Elektroforetické techniky David Zeman 2021 Pojmy a definice • Elektroforéza = pohyb nabitých částic v elektrickém poli; 3 základní techniky: • Zónová elektroforéza: homogenní pufrovací systém - konstantní pH; migrační vzdálenosti během definované doby dělení odpovídají elektroforetickým mobilitám dělených látek; lze aplikovat na neamfoterní i amfoterní molekuly; difúze snižuje senzitivitu detekce i rozlišení • Izotachoforéza (ITP): dělení v diskontinuálním systému pufrů, ionizovaný vzorek migruje mezi vedoucím elektrolytem s vysokou mobilitou a terminálním elektrolytem s nízkou mobilitou; lze dělit buď pouze kationty, nebo pouze anionty (ne obojí současně); všechny složky směsi se pohybují stejnou rychlostí; složky směsi jsou rozdělené podle svých elektroforetických mobilit • Izoelektrická fokusace (IEF): dělení v gradientu pH, lze použít pouze pro amfoterní látky řpeptidy a bílkoviny); molekuly migruji do svých izoelektrických bodů; samozaostřující (fokusacní) efekt brání difúzi • Kapilární elektroforéza (capillary electrophoresis, CE) Teoretické základy elektroforetických metod > FE = q • E ( q = z ■ e ) > Ffr = f c * V > V rovnováze: q-E = /c • v q -E n V = -— = U • E fc u je mobilita neboli elektroforetická pohyblivost částice. Je to veličina charakteristická pro danou látku. Elektroforetická pohyblivost částice u • Pro kulovitou částici platí: q z - e fc 6n • r\ • r • Peptidy a proteiny však nejsou kulovité. Mobilita uje u nich nepřímo úměrná molekulové hmotnosti podle vztahu — q (exponent ve jmenovateli je udáván různě mezi 1/3 a 2/3) U slabých kyselin a zásad je pro rychlost migrace rozhodující efektivní mobilita uef daná vztahem i Kde a, je stupeň disociace. Ten lze ovlivnit vhodnou volbou pH elektrolytu. nstrumentace - 3 základní komponenty • Zdroj stejnosměrného napětí • Chlazení (termostat) • Elektroforetická vana/deska Média pro zónovou elektroforézu • Papír • Škrob • Acetylcelulóza • Agar • Agaróza • Polyakrylamid Agaróza (vlevo) a polyakrylamid (vpravo - znázorněn princip přípravy z a kry lam id u a N, AT- methylenbisakrylamidu) OH OH H' CH, 9 CWJ S h ■ i ^—Cm ■i' w ■ CH .ynnírn um F+r;J.i»atí TEMED —CM—CHj— CH—CHj— CK—CHj—ÍW—Qri — Ml MH, Izotachoforéza řecky isos = stejný, tachos = rychlost • Všechny ionty migrují stejnou rychlostí • Složky směsy jsou rozděleny v „iontovém vlaku" • Samozaostřovací efekt • Efekt regulující koncentraci • Předpokladem ITP separace je diskontinuální pufrovací systém s vedoucím (leading, L) a terminačním (terminating, T) elektrolytem • U běžnější separace aniontů je L (příklad: Cl) na anodické a T (příklad: Gly) na katodické straně. Protiion je společný (příklad: Tris+) Izoelektricka fokusace (IEF) Focusing chamber pH 3456769 10 coon /< rJ»i coon r^/pf J£Sax* co^moh ^^-W Cathode H (+2) (0) (-2) Met charge Izoelektrická fokusace • Dělení amfoterních látek (peptidů, proteinů) podle jejich izoelektrického bodu Apl = rozlišovací schopnost D = difúzni koeficient bílkoviny E = síla elektrického pole (V/cm) d(pH)/dx = pH gradient du/d(pH) = směrnice mobility bílkoviny v izoelektrickém bodu Způsoby provedení IEF podle účelu • ANALYTICKÁ IEF (pro analýzu peptidů a proteinů) • agarózový gel • polyakrylamidový gel - s nosičovými amfolyty (oligoamino-oligokarboxylové kyseliny) - s imobilizovaným pH gradientem (bifunkční /nikoliv amfoterní!/ akrylamidové deriváty s pufrující skupinou /karboxyskupina nebo terc. amin/ navázanou na dusík aminoskupiny • PREPARATIVNÍ IEF (cílem je získat relevantní množství daného peptidu/proteinu po jeho separaci ze směsi) • Dextranový gel s nosičovými amfolyty • Izoelektrické membrány (polyakrylamid s Imobiliny - každá membrána má příslušnou hodnotu pH) • Off-gel IEF: na IPG - proužcích (frakcionační rámeček s 24 komůrkami se přiloží na povrch IPG proužku) IPG-gely získáme při nalévání gelu kontinuální změnou mísícího poměru Immobilinů (podobně jako při nalévání gelu s gradientem velikosti pórů) - principem je acidobazická titrace, aktuální hodnota pH je definována Henderson-Hasselbachovou rovnicí: Je-li pufrujícím Immobilinem zásada: pH = pKB + log- CA • Je-li pufrujícím Immobilinem kyselina: CB pH = pKA + log--— CA ~ CB Nábojové vlastnosti AK a bílkovin • Při pH < pl jsou kationty • Při pH = pl jsou amfolyty navenek elektroneutrální • Při pH > pl jsou anionty • Disociační konstanty Kx a K2 jsou vyjadřovány logaritmicky jako pK = pH, při kterém se v roztoku nacházejí stejná množství protonovaných (asociovaných) a ne proton ováných (disociovaných) forem • pl = izoelektrický bod = pH, při které molekula existuje jako amfolyt s nulovým výsledným nábojem • pl = Yz [pKx + pK2]; u AK s ionizovatelnou skupinou v postranním řetězci uvažujeme hodnoty pK „na obě strany" od elektroneutrálního zwitteriontu (pl leží mezi hodnotami pK zwitteriontu a jeho konjugované kyseliny) • Při fyziologickém pH je většina bílkovin záporně nabitá Analýza titračních křivek: gel s amfolyty - po lEF (vytvoření pH gradientu) otočíme gel o 90° a do žlábku naneseme analyzované bílkoviny, necháme probíhat elektroforézu. Kde je pl hledané bílkoviny? obr. z: Westermeier R. Electrophoresis in practice. Wiley-VCH, Weinheim 2005 Vysokorozlišovací dvourozměrná elektroforéza • 1. krok: IEF na IPG-proužcích • 2. krok: SDS-PAGE Denzitometrie Kvantitativní hodnocení intenzity zbarvení Měření absorpce světla jednotlivými zónami (pásy) Pohyblivý světelný zdroj jlaser nebo lampa s bílým světlem s filtry) je veden nad gelem a na každém miste gelu je měřena a počítačově zpracována absorpce U jednorozměrných gelů získáváme křivku extinkce In L/1 (lQ= intenzita světla ze zdroje, I = intenzita měřená detektorem) podél elektroforetické stopy; u dvourozměrných gelů je extinkce zobrazena jako funkce povrchu gelu Neplatí zde Lambertův-Beerův zákon! (proč?) Závislost absorpce na koncentraci bílkoviny při extinkci >2,5 (lampa s bílým světlem) nebo >4 (laser) se stává hyperbolická nebo sigmoidní Slabé pásy/stopy jsou často nadhodnocené, proteiny ve vysoké koncentraci podhodnocené Komerčně dostupné elektroforetické systémy pro použití v klinické laboratorní diagnostice • Firma Sebia (založena 1967, • Firma Helena Laboratories nadřízená organizace: Montagu (založena 1966) Private Equity) . www.helena.com • www.sebia.com Elektroforetický přístroj Hydrasys2 (Sebia) - pro elektroforézu a izoelektrickou fokusaci Elektroforetický přístroj Multiphor II (uprostřed) se zdrojem (vpravo) a termostatickým cirkulátorem MultiTemp III (vlevo) Elektroforetický přístroj Flatbed Professional (EDC, uprostřed) se zdrojem (Consort, vlevo) a termostatickým cirkulátorem (Huber, vpravo) Elektroforetické metody v klinické laboratoři Elektroforéza bílkovin séra a moče (agaróza, CE) - zejména screening monoklonálních gamapati Imunofixační elektroforéza bílkovin séra a moče jagaróza) NEBO imunosubtrakční elektroforéza (CE) - typizace monoklonálních imunoglobulinů (paraproteinů) SDS elektroforéza bílkovin moče - diferenciální diagnostika proteinurií (glomerulární, tubulární, postrenální) Elektroforéza hemoglobinů - detekce abnormních hemoglobinů Elektroforéza izoforem některých enzymů-ALP, LDH, CK Elektroforéza lipoproteinů Izoelektrická fokusace - detekce oligoklonálních pásů jzejm. IgG) v likvoru u chronických zánětlivých onemocnění CNS (zejm. roztroušené sklerózy); fenotypizace alfal-antitrypsinu Elektroforéza nebo izoelektrická fokusace s detekcí izoforem transferinu (průkaz likvoru v sekretech - v likvoru je přítomna kompletně desialovaná frakce, tzv. (32-transferin neboli asialotransferin; CE pro relativní kvantifikaci CDT- disialofrakce, popr. s mono- a asialofrakcí) Elektroforeogramy HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 $é Wfy Sebia 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 26 29 30 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Elektroforéza bílkovin se provádí s cílem zjistit abnormality bílkovin krevního séra. HP Bílkoviny jsou rozděleny podle svých elektroforetických pohyblivostí do skupin (frakcí), které vytvářejí charakteristický obrazec. (U Změny v tomto obrazci souvisí s různými druhy onemocnění nebo s různými patologickými stavy. Bílkoviny se dělí na 5 - 6 hlavních frakcí: + Albumin 56 - 66 % + al globulíny 2 - 3 % + a2 globulíny 8-12 % + P globulíny (pl, p 2) 7-10 % + y globulíny 10 -18 % Typ: Nosič: Nanášení: Denaturace: Barvení: Odbarvení: Hodnocení: Poznámka: ELFO na papíře chromatografický papír mikroskop, podložní sklo tepelná amidočerň 10B zředěná kyselina octová fotometrický dlouhá doba dělení První typ elektroforézy používaný v klinické praxi Elektroforéza na papírovém nosiči 4-Albumin ■ ^-Atfal globulíny <_Alfa2 globulíny <- Beta globulíny <- Gama globulíny Typ: ELFO na agaru Nosič: agaróza + agaropektin Nanášení: papír, hřeben, fólie Denaturace: kyselina octová Barvení: anionická barviva Odbarvení: kyselina octová Hodnocení: vizuálně Poznámka: elektroendoosmóza Typ: ELFO na agaróze Nosič: agaróza Nanášení: hřeben, fólie Denaturace: kyselina pikrová Barvení: anionická barviva Odbarvení: kyselina octová Hodnocení: vizuálně nebo denzitometricky Poznámka: automatizace HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 etf^'W Sefaia ^ 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 CTl Agaróza Agaróza je polysacharid z mořských řas. ^ Jde o lineární polymer galaktózy a 3,6 - a n hyd roga laktózy. ^ Rozpouští se v horké vodě a po ochlazení tuhne. Tvoří dvoušroubovice ve svazcích, které se spojují do trojrozměrné struktury. Vodíkové vazby. ^ Vysoké koncentrace agarózy generují gel s malými póry a naopak. 1% gel má póry 150 nm. Agarózový gel má větší póry než PAG - větší molekuly snadněji putují v agaróze. Přítomnost reziduálních nábojů generuje elektroendoosmózu (použít extrémně čistou) Typ: ELFO na acetylcelulóze Nosič: acetylcelulóza (celulóza + anhydrid.oct.) Nanášení: speciální tiskátko Denaturace: kyselina trichloroctová Barvení: anionická barviva Odbarvení: směs - metanol + kyselina octová Hodnocení: denzitometricky (po zprůhlednění) Poznámka: dovozové fólie Zprůhledňovací směs: Metanol s ledovou kyselinou octovou Cyklohexanol Typ: ELFO na polyakrylamidu H II H2C=C^C- NH2 + O H 1] ^C—C NH 'CH Acrylamide Methylenebisacrylamide persulfate s2ty 2 SO, CONH. CONH CH2—CH—CH2—CH 2 CH- sulfate free radical CH- I CONH CH. CONH —CH2—CH—CH2—CH—CH2—CH- CONH, CONH- Polyakrylamidový gel Tvořen polymerací akrylamidu a N,N'-metylenbisakrylamidu v pufru, zahájenou volnými radikály. Ty vzniknou při rozkladu persíranu amonného nebo při rozložení riboflavinu v přítomnosti 02. Fyzikální vlastnosti gelu a velikost pórů dány podílem polyakrylamidu v gelu a stupněm zesíťování. D Nejčastěji používané koncentrace polyakrylamidu jsou 5-10%. D Koncentrace N,N'-metylenbisakrylamidu je obvykle 5% celkového množství akrylamidu. D Podpůrná matrice je prakticky nenabita. barvičky: Amidočerň 10 B, Coomassie Brilliant Blue, Ponceau S, Bromfenolová modř, Kyselá violeť, barvení stříbrem (není kvantitativní ale je 50x citlivější než coomassie: Ag+ ionty se v proteinech vážou na -SH a -COOH skupiny) Coomassie Brilliant Blue R-250 Coomassie Violet R -150 Denzitometrické vyhodnocení Normální nález „M" gradient 1 2 34 5 6 789 10 11 12 1. prealbumin 8. Transferin 2. albumin 9. Beta-lipoprotein 3. a-lipoprotein, a-fetoprotein 10. C3 4. Al AT, o roso m u ko i d 11. IgAJgM, fibrinogen, „M", VLŘ 5. a1antichymotrypsin/ Gc 12. IgG, CRP, „M" VLŘ globulin 6. A2M,Hp 7. hemoglobin Klinické vztahy frakce Snížení zvýšení Albumin Malnutrice a malabsorpce Těhotenství Onemocnění ledvin (zejména NS) Onemocnění jater Zánětlivé stavy dehydratace ocl Kongenitální emfyzém (nedostatek aat) Těžká jaterní onemocnění akutní nebo chronická zánětlivá onemocnění oc2 Hypertyreóza Vážná jaterní onemocnění Hemolýza Onemocnění ledvin (NS) Akutní nebo chron. onem. P Malnutrice Cirhóza Hypercholesterolémie Anémie z nedostatku Fe Některé případy MM nebo MGUS Klinické vztahy frakce Snížení Zvýšení Y různé druhy geneticky podmíněných poruch imunity sekundární imunodeficience Polyklonální: - chronická zánětlivá onemocnění - revmatoidní artritída - systémový lupus erythematosus - cirhóza - chronická jaterní onemocnění - akutní nebo chronická infekce - nedávná imunizace Monoklonální: - Waldenstrômova makroglobulinemie - Mnohočetný myelom - Monoklonální gamapatie nejasného významu (MGUS) Elektroforéza bílkovin séra (pozice 2, 5,7,9-11,13-16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30) a moče (pozice 1, 3,4, 6, 8,12, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29) - Hydragel 01-02 15/30 (Sebia) Paraprotein v pozicích 6 (moč), 16 (sérum), 20 (sérum), 22 (sérum), 23 (moč), 24 (sérum), 25 (moč - v beta frakci), 28 (sérum) a 30 (sérum); v sérech na pozicích 20, 22, 28 a 30 je patrná výrazná redukce polyklonálních gamaglobulinů; zvýšená frakce alfa2-globulinů v pozicích 2,10, 24, 30 (séra) K 4 b S ' v 5 10 tl 1» 13 14 IS ■l Screeningová imunofixace (Hydragel Penta 6/12 IF, Sebia) Elektroforetická stopa a vpravo od ní stopa stejného vzorku fixovaného s pentavalentním antisérem (G, A, M, kappa, lambda) pozitivní výsledek imunofixace M-lg atypicky migrujícího v zóně alfa2-globulinů (horní řada, 4. stopa zleva - sérum), ve všech ostatních vzorcích je výsledek screeningové imunofixace negativní 11 ■ Vi • llil Typizace paraproteinu - elektroforéza s následnou imunofixací ELP - elektroforéza s fixací všech bílkovin; G, A, M, K, L - stopy se selektivní fixací antiséry proti řetězcům y, a, [i, k, X vlevo dole: volné kappa v moči; vpravo dole: fyziologický nález (polyklonální Ig); vlevo nahoře: paraprotein IgMK v séru; vpravo nahoře: volné k v moči u téhož pacienta ELP G A U K L ELP G tk H K L Imunofixace - problematické nálezy monoklonální IgM kappa s aktivitou revmatoidnfho faktoru (RF129 lU/mL) IF s Fluidilem IF s beta-merkaptoethanolem =■ -i ELP G A M K L © Průkaz asialotransferinu (elfo s imunofixací- Sebia) Metoda používaná k průkazu přítomnosti likvoru v sekretech. V likvoru je poměr A/D > 1, v séru <1; poměr A/D v sekretu s příměsí likvoru je vyšší než v séru. Elektroforéza hemoglobinu Hydragel 7 Hemoglobin(e), Sebia vzorky 1 a 2: frakce HbA2 > 15%, což značí pravděpodobnou přítomnost HbC nebo HbE vzorky 3-6: normální nález vzorek 7: kontrola 7 HEMOGLOBIN( E) 1 2 3 4 S S sebia Elektroforéza izoenzymů alkalické fosfatasy (Hydragel 15 ISO-PAL, Sebia) v pozicích ľ, 2', 3',... je kostní izoenzym vyvázán přítomným lektinem blízko startu v pozicích 2, 2' je patrná střevní frakce (I) v pozicích 6, 6' je výrazná druhá jaterní frakce (L2) 15 ISO-PAL 5 6 7 B 9 10 11 12 13 14 15 I 1 ľ 2 2* 3 3' 4 41 S 5' 6 6" 7 T CTL Co+ Co- Cl SI C2 S2 C3 S3 C4 S4 C5 S5 C6 S6 C7 S7 C8 S8 I Co+ Co- Cl SI C2 S2 C3 S3 C4 S4 C5 S5 C6 S6 C7 S7 C8 S8 IEF a detekce o-lgG: Metody Zeman D et aI. Ces Slov Neurol N 2019;82/115(l):68-75 • Agarosový gel, imunofixace v gelu (Hydrasys, Sebia) - AGA IEF/IF • Polyakrylamidový gel (Flatbed Professional, EDC), imunoblotting-PAG IEF/IB • Obě metody poskytly prakticky shodné kvalitativní výsledky Klasifikace nálezů o-lgG - 5 typů podle mezinárodních doporučení Andersson M et al. J NeurolNeurosurg Psychiatry 1994;57:897-902 Freedman MS et al. Arch Neurol 2005;62:865-70 Typ 4 Typ 5 CSF S CSF S • Typ 1: jen „polyklonální" IgG v likvoru i séru • Typ 2: >2 IgG pásy v likvoru, jen „polyklonální IgG v séru • Typ 3: IgG pásy shodné v likvoru i seru + IgG pásy přítomné pouze v likvoru • Typ 4: IgG pásy shodné v likvoru i seru • Typ 5: monoklonální IgG v likvoru i seru Oligoklonální IgG - typy IEF nálezu: IEF/IF (Sebia) typ 1 - typ 2 - typ 3 - typ 4 - typ 5 dvojice likvor (vlevo), sérum (vpravo) lEF v polyakrylamidovém gelu (Pannewitz-Makaj K et al, Diagnostics 2021, 11(1): 37) OCB patterns Vzorek EHK (SEKK 2/2016): Typ 4 nebo Typ 5? Oligoklonální volné lehké řetězce (o-fLC) Zeman D et al., PLoS ONE 2016;ll(ll):e0166556 agarose Cg+Co-ClSlCldSlC2S2C3S3C4S4 0,8 pro všechna srovnání) Počet pásů poněkud vyšší v PAG Klinické korelace lepší v PAG (cut-off 6 o-fKLC pásů) Výtečná shoda mezi hodnotícími (kappa > 0,9 pro všechna 4 srovnání) o-lgM u pacientky s RS při diagnostické LP (A), po 18 měsících bezprostředně před AHSCT (B) a po dalších 12 měsících (C) Oligoklonální IgA pH gradient 4-8, anodická aplikace, bez prefokusace pozitivní nález ve vzorku 3 (pacientka s CIS) Kapilární elektroforéza (CE) - princip Dělení v křemenných kapilárách Dvě elektrody Dva rezervoáry pro pufry Zdroj vysokého napětí (+/- 30 kV) On-column detektor V obvyklém uspořádání: Aplikace k anodě, detekce u katody; vlive elektroosmózy migrují nakonec ke katodě i kladně nabité částice Kapilární elektroforéza (CE) - nástřik (injekce) vzorku 2 ť • oInj2 ... rozptyl přídatného rozšíření píku • /... délka pravoúhlého injekčního profilu • Reprodukovatelná injekce velmi malých objemů (nL až |iL) se děje formou - hydrodynamického nástřiku - elektrokinetického nástřiku Kapilární elektroforéza (CE) - detektory • Absorpční - UV-detektor - detektor diodového pole • Fluorescenční - excitace lampou - excitace indukovaná laserem • Hmotnostní spektrometr • Elektrochemický • Radioizotopový • Vodivost ní • Indexu lomu • Nukleární magnetická rezonanční spektrometrie Kapilární elektroforéza (CE) - metody metoda zkratka Dělení podle Aplikace Kapilární zónová elektroforéza CZE Velikosti/náboje (mobility) Malé ionty, peptidy, proteiny izotachoforéza ITP Velikosti/náboje (mobility) Malé ionty, proteiny Kapilární afinitní elektroforéza ACE Velikosti/náboje (mobility) Interakce ligandů Bezvodá kapilární elektroforéza NACE Velikosti/náboje (mobility) Malé ionty s malou rozpustností ve vodě Micelární elektrokinetická chromatografie MEKC/MECC Hyd rofobicity/ná boje Neutrální částice Kapilární gelová elektroforéza CGWE velikosti Proteiny, DNA Kapilární elektrochromatografie CEC Chromatografická retardace Malé ionty a neutrální částice Izoelektrická fokusace CIEF Náboj (izoelektrický bod) Proteiny