Lékařská biofyzika – cvičení
(Obory: Zdravotnický záchranář, Porodní asistentka
a Všeobecná sestra)
Vytvořeno v rámci projektu Fond rozvoje MU 1383/2019.
Zadání samostatného cvičení:
2. Hemolýza
Klíčové pojmy:
Hemolýza, erytrocyty, ultrazvuk, mechanické účinky ultrazvuku, kavitace, Bürkerova
komůrka, optický mikroskop, objektiv, okulár, kondenzor
Praktický význam:
V této úloze demonstrujeme biologické destruktivní účinky ultrazvuku demonstrující
především jeho využití při čistění nástrojů, či zubním lékařství. Nicméně vlastní úloha je více
zaměřena na manuální dovednosti, a to práci s automatickou pipetou a světelným
mikroskopem, které jsou rutinní záležitostí v naprosté většině biologických laboratoří. Vlastní
ruční počítaní krvinek v zorném poli mikroskopu je nedílnou součástí hematologické praxe.
Doplňkem je možno demonstrovat i jiné destruktivní účinky na vzorek krve, a tím simulovat
situace, které mohou vést ke znehodnocení odebraného biologického materiálu.
2.1 Hemolýza erytrocytů ultrazvukem
Cíl:
Ověřit účinek ultrazvuku na erytrocyty z hlediska délky jeho působení
Pomůcky:
Ultrazvukový generátor BTL-07, mikroskop s připojením k počítači, Bürkerova komůrka,
stojánek se zkumavkami, pipety, zkumavka s plochým dnem na ozvučení, suspenze
erytrocytů, fyziologický roztok, buničitá vata, kontaktní medium (parafinový olej).
Postup:
1) V kádince je připravena suspenze erytrocytů (2% koňská krev). Tuto suspenzi po
dostatečném promíchání přelijte do skleněné zkumavky s plochým dnem, stačí cca 3 ml, což
je asi polovina zkumavky. Dále pracujte jen s touto suspenzí.
2) Nejprve si spočítejte počet krvinek v této ještě neozvučené (kontrolní) suspenzi. Suspenzi
je třeba naředit 10krát, to je 0,1 ml suspenze + 0,9 ml fyziologického roztoku. Před jakoukoli
manipulací je třeba suspenzi promíchat.
3) Naplňte Bürkerovu komůrku a spočítejte krvinky minimálně ve 20 malých čtvercích.
Spočítejte množství neozvučených krvinek v 1 ml suspenze.
4) Zapněte ultrazvukový generátor. Hlavici upevněnou ve stojanu potřete parafinovým
olejem, abyste docílili dobrého kontaktu hlavice se zkumavkou.
Lékařská biofyzika – cvičení
(Obory: Zdravotnický záchranář, Porodní asistentka a Všeobecná sestra)
Vytvořeno v rámci projektu Fond rozvoje MU 1383/2019.
5) Před vlastním provedením hemolýzy nastavte čas - stačí 30 sekund. Sepněte start a
postupně zvyšujte intenzitu ultrazvuku. Na hlavici v parafinovém oleji můžete sledovat
kavitační bubliny. Časový spínač se automaticky vypne.
6) Nyní zkumavku s plochým dnem položte na hlavici. Nastavte intenzitu 0,1W/cm2 a dobu
ozvučení 30 sekund. Sepněte START a po dané době ozvučení přístroj automaticky vypne. Z
ozvučené suspenze po promíchání odeberte 0,1ml nařeďte přidáním 0,9ml fyziologického
roztoku a spočítejte erytrocyty.
7) Suspenzi v kádince s plochým dnem znovu ozvučte opět po dobu 30s. Po ozvučení dále
postupujte dle bodu č.6. V případě, že průměrný počet krvinek v jedné komůrce klesne pod 5
neřeďte již suspenzi a Bürkerovu komůrku plňte neředěnou suspenzí!
8) Celkem provedete 6 ozvučování, pouze pokud by k plné hemolýze došlo dříve (například
po čtvrtém třicetisekundovém ozvučování) pokus ukončíte.
9) Do tabulky zaneste počet krvinek přepočítaný na 1ml plné krve a stupeň hemolýzy v
závislosti na době ozvučení, do grafu vyneste závislost stupně hemolýzy na době ozvučení
Výstup:
Graf závislosti stupně hemolýzy na době ozvučení
Diskuze:
Uvažujte v nad hlavními rozdíly mezi zde použitým ultrazvukovým vlněním a ultrazvukovým
vlněním využívaným v diagnostice, aneb proč považujeme diagnostický ultrazvuk za jednu
z nejbezpečnějších modalit.
2.2 Volitelné: Hemolýza erytrocytů mechanickými vlivy
Ozvučování vzorku nahraďte mechanickým protřepáváním. Uzavřenou zkumavku opětovně
po dobu jedné minuty usilovně protřepávejte. Případně opakovaný natahováním a
vypouštěním do injekční stříkačky, např. série po 10 cyklech. Výstupem opět graf závislosti
stupně hemolýzy na doby protřepávání/počtu natažení do stříkačky.
2.3 Volitelné: Stanovení absorpční křivky hemolyzované krve
Dle návodu z úlohy 1.1 proveďte stanovení absorpční křivky a absorpčního maxima
zhemolyzované krve.
Lékařská biofyzika – cvičení
(Obory: Zdravotnický záchranář, Porodní asistentka a Všeobecná sestra)
Vytvořeno v rámci projektu Fond rozvoje MU 1383/2019.
Příloha:
1) Technika pipetování:
2) Schéma rastru Bürkerovy komůrky:
3) Technika pipetování do Bürkerovy komůrky:
Převzato z:
https://andyjconnelly.wordp
ress.com/2017/02/12/practi
cal-pipetting-a-guide/
Převzato z:
https://cz.vwr.com/store/pr
oduct/7120539/pocitacky-
bunek-burker-blaubrand
Převzato z:
https://laboratoryinfo.com/
manual-cell-counting-
neubauer-chamber/
Lékařská biofyzika – cvičení
(Obory: Zdravotnický záchranář, Porodní asistentka a Všeobecná sestra)
Vytvořeno v rámci projektu Fond rozvoje MU 1383/2019.
4) Absorpční křivky různých typů hemoglobinu
Převzato z:
https://acutecaretesting.org/en/articles/
hemoglobin-and-its-measurement