datum___________ jméno__________________

Téma praktika:

Radioimunoanalýza (RIA) - stanovení  aldosteronu

1.       Nastavení metody na gamaměřiči LB 2111

Nadefinování metody, typu kalibrace, zadání cílových hodnot kalibrátorů, nastavení kontrol.

Seznámení s přístrojem - princip, validace přístroje.

2.       Vlastní provedení stanovení aldosteronu v pacientských vzorcích

Okruhy k nastudování a dotazy:

1.     Jaká značenka se v RIA používá nejčastěji?

2.     Co je to ionizující záření?

3.     Jaká jsou specifika pro g-záření (jakých je energií, jaké vlnové délky, propustnost)?

4.     Co se děje při „fotoefektu“ a při „Comptonově rozptylu“?

Přístroje a pomůcky:

Gama (g-) měřič LB 2111 multidetektorový gama měřič (g-counter) pro radioimunoanalýzu

Souprava na stanovení aldosteronu (Immunotech)

Vzorky sér


Teorie, princip stanovení

Stanovení aldosteronu v séru nebo plazmě (heparin, EDTA) soupravou RIA (dodává Immunotech).
Principem stanovení je kompetitivní radioimunoanalýza.


Standardy, kontrolní vzorky a vzorky plazmy/séra se inkubují ve zkumavkách potažených monoklonální
protilátkou společně s radioindikátorem ^125 I, který je navázán na antigen - anti-aldosteron. Po
inkubaci se odsaje obsah zkumavek a změří se vázaná radioaktivita vyjádřená v jednotkám cpm.
Naměřená radioaktivita je nepřímo úměrná koncentraci analytu.


Princip scintilačního detektoru

g-counter Berthold (LB 2111) slouží ke kvantitativnímu měření radioaktivity g-záření (vyjádřeno
v jednotkách cpm). g-counter Berthold je vybaven scintilačním detektorem, který je založen na
vzniku luminiscence při průchodu ionizujícího záření vhodnou látkou (scintilátorem). Pro detekci
g-záření se jako scintilační jednotky používají krystaly NaI/Tl. Při průchodu záření gama
scintilačním krystalem dochází k fotoefektu a ke Comptonově rozptylu. Elektrony uvolněné
z atomových obalů excitují atomy krystalu, přitom vzniká viditelné luminiscenční záření zvané
scintilace. Pro přeměnu scintilací na elektrické impulsy se používají fotonásobiče. Systém LB 2111
je vybaven 12 scintilačními jednotkami a fotonásobičem.


ReagencieOSN-E
 1. Zkumavky potažené protilátkou proti aldosteronu: 2x 50 zkumavek.
 2. Radioindikátor - značený ^125I: 1 lahvička (55 ml); připravená k použití.

Lahvička obsahuje aktivitu 165 kBq (ke dni výroby) aldosteronu značeného ^125I roztoku s hovězím
sérovým albuminem, obsahuje azid sodný.
 3. Standardy: 6 lahviček (0,5 ml): kalibrační rozmezí 0 - 6,93 nmol/l. Koncentrace lyofilizovaného
aldosteronu s azidem sodným (< 0,1%) jsou uvedeny na lahvičkách.
 4. Kontrolní vzorky: 1 lahvičky (0,5 ml): před použitím rozpustit v destilované vodě, její objem
je uveden na lahvičce. Aktuální koncentrace lyofilizovaného aldosteronu je znázorněna na lahvičce.


Všechny reagencie soupravy uschovávejte v lednici při 2-8 °C. Aktuální koncentrace standardů a
kontrolních materiálů jsou zaznamenány na lahvičkách.


Pracovní postup

1.       Nechte všechny reagencie vytemperovat na laboratorní teplotu.

2.       Očíslujte duplikátní sérii potažených zkumavek. Do každé zkumavky napipetujte 50 µl
kalibrátoru, kontrolních vzorků a pacientských sér. Nachystejte si zkumavku pro celkovou aktivitu
(Total; T).

3.       Do každé zkumavky napipetujte 500 µl radioindikátoru ^125I.

4.       Zkumavky promíchejte na vortexu, zakryjte parafilmem a nechte inkubovat v třepačce na 3
hodiny.

5.       Odsajte obsah všech zkumavek, s výjimkou zkumavky pro celkovou aktivitu (T).

6.       Zvolte vyhodnocovací program RIA Aldoimuno a změřte radioaktivitu zkumavek – na g-counteru
nastaveném na ^125I po dobu 1 minuty. Tím získáte vázané cpm (B) a cpm pro celkovou aktivitu (T).

Schéma pracovního postupu

Krok 1

Dávkování

Krok 2

Inkubace

Krok 3

Měření


Do potažených zkumavek dávkujte:

·         50 μl vzorku séra/plazmy, standardu, kontrolního vzorku


·         500 μl radioindikátoru ^125I


·         zakryjte parafilmem



Inkubujte 3 h

při 18-25°C za stálého třepání.



Pečlivě odsajte obsah zkumavek, promyjte pomocí promývacího roztoku a znovu odsajte obsah zkumavek.


Změřte vázané cpm (Bound; B) a celkové cpm pro celkovou aktivitu (Total; T) po dobu 1 min.

Vyhodnocení

Vyhodnocení se provádí pomocí kalibrační křivky, kdy na osu x se vynáší koncentrace v nmol/l a na
osu y poměr B/B[o].

Přepočítací faktor: nmol/l = pg/ml x 0,002774


              Total

                                                                  B[o]

                                                                                                  Std1

                                                                                                      Std2

                                                                                                          Std3

                                                                                                              Std4

                                                                                                                  Std5

Impulzy








c (teoretické)








c (naměřené)










Kontroly

                                                      Impulzy

                                                                                                c (naměřené)

K1



K2





Vzorky

                                                    Impulzy

                                                                                                c (naměřené)







3. Klinická interpretace: referenční meze; uvést příklady ↓ a ↑ klinických hodnot.

4. Proč rozlišujeme referenční meze aldosteronu vleže a ve stoje? A kdy jsou vyšší?

5. Kdy jsou koncentrace aldosteronu u pacientů mnohonásobně vyšší  - čím je to způsobeno?

6. Popis bezpečnosti v RIA laboratoři  (příklad kontrolní test ověření znalostí), monitorování
pracovního prostředí v RIA laboratořích.

7. Fyzikální poločas rozpadu  ^125I je? Jaké jsou výhody a nevýhody stanovení RIA?