže je tvořena rychle se obnovujícími
keratinizovanými buňkami. Na rozdíl od pod ní ležící pojivové dermis je velmi radiosenzitivní. Akutním účinkem
je suché a později i vlhké odlupování kůže, vznik mokvavých ploch. Jako pozdní následek se objevují
telangiektazie (viditelně rozšířené kapiláry). Akutní ztráta vlasů, chlupů a funkce potních žláz může být nevratná.
Objevují se fibrotické změny a zjizvení v ozařovaném poli. Podobně reagují na ozáření všechny vnitřní povrchy
orgánů, protože mají podobnou histologickou skladbu.
Pozdní účinky na játra, ledviny a plíce: ozáření vede ke snížení regenerační schopnosti a později k závažným
fibrotickým změnám. Ledviny – vedle fibrotických změn, které jsou opět spojovány s poškozením cévního
endotelu, byly u zvířat popsány změny resorpční schopnosti tubulů pro vodu a glukózu. Plíce – po odeznění zápalu
plic se objevuje též fibrotizace, sklerotizace, ztráta elasticity.
CNS: Mozek – akutní odpovědí je edém (častý při radioterapii mozkových tumorů), který je připisován narušení
tzv. hematoencefalické bariéry. Pozdní reakcí je zhoršení různých mozkových funkcí připisované přechodnému
zastavení syntézy myelinu v oligodendrocytech. Mícha je považována za velmi citlivou a musí být chráněna při
ozařovacích procedurách. Poškození se projevuje ochrnutím – paralýzou. I v míše se objevují demyelinace a
nekrózy. Příčinou je radiační poškození klonogenních buněk (oligodendrocytů, glie) i cévního endotelu.
Pozdní účinky na oko se projevují vznikem katarakty (zákalu čočky). Jsou známy již z první poloviny 20. století
u ozařovaných pacientů i lékařů. Nejde o problém způsobený poškozením vaskularizace (čočka není
vaskularizovaná), nýbrž o poškození klonogenních epiteliálních buněk, jejichž dceřiné buňky migrují do čočky
a vytvářejí v ní průhledná strukturální vlákna. Při jednorázovém ozáření se prahová dávka pohybuje od 2 do 6 Gy,
při frakcionaci dávek 11 Gy. Doba latence může být u nižších dávek až 10 let. Vznik katarakty je velmi silně
závislý na LET. Pro neutronové záření se udává prahová dávka kolem 1 cGy!
2.6.1.4.3 Stochastické pozdní účinky – kancerogeneze:
Kauzální vztah mezi kancerogenezí a expozicí rentgenovému záření byl rozpoznán někdy
kolem roku 1911, avšak skutečnost, že jde o bezprahový efekt, začíná být zřejmá až po druhé
světové válce. I když dnes považujeme vznik nádorů po ozáření za bezprahový stochastický
efekt, některá pozorování tento názor relativizují: zdá se, že pro některé nádory existuje prahová
dávka, a je známo, že invazivita (agresivita) některých nádorů závisí na dávce. Naše znalosti
pocházejí ze studií na zvířatech, z vyvolání nádorové transformace u buněk pěstovaných in
vitro a z pozorování lidí ozářených náhodně nebo při jaderných explozích.
Již ve 30. letech byl u myší prokázán vznik leukémie po ozáření. Při hodnocení studií tohoto druhu je však třeba
mít na paměti přinejmenším to, že nádory mají nenulový výskyt i u živočichů neozařovaných a že maximální
incidence nedosahuje při žádné dávce 100%. Výsledky získané na zvířatech vysvětlují působení na člověka jen
kvalitativně a navíc se zpravidla týkají dávek (desetina až jednotky Gy), které nejsou z hlediska ochrany populace
příliš relevantní (zde by byl zajímavý rozsah 1 – 10 mGy, typický např. pro vyšetření CT).
Výsledky studií na zvířatech lze shrnout takto: (1) Ozařováním lze u citlivého živočicha vyvolat vznik téměř
jakéhokoliv nádoru. (2) Existují nádory, jejichž frekvenci ozářením ovlivnit nelze. (3) Mechanismy působení
záření se liší podle druhu nádoru a expozičních podmínek. (4) Nádor může být vyvolán přímo nebo i
zprostředkovaně (v důsledku působení na jiné buňky). (5) Záření o vysokém LET je z hlediska kancerogeneze
obecně účinnější. (6) Kancerogeneze může být ovlivněna mnoha jinými faktory, takže se při nízkých či středních
dávkách nemusí vůbec objevit. Při vysokých dávkách je snížena neschopností poškozených buněk dělit se.
K nástupu nádorového onemocnění dochází u člověka až po různé dosti dlouhé době po ozáření
- latenci: po 2 – 20 letech od ozáření se rozvíjí leukémie, některé solidní nádory až po 35 – 40
letech. Již v r. 1941 bylo navrženo, že se proces kancerogeneze skládá ze dvou kroků, mezi
nimiž může být značný časový odstup (latence).
1. Iniciace – změna genomu somatické buňky, která je nevratná. Může jít i o
aktivaci onkogenního virusu nebo onkogenu.
2. Druhý krok může být označen jako povzbuzení či podpora – ze změněné buňky
se začíná vyvíjet nádor. Spuštění nádorového růstu je způsobeno změnou nějakých
vnějších podmínek (z hlediska transformované buňky).
Obvykle platí, že s klesajícím dávkovým příkonem se snižuje (při stejné dávce) i
pravděpodobnost indukce nádorového bujení, což má nepochybně souvislost s účinnější
reparací DNA. Při dlouhých časech ozařování může dojít i k repopulaci tkáně. Na druhé straně
má silnější kancerogenní účinek záření o vyšším LET. Při velmi malých dávkách je dávková
rychlost bezvýznamná.
Transformace buněk in vitro. Nádorová transformace buněk po ozáření může být pozorována i na euploidních
buňkách savčích (lidských) tkáňových kultur. Kolonie buněk nádorově transformovaných se vzhledově liší od
kolonií buněk normálních, což umožňuje statistické vyhodnocení transformace. Je nutno provádět korekce na
ztrátu klonogenní aktivity (reprodukční smrt) buněk. Mj. bylo zjištěno, že buněčné linie odvozené od hlodavců
odpovídají na ozáření mnohem více v závislosti na dávkovém příkonu než buňky odvozené z lidských tkání. U
hlodavčích buněk je výraznější i efekt frakcionace. Z toho lze usoudit, že u lidí se o něco více uplatňuje přímý
účinek záření než účinek nepřímý. Tyto výsledky též naznačují, že je velmi obtížná extrapolace na člověka u
závěrů získaných v experimentech na hlodavčích buňkách.
Zatímco u záření s nízkým LET vede frakcionace ke snížení kancerogenních účinků, u záření s vysokým LET byl
pozorován spíše opačný efekt.
Transformace normálních buněk na buňky nádorové je za podmínek in vivo ovlivňována celou řadou vnitřních
faktorů (např. hormony, imunitní reakce, stáří organismu aj.), které lze v pokusech in vitro modelovat jen velmi
svízelně nebo vůbec ne.
2.6.1.4.4 Radiační kancerogeneze v lidské populaci.
Nejdříve uvedeme, jaké vzorky populace byly dosud z hlediska radiační kancerogeneze
zkoumány:
a) Profesní expozice: Radiologové exponovaní při své práci, horníci vystavení radonu
(zejména v uranových dolech), dělnice dříve malující svítící ciferníky hodin uranovou barvou.
b) Medicínské expozice: Pacienti s ankylózní spondylitidou (Bechtěrev, chronické zánětlivé
onemocnění páteře) léčení rtg zářením, ženy ozařované pro nezhoubná onemocnění v oblasti
prsou a pánve, lidé opakovaně snímkovaní v tuberkulózních sanatoriích, děti ozařované při
nezhoubných diagnózách jako zvětšený brzlík nebo trichofycie, děti ozařované in utero pro
diagnostické účely v průběhu těhotenství matky.
c) Následky jaderných výbuchů a havárií: Lidé, kteří přežili jaderné výbuchy v Hirošimě a
Nagasaki dle podrobné evidence pozdních efektů padesát let vedené americkými institucemi
The Atomic Bomb Casualty Commission a následně The Radiation Effects Research
Foundation. Dále obyvatelstvo části Marshallových ostrovů v Tichém oceáně vystavené
jadernému spadu v 50. letech, pracovníci a vojáci exponovaní při pokusných jaderných
výbuších (Tichý oceán, Nevadská poušť….), obyvatelstvo v okolí Nevadské pouště vystavené
jadernému spadu, obyvatelstvo Ukrajiny i jiných zemí vystavené jadernému spadu po
Černobylské havárii (neúplná data, jediné, co je jisté, je zvýšený výskyt nádorových
onemocnění štítné žlázy).
Studované příčiny radiační kancerogeneze v populaci se značně liší svým charakterem – druh
záření, dávkový příkon, homogenita ozáření apod. – proto jsou srovnání velmi obtížná.
Populační riziko vzniku zhoubných nádorů může být vyjadřováno jako relativní nebo
absolutní, a to za pomocí rizikových koeficientů. Absolutní riziko: o kolik se zvýší riziko
rakoviny, tj. její výskyt – incidence - např. na 1 milión obyvatel, po expozici jednotkové dávce
oproti přirozenému výskytu, bez ohledu na to, jak je velký. Relativní riziko: kolikrát vyšší
bude riziko rakoviny po expozici jednotkové dávce ve srovnání s přirozeným výskytem.
Vyjádření rizika radiační kancerogeneze. Můžeme vycházet z lineární závislosti:
ID = In + 1D
nebo lineárně kvadratické závislosti:
ID = In + 1D + 2D2
,
kde D je dávka, 1 lineární koeficient rizika (význačný spíše pro záření s vysokým LET), 2 je kvadratický
koeficient rizika (význačný spíše pro záření s nízkým LET), ID incidence rakoviny pro dávku D, In normální
incidence onemocnění. Zatím nelze rozhodnout, zda pro člověka ozářeného fotonovým zářením lépe vyhovuje
model lineární, kvadratický či lineárně kvadratický.
Model absolutního rizika je založený na domněnce, že riziko spojené s určitou dávkou záření je určeno číslem,
které je zcela nezávislé na riziku spontánního výskytu téže nemoci. Rizika spontánního a radiací podmíněného
výskytu se sčítají. Model relativního rizika je založený na domněnce, že pravděpodobnost radiogenní rakoviny
je přímo úměrná přirozenému výskytu onemocnění. Jinými slovy – v tomto modelu je riziko násobkem
přirozeného rizika.
Absolutní riziko tedy zapíšeme:
b = 1 – 0,
kde b je riziko spojené jen s ozářením, 1 – incidence v ozářené populaci, 0 – incidence v neozářené populaci.
Relativní riziko zapíšeme:
r = 1/0,
kde r je rizikový faktor/relativní riziko. Absolutní i relativní riziko může být v lidské populaci smysluplně
definováno pouze pro určitou vrstvu společnosti (danou zejména věkem a pohlavím). Odhad faktorů b i r je velmi
nepřesný s ohledem na malé datové soubory a silnou závislost na vybrané společenské vrstvě.
Orgánová specifičnost radiogenní rakoviny: Zatímco dříve se soudilo, že z hlediska kancerogeneze je
nejcitlivějším orgánem kostní dřeň, dnešní data, opřená mj. o upřesněné výsledky získané v Hirošimě a Nagasaki,
tvrdí, že nejrizikovější jsou plíce a prsy.
(autor: Vojtěch Mornstein)