Molekulárně biologické metody v mikrobiologii Monika Dolejská Oddělení klinické mikrobiologie Ústav laboratorní medicíny Fakultní nemocnice Brno fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Obsah prezentace • Historie, vývoj a trendy klinické mikrobiologie • Základní metody v molekulární mikrobiologii • Nové technologie v mikrobiologické diagnostice • Nové diagnostické přístupy Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Historie klinické mikrobiologie Antoni van Leeuwenhoek Robert Koch (1843 _ 1910) (1632 - 1723) _Joseph Lister (1827 - 1912) Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Historie klinické mikrobiologie • Období "lovců mikrobů" Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Historie klinické mikrobiologie t eJ: — » Objev a zavedení antibiotik Alexander Fleming (1881-1955) imunologie, sérologie ^ „Klinická mikrobiologie' V Virologie a mykologie Rozvoj nových metod E fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Kultivace mikrobů • Omezený počet kultivovatelných mikrobů • I v rámci jednoho druhu nebo úzce příbuzných taxonů dochází k významnému rozdílu ve virulenci (např. Escherichia coli vs. Shigella spp., Bacillus anthracisvs. Bacillus, cereus) CDC, Atlanta Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Mikrobiologická diagnostika • Virologie - Sérologie - Molekulární genetika - Kultivace - Elektronová mikroskopie * Bakteriologie a mykologie - Kultivace - Mikroskopie - Molekulární genetika - Sérologie * Parazitológie - Mikroskopie - Sérologie - Molekulární genetika Efakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Současné potřeby mikrobiologické diagnostiky Rychlost Přesnost Klinická validita 60 50 51 40 (D 3 20 10 □ Survivors M Non-sii rvivors Nutrí of Patients M ortafity < 1 lir 24 8 3% —i- -r L to < 2 lirs 2 to < 3 hrs 31 6.5% 23 4 3% 3 hrs 52 21 2% Published in final edited form as: Ciif Care Med. 2014 November ; 42(11): 2409-2417. doi:10.1097/CCM.0000000000000509. Delayed Antimicrobial Therapy Increases Mortality and Organ Dysfunction Duration in Pediatric Sepsis Scott L. Weiss, MD1. Julie C. Fitzgerald, MD. PhD1, Fran Balamuth, MD. PhD2, Elizabeth R. Alpern, MD, MSCE3, Jane Lavelle, MD2, Marianne Chilutti, MS4, Robert Grundmeier, MD45, Vinay M. Nadkarnt, MD, MS1, and Neal J. Thomas, MD, MSc6_ fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Diagnostické metody v mikrobiologii Kultivační metody Automatické systémy Analýza obrazu Molekulárně - genetické metody Amplifikační techniky Mikročipy Funkční metody Hmotnostní spektrometrie Další spektroskopické metody Celogenomová sekvenace fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Speciální mikroskopické techniky Průtoková cytometrie Koncepce mikrobiologie - Marseilles Velká laboratoř - univerzitní nemocnice Důraz na konzultační službu Priority při zpracování vzorků 14.000 7,000 4,000 2,000 Year Left-hand axis > Number of bacterial specieswith validly published names Right-hand axis ■ Number of sequenced bacterial genomes ■ Number of virai species identified ■ Number of sequenced viral genomes Modern clinical microbiology: new challenges and solutions Pierre-Edouard Fournier, Michel Droncourt, Philippe Coison, Jean-Marc Roiain, Bernard La Scoia and Didier Raoult S7A 1 AUGUST 2013 | VOLUME 11 ©2D13Macmillan Pun ishers Limited. All rights reserved Core laboratory Direct examination and culture I Gram staining Automated Diversified blood culture culture monitoring conditions Phenotypic identification and antibiotic-susceptibility testing Manual biochemical phenotype Antibiogra-m L, Sequencing Metagenomics Automated biochemical M ALDI-TO F VIS phenotype and anti biogram Phenotypic microarray Unidentified or f unusual bacterium Molecular detection and identification Transport New or atypical bacterium Point-of-care laboratory Syndrome- and disease-based sampling Chromatographic or agglutination assay Local, national and/or international alert Real-time genome sequencing 5M5 message, laboratory website Strain collection E fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Koncepce mikrobiologie - Marseilles • Satelitní POCT laboratoře Fever in returning travellers Plasmodium spp. Dengue virus Pneumonia Influenza viruses Respiratory syncytial virus Mycoplasma pneumoniae Bordetella pertussis Staphylococcus aureus Fne Eimocys tts jirovecii Legionella urinary antigen Pneumococcal urinary antigen Sink DNAextractor Thermal Computer—^] cycler—J == Vortex--P~| Drybatli— incubator Point-of-care laboratory --20° C freezer -BSL3 hood -Centrifuge Castroenteritis Rotavirus Ad e no vi ruses Clostridium difjicife Helicobacter pylori '-t-4" C refrigerator Sexually transmitted diseases Neisseria gonorrhoeae Herpes simplex virus HIV Chlamydia trachomatis Pharyngitis Streptococcus pyogenes Epstein-Barr virus Meningitis Enteroviruses Varicella-zo sie r vi ru s Strep tococcus pneumoniae Pneumococcal urinary antigen Cryptoeoccus neoformans fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Molekulární metody v klinické mikrobiologii Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Nevýhody tradičních metod • Nedostatečná citlivost pro některé mikroby • Limitace na patogeny se známými růstovými parametry • Špatné odlišení mezi mikroby s běžnými vlastnostmi • Neschopnost průkazu infekcí vyvolaných nekultivovatelnými (novými) mikroby Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Nevýhody tradičních metod Příklady: • Průkaz a identifikace pomalu rostoucích a obtížně kultivovatelných mikrobů - M. tuberculosis, Borrelia burgdorferi • Nekultivovatelné bacily vyvolávající Whippleovu chorobu • Nemoci, o nichž se předpokládá, že jsou infekční, zůstávají špatně definovány bez detekovaného mikroorganismu - náhlá horečka po přisátí klíštěte • viry: virové průjmy, virus vztekliny, viry chřipky, virus hepatitidy B a C, enteroviry, adenoviry, RS-virus, viry parainfluenzy, herpex simplex virus, virus příušnic Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Molekulárně-biologické techniky - Polymerázová řetězová reakce (PCR) - průkaz DNA - PCR s reverzní transkripcí (RT-PCR) - průkaz RNA - Real-time PCR (RT-PCR) - Microarray - Hybridizace - DNAsekvenování Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno PCR 1983 Kary B. Mullis -> Nobelova cena 1993 Mnohonásobné zmnožení (amplifikace) specifického úseku DNA in vitro na principu replikace Široce používaná technika pro průkaz mikrobů ve vzorku Použití sekvenčně specifických primem Vysoká citlivost (detekce i jedné buňky) Průkaz amplifikačního PCR produktu značí přítomnost mikroba fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno PCR - základní kroky • Izolace DNA (fenol-chloroform, silikagely, magnetické částice) • Amplifikace specifického úseku DNA • Detekce produktu amplifikace - gelovou elektroforézou - použitím fluorescenční sondy Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Automatizace izolace NK Sample Preparation a Pre-Ueatment Nuclei c Acid Extraction 1 1 Add Proteinase KS Incubalion at 60 C Tissue lysis ŕu ff er fcr 2tir - O/N Take the supernatant onfy # TJ * | Sovire tissue HomogeniiatiOn AckJ Proteinase K Incubation Take Ihe (tO-A0mg) wilh LN2 & Tissue lysis buffer a1 50 C Tor 1-2hr supernatant cnTy *n•S • t * y Load into the Tissue Add Tissue lysis Homogenizalion Take the filtrate filter tube butter with Tissue miner only ProlKíi! Set-Up (Protocol fl : 102) Ge-cmic ONA Ěxlradian „Otevřené" a „uzavřené" systémy T* IL ■ &é JSA ■V" II :a- jj. tu 1 Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Složení PCR směsi voda nukleotidy (dNTP) reakční pufr primery termostabilní DNA polymeráza templátová nukleová kyselina (DNA) případné látky (BSA, DMSO, Tween 20, glycerol, spermidin, minerální olej) Cyklus číslo Počet nových dvouřetězcových molekul 1 1 2 3 3 7 4 15 5 31 6 63 7 127 8 255 9 511 10 1 023 11 2 047 12 4 095 13 8 191 14 16 383 15 32 767 16 65 535 17 131071 18 262 143 19 524 287 20 1 048 575 21 2 097 151 22 4 194 303 23 8 388 607 24 16 777 215 25 33 554 431 26 67 108 863 27 134 217 727 28 268 435 455 29 536 870 911 30 1 073 741 823 fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Denaturace vzorku DNA Pro oddělení řetězců dsDNA (94 °C, 5 min) Připojení primem na řetězce DNA (30 - 65 °C, 1 min) mmm Denaturace pro separaci řetězců DNA (94 °C, 30 s) 25 - 35 x Syntéza nových řetězců DNA polymerázou (72 °C, 45s - 2 min) fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ (A) / dvoušroubovice DNA \ zahřátí K ODDĚLENÍ ŘETĚZCŮ 1. krok HYBRIDIZACE PRIMERŮ 2. krok první cyklus -DNA polymerAZa +dATP +dGTP +dCTP +dTTP syntéza DNA z primem 3. krok Průběh PCR (B) oddělení řetěxců DNA a přidání primeru syntéza DNA oddělení řetězců DNA a svázání s příměrem syntéza DNA oddělení řetězců DNA a svázání s příměrem syntéza DNA / \ i—r L J DNA-oligonukleotidové primery oblast dvouřetězcové chromosomální DNA, kterou množíme první cyklus (tvorba dvou dvou řetězcových molekul DNA) \ ~i i \. i—r "i—i 33 i—r n—i ~i—i / druhý cyklus (tvorba čtyř dvouřetězcových molekul DNA) i—r □ i—r n—i "i i atd. "i—i "i i ~i—i třetí cyklus (tvorba osmi dvouřetězcových molekul DNA) Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Interní kontrola v PCR • dochází k tzv. inhibici reakce (běžné) • inhibice reakce je dána přítomností různých interferujících látek (např. z rukavic) • pro detekci použita směs, obsahující kromě vzorku a jemu příslušných primem ještě kontrolní DNA a druhou sadu primem • pozitivita IC - nedošlo k inhibici reakce • IC může být negativní u vysoce pozitivních vzorků (reakce kompetují o nukleotidy) Efakultní nemocnice BRNO https://www.fnbrno.cz/ Typy PC R • „klasická" PCR: end-point analýza (po proběhnutí všech cyklů analýza produktů gelovou elektroforézou) • real-time PCR: sledování amplifikačních produktů po každém proběhlém cyklu („in real time"), nejčastěji používána kvantitativně (qPCR) • reverzně transkripční PCR (RT-PCR): analýza RNA; samotné PCR předchází přepis RNA do cDNA reverzní transkriptázou • qRT-PCR (RT-qPCR): kvantitativní (real-time) reverzně transkripční PCR Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Typy PCR • specifická PCR (specifický gen pro enzym, faktor patogenity apod.) • univerzální PCR (cílové místo je gen, který mají všechny bakterie, nejčastěji gen pro 16S rRNA) • multiplex PCR (několik specifických cílových míst v jedné reakci) • nested PCR (dvě sady primem použité ve dvou následujících PCR; omezuje vznik nespecifický produktů) Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Multiplex PCR • Reakční směs obsahuje ne jeden, ale několik párů primerů rozpoznávajících různé cílové sekvence • Detekce několika genů/produktů současně v jediné reakční směsi • Výhoda - simultánní detekce více agens, nižší náklady než při jednotlivých PCR dělaných zvlášť • Nevýhoda - reakci je nutno velmi důkladně optimalizovat vznikající produkty musí být různě dlouhé, aby je šlo současně detekovat při elektroforéze nutno vyvažovat poměry koncentrací primerů (ve směsi se chovají jinak než jednotlivě); kompetice o „zdroje" (zejm. polymerázu), nebezpečí preferenční amplifikace jednoho fragmentu na úkor ostatních dále roste důležitost pozitivních a negativních kontrol Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Real-time PCR též kvantitativní PCR (qPCR) umožňuje detekci a kvantifikaci produktu PCR v průběhu reakce (ne až po ní jako při konvenční PCR) - přidaná hodnota proti běžné PCR extrémně vysoká citlivost využití pro studium genové exprese, diagnostiku patogenů... princip: detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu produkovaného při syntéze PCR produktu v tzv. light-cycleru - termocykler se zabudovaným fluorimetrem, tj. přístroj, který kromě cyklického střídání teplot umožňuje detekci fluorescence a monitorování průběhu PCR kvantitativní vztah mezi množstvím PCR produktu a intenzitou fluorescence Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Real-time PCR - detekce amplikonu Využívá tzv fluoroforů - molekul, které po předchozí absorpci světla určité vlnové délky emitují světlo jiné vlnové délky (vždy vyšší, protože nižší energie) nespecifická • interkalační barviva specifická - oligonukleotidy s fluoroforem • TaqMan sondy • FRET • molekulární majáky • citlivější a dražší tyto sondy (oligonukleotidy komplementární k PCR produktu) mimo fluoroforů často obsahují i zhášeč - molekulu, která zachytává fluorescenci fluoroforů, brání detekci signálu před navázáním sondy (tj. před vznikem produktu) ]. SYRR Green II, Hyhridizaiion Pro Iv s [|[. TaqMan Probes E fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Real-time PCR - detekce amplikonu hybridizační sondy (FRET) - Fluorescence Resonance Energy Transfer i i i i AKCEPľOR DONOR "FT"I—P" FRET i i i i i i i i i i i i i i 1 ■ ■ ^f' ....... EMISE FLUORESCENCE AKCEPTORU hydrolyzační sondy (TaqMan®) REPORTER QUENCHER ZHÁŠENÍ EMISE FLUORESCENCE 5^3'EXO E fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Real-time PCR - detekce amplikonu Molekulární majáky O Denaturation R Q Hybridization L® n rnr:;*| 8 Fluorescence proportional to target abundance sonda hybridizovaná s cílovou sekvencí —> molekula reportéru je separovaná od quencheru —> emise —> fluorescence E fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Real-time PCR - princip kvantifikace stanovení tzv amplifikačního prahu detekce amplifikační práh detekce - Ct (threshold cycle) fáze celého procesu, kdy začíná exponenciální nárůst množství PCR produktu (vlastně číslo, udávající, ve kterém cyklu k nárůstu došlo) určený na základě hodnoty fluorescence pozadí a vzorku v exponenciální fázi čím menší Ct (čím dřív růst začne), tím větší počet kopií templátu vstoupil do reakce; rozdíl 1 Ct teoreticky odpovídá dvojnásobnému množství templátu Subset Editor ,„3Bl. r^ JBu.,ťJ. = - loJ i/^J I./+J l/Ť J lllPlllil'ilfilTlR'l 1Í11117 111d ľi 1ŕ 17 1fl 11 ?fl ?1i??l?ll?dl T Sample Editor Analysis Report rrrrrrrrrrrrrrrrrrrnrrrr rrrrrrrrrrrrrrrrrrrr rrrr rrrrrrrrrrrrrrrrrrrr rrrr rrrrrrrrrrrrrrrrrrrr rrrr rrrrrrrrrrrrrrrrrrrr rrrr rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr : "rrrrrrn 'rrr "rrrrrr rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr Hrrrrrrrrrrrrrrnsrrrrrm J M H 1 ► 1"- IaIds Quant r esults J II Positive P Negative | Unce . Standard Samples Resi; Include Color Pos 1 Name Cp Coi cenlratir E ■ E ■ t ■ H ■ E ■ * ■ A.2 0 Sample 20 B2□ Sample 44 C20 Sample 68 D20 Sample 92 E2□ Sample 116 F20 Sample 140 24,02 24,11 19, 63 19, 62 32 ,47 32 ,44 E fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Real-time PCR - princip kvantifikace Real-time PCR - kvantifikační strategie Absolutní kvantifikace pomocí externí kalibrační křivky srovnání hodnot Ct jednotlivých vzorků s Ct externího standardu o známé koncentraci Výstup - absolutní hodnota (koncentrace, množství DNA...) Relativní kvantifikace - normalizace pomocí jednoho či více referenčních genů v tomtéž vzorku nevyžaduje externí standard výstup - relativní hodnota - kolikrát více/méně templátu ve srovnání s referenčním genem v tomtéž vzorku význam - např. analýza exprese genů - srovnání, jak je exprese určitého genu intenzivní či jak se mění ve srovnání s referenčním genem se stálou expresí nutná normalizace výsledků - koriguje variabilitu mezi jednotlivými vzorky způsobenou charakterem vzorků, pipetovacími chybami, kolísající efektivitou reverzní transkripce atd. Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno PCR diagnostické kity • CE IVD • Die patogenu • Soubor patogenu spojených s chorobou Respiratory Infections Gastrointestinal Tract Infections Human Papillomavirus Infections Sexually Transmitted Infections Tuberculosis Drug Resistance Sepsis Meningitis Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Allplex™ Respiratory Panel 1 Anafytes ■ influenza A virus (Flu A) ■ Influenza A HlpdmOQ (Flu A Hlpdmü9) ■ Influenza B vlnjs (Flu B) ■ Respiratory syncytial virus B (RSV B} ■ Influenza A-HI (Flu A-Hl) ■ Influenza A-H3 (Flu A-H3) ■ Respiratory syncytial virus A (RSV A) ■ Internal Control (IC) Specimens Cat No /Size ■ Nasopharyngeal swab ■ Bronchoalveclar lavage ■ RPiai79Z/25rxns''' ■ RP9801X/ TOO rxns I11 ■ Nasopharyngeal aspirate ■RPgBÜlV/ 50rxns Allplex™ Respiratory Panel 2 Analytes ■ Adenovirus (AdV) ■ Metapneumovirus (MPV) ■ Parainfluenza vims 2 iPIV 2) ■ Parainfluenza vims 4 (PIV 4) ■ Enterovirus (HEV) ■ Parainfluenza virus 1 (PIV 1) ■ Parainfluenza virus 3 (PIV 3) ■ Internal Control (IC) Specimens Cat No./Size Nasopharyngeal swab Bronchoalveolar lavage RPlülflOZ/ 25 rxns [" RP9802X /100 rxns m ■ Nasopharyngeal aspirate ■ RP9B02Y / 50 rxns Allplex™ Respiratory Panel 3 Anatytes ■ Bocavirus 1/2/3/4 (HBoV) ■ Coronavirus NL63 (NL63) ■ Human rhinovirus (HRV) ■ Coronavirus 229E (229E) ■ Coronavirus 0C43 (0C43) ■ Internal Control (IC) Specimens Cat Nov Size ■ Nasopharyngeal swab ■ Bronchoalveolar lavage ■ RPiai81Z/25rxnsl'] ■ RP96(TSX/ TOO rxns W ■ Nasopharyngeal aspirate ■RP9b01Y/ 50 rxns Allplex™ Respiratory Panel 4 Analytes ■ Bordetella Parapertussis (B PPJ ■ Chtamydophiia pneumoniae (C P) ■ Legionella pneumophila (LP) ■ Streptococcus pneumoniae (SP) Bordetella pertussis (BP) Haemophilus influenzae (HI) • Mycoplasma pneumoniae (MP) Internal Control (IC) Specimens Cat No ./Size ■ Sputum ■ Nasopharyngeal aspirate ■ RP10TB2Z/25rxns W ■ RP9803X /100 rxns [1' ■ Nasopharyngeal swab ■ Bronchoalveolar lavage ■ RP9BU3Y / 5D rxns fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Allplex™ Gl-EB Screening Anaiytes ■ Campylobacterspp. (Cam) ■ Escherichia colt 0157 (£ ee#Ö?57) ■ Stogeffla Bpp./Eltd51 (Sh/EI) ■ Yersinia enterocolitica (Yer) ■ Clostridium difficile toxin A/B (CdA/B) ■ Salmonella spp. (Sal) ■STEď*l(sftfľ/^ ■ Internal Control ■ Giardia lamblia BIOFIRE® FILMARRAY® Pneumcnia Panel p/t/s je komplexním souběžným testování pro 27 nejvíce známých patogenů způsobujících LRTI a 7 genů antibiotické rezistence. Bakterie (sem i kvantitativní) Geny antibiotické rezistence Acineiobacter calcoaceticus-baumannii complex ESBL Enterobacter cloacae CTX-M Escherichia coli Haemophilus influenzae CarĽapenemases Klebsiella aerogenes KPC Klebsiella oxytoca N DM Klebsiella pneumoniae group Oxa4fí-like Moraxella calarrhalis VIM Proteus spp. IMP Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens Methicilin Resistance Staphylococcus aureus mecA/m&cC and M RE J Streptococcus agalactiae Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Atypické Bakterie-{Kvalitatívni] lfiry Legionella príl.moprT-řla Influenza A Mycoplasma pneumoniae Influenza & Chlamydia pneumoniae Adenovirus Coronavirus Para infI uenza virus Respiratory Syncytial virus Human Rhinovirusj'Enterovirus Human Metapneumovifus Middle East Respiratory Syndrom« Coronavirus (MERS-CoV)* * MERS-CoV will only be available on the Pneumonia Panel plus Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Automatizované systémy v diagnostice - POCT Sample Influenza A/B+RSV SARS-CoV-2+lnfluenza A/B Streptococcus pyogenes skupiny A Clostridium difficile Start fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Metody sekvenování N K • stanovení pořadí nukleotidů v molekule DNA (primární struktury) • význam: odvození informace o aminokyselinové sekvenci kódovaných proteinů, regulaci jejich tvorby charakterizace mutací např. způsobujících genetické choroby charakteristika příbuznosti organismů a mnohé další Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Metody sekvenování NK • Chemická metoda (Maxamovo-Gilbertovo sekvenování) • Enzymatická metoda (Sangerovo sekvenování) • Pyrosekvenování • Sekvenování nové generace (NGS) Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Enzymatická (Sangerova) metoda • Založená na asymetrické PCR - do reakce vstupuje pouze jeden primer (sekvenujeme-li produkt PCR, používá se nejčastěji jeden z primem použitých při PCR, případně oba ve dvou oddělených reakcích) • Reakční směs oproti běžné PCR obsahuje navíc tzv. dideoxynukleotidy • Frederick Sanger (1977) • Komercializace Applied Biosystems • Nejpoužívanější metoda po 40 let • Dnes postupně nahrazována NGS Efakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Enzymatická (Sangerova) metoda Reaction Mixture Primer Template "TTTTTrTlT "' y^^^^^^^^^^^^+s ddNTPs ddTTP • ddCTP < ddATP • ddGíľPÍ DNA Polymerase I i i i i i i i i i r i i Primer elongation and chain termination "I™,-T> T-i—r1 i i ■ i' 1 I I l I * 3' TT'ff 3' 1 Laser Detector Capillary gel Capillary gel separation of DNA fragments Detection of fluorophores Chromatograph Sequence analysis done by computers fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Hodnocení dat 10 20 30 40 SO ÉG 70 SD 30 1ÜD HO 120 AGG AÖGGTATJU Ät GCT AG A AT T G Gľ A Gl' T CT G AG AAT.íf C C C i AAAT ÄT AT A GC T A A AGCl'AA G G At AAAA A'ľ G AT CC G'ľ i! AG GTTÜÄTA GGC TT C G GT GAT C G"ľ G ľ .Vľ ATA AAAAJS TA 130 14« ; C G.-'. ľ C C AC G TG C C GC AG T AT T T A\ A G. / d 11 1 1 I n 1 ľ Li il Ml IM N í I1 'i 1 Přiřazení sekvence známému organismu • bioinformatické přístupy: - BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (NCBI) -další (specializované) databáze: 16SpathDB • vyhledávání podobností v databázi 240 C T T A AAG AT G. lAT A E fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Sekvenování nové generace • Poptávka po nízkonákladovém sekvenování vyvolala tlak na vývoj „high-throughpuf metod • Princip - paralelizace procesu sekvenování • Produkce tisíců až milionů sekvencí současně • Výstupem obrovský objem dat, který je třeba zpracovat/roztřídit • Poprvé v historii problém ne s tím jak data získat, ale smysluplně je interpretovat, vytěžit • Využití obecně - získání velkého množství sekvenční informace (o celém genomu, nebo o mnoha kopiích určitého úseku DNA, nebo o mnoha genomech současně - metagenomika) Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Sekvenování nové generace - platformy • Různé technologie, přístupy, mají své výhody i nevýhody, vhodné pro různé aplikace • Obecné schéma obvykle podobné: ( 0. izolace celogenomové DNA - získáme mnoho kopií genomové DNA) 1. Příprava tzv. knihovny - fragmentace genomové DNA na fragmenty o délce řádově stovky bp dlouhé (např. ultrazvukem, proudem dusíku aj.) 2. Zatupení konců fragmentů a ligace tzv. adaptérů - krátkých oligonukleotidů, od kterých pak probíhá sekvenování jednotlivých fragmentů (vážou se k nim primery; všechny fragmenty se tedy sekvenují stejným primerem) (3. Namnožení klonů jednotlivých fragmentů - např. emulzní PCR) - NGS metody 3. generace už nevyužívají 4. Vlastní sekvenování - zpravidla na základě detekce toho, jaká báze se právě začlenila do vznikajícího řetězce Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Sekvenování nové generace - platformy 454 (Roche) lllumina Ion Torrent (Life Technologies) SOLiD (Life Technologies) PACBIO (Pacific Biosciences) Oxford Nanopore (MinlON...) 2. generace sekvenování — 3. generace sekvenování Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno 454 pyrosekvenování • firma Roche • modely 454 GS Junior (35 MB) x 454 GS FLX (700 MB) • příprava knihovny: nebulizace tekutým dusíkem • příprava vlastního templátu pro sekvenování: emulzní PCR na kuličkách (beads); na každou kuličku se váže jeden fragment původní knihovny; kriticky důležitá koncentrace DNA v knihovně (aby na každou kuličku připadal jen jeden fragment) • Po PCR na každé kuličce navázáno mnoho kopií příslušného fragmentu • Sekvenace syntézou v mikrojamkách (objem v pl, v každé jedna kulička), detekce chemiluminiscenční - pyrosekvenování Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno 454 pyrosekvenování in PicoTrler Plate™ U9m+0'"j:"i"n 4) Perform sequencing-by-synthesis on the 454 Sequencer CSB2008 August 2008 UCSC Sequencing Center fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ lumina • různé modely platforem • příprava templátu: hybridizace na sklíčku, tvorba clusterů (shluků) na pevné destičce, tj. ne v kapce (emulzi); každý cluster opět obsahuje klony (kopie) téhož fragmentu • sekvenace syntézou (SBS - sequencing by synthesis) • detekce fluorescence odštěpené značky z reverzního terminátoru (nukleotidu) -pokud se začlení, vidíme (různo)barevnou fluorescenci • opět paralelní analýza mnoha clusterů současně Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno na analýza obrazu - určení sekvence v jednotlivých k la střech Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno 42 Fragments Add adaptors Attach to flowcell Bind to primer Cluster formation ■ . .. PCR extension tT Dissociation ////////////// až 1000 kopií fragmentu na |im2 povrchu sequencing Signal scanning • na celém povrchu až 10 milionů shluků na cm2 Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno lumina MiniSeq MiSeq NextSeq 500 HiSeq 4000 NovaSeq Run Time 24 hours 56 hours 29 hours 3.5 days 40 hours Read length (pb) 2x 150 2x 300 2x 150 2x 150 2x 150 Read number 50 106 50 106 800 106 5 109 3.3 109 Ouput 7.5 Gb 15 Gb 120 Gb 1,500 Gb 1,000 Gb Throughput 7 Gb/day 7 Gb/day 100 Gb/day 430 Gb/day 500 Gb/day Efakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Sekvenování třetí generace • nevyužívá pomnožení templátu pro zvýšení signálu, sekvenace v reálném čase - analogie real-time PCR • produkuje výrazně delší čtení (řádově tisíce až desetitisíce bp) - snazší sestavování (assembly) • snazší sekvenování GC bohatých oblastí (druhá generace - problémy) Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno PacBIO PacBio RSII (500-1000 MB) Od 2011 technologie SMRT (single molecule real time sequencing) detekce odštěpeného barviva z připojovaného nukleotidu v tzv. zero mode waveguides (malé „kontejnery" na dně jamky) volné nukleotidy plavou v roztoku Emise Excitace fakultní nemocnice brno čtyřmi barvami značené nukleotidy templátové (fialově) a syntetizované (žluté) vlákno DNA zero mode waveguide □NA polymeráza https://www.fnbrno.cz/ PacBIO ■J- PacBIO - workflow Shear DNA DNA Repair Adapter Ligation ZM PACBIO* Size Selection Prepare SMRTbel! Library for Sequencing Sequence on Sequel System Procedure & Checklist - Preparing Multiplexed Microbial SMRTbell® Libraries for the PacBio® Sequel® System -> Pooling libraries - multiplexing gel ' sample well clution module BluePippin gel cassette BluePippin 27 PacBio - multiplexování knihoven Shearing Demage and end repair Barcoding Pooling 1111 A B j C D E 1 B (Size selection), QC, sequencing r\.jL_______________________...............i SMRTbell™ template E fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ PacBio - multiplexovanl knihoven It helps to ensure equimolar pooling and sequencing representation across all pooled samples despite different genome size, shear size and sample concentration Express Microbial Multiplexing Calculator Sample Information Calculate Plex (Calculated): 10 Total Sample Pool Volume Post Ligation Sample Name 100,0 Barcode Expected Genome Size (bases) Avg Shear Size (bases) Optional Sample Cone (ng/pl) Calculated Volumes (ul) Microbe Sample 1 BC10O1 6 000 000 12 000 65,0 12,2 Microbe Sample 2 BC1002 6 000 000 12 500 60,0 13,8 Microbe Sample 3 BC1003 6 000 000 14 500 56,0 17,2 Microbe Sample 4 BC1008 6 000 000 13 670 78,0 11,6 Microbe Sample 5 BC1Q09 6 000 000 15 770 58,0 18,0 Microbe Sample 6 BC101O 6 000 000 16 800 78,0 14,3 Microbe Sample 7 BC1011 6 000 000 12 345 65,0 12,6 Microbe Sample 8 BC1012 500 000 11 560 59,0 1,1 Microbe Sample 9 BC1015 500 000 15 468 61,0 1,4 Microbe Sample 10 BC1016 500 000 14 560 89,0 0,9 Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno PacBio - analýza dat • Automatic demultiplexing once run is finished • HGAP: Hierarchical Genome Assembly Process to generate high quality de novo assemblies of genomes • Microbial Assembly released in September 2019 Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno PacBio - (HGAP) a polishing Pre-assembled Reads Contig ALL Reads Assemble to Contig Polish by aligning to Contig fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ PacBio - (HGAP) a polishing • Assembly (unicycler/flye) • Polishing - racon (1), medaka (2), pilon (3) 1. Initial correction of raw assembly (consensus tool) -> alignment graph 2. Recurrent neural network-based polishing 3. Polishing with lllumina reads (SNPs, indels, repetitions) • Manual check -> mapping and checking (circularised plasmids, additional SNPs/indels, chimeras) Raw Reads Draft Assembly ^m^m Polished Consensus fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Oxford Nanopore • Modely Flongle, MinION, GridlON, PromethlON (řádově jednotky až stovky GB!) • Od 2014 • Délky readů až stovky kb • MinION - přenosné zařízení! (< 100 g) • Zatím také o něco nižší přesnost čtení (kolem 95 procent) • Princip - průchod vlákna DNA miniaturním pórem, kterým prochází elektrický proud; při průchodu dochází ke kolísání proudu specifickým způsobem odpovídajícím procházejícímu nukleotidu <" li A T C G E fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Oxford Nanopore Efakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Why Oxford Nanopore? Long reads - ability to assemble whole plasmids and chromosomes i g00002 g00003 ■]!"jv'.'4 gOOOOS gooooe gOOOO.7 gOOOOB g0001 0 g00011 ,]f.üivi; g0001 3 ■:|00014 g0001 5 ■30001 3 g0001 7 g0001 B ■30001 Si g00020 g00022 g00023 Í000L4 g00025 ■":■:■■:■ ■:■:■:■ g0002B ■J0002ĚI g00030 g00031 g00032 g00033 g00034 g00035 g0003B g00037 gOOOSB g00039 g00040 -i II lumina-only 1. contig_2 f— 2. contig_3 — 3. contig_1 — Hybrid assembly Quality worse than PacBio but cheaper than PacBio fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Nové diagnostické přístupy Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Sekvenování nové generace • Analýza mikrobiomu (bakteriom, virom,...) - Detekce nových infekčních agens • Vyšetření citlivosti • Virologická diagnostika Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno ikrobiom člověka a jeho vliv 10-100 Trillion of symbiotic microbial cells harbored by each person, primarily bacteria In the gut that makeupthe human mlcrobiota These are 10 times as many outside organisms are there are human cells in the human body 3.3 million number of Reductant genes in the human gut microbiome non- j r i individuals humans are different from one another 2200D approximate number of genes in the human gene catalog 99.90% individual human arc identical to o* another in terms of host in the human SjihI^ 90% diseases can be raced in some way back to gut health and microbiome REVIEW ARTICLE Integrating Microbiome Network: Microbes and Human Health Establishing Linkages Between Plants, Suresh B. K. Krishna1. Ananiika Dubey'. Muneer A. Malla1. Richa Korhari*. chandrarna p. tlpadhyay'. Jamila K. Adam1 and Asmvani Kunw BIOMEDICiNSKE CENTRUM www.biomedic-plzen.cz UNIVERZITA 'J KARLOVA Studie zaměřené na mikrobiom 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 ■ 1 ______......11111 1996 1997 1998 1999 ZOQO 200 1 200 2 2003 2 004 2005 2006 200 7 2 008 2009 2010 2 011 2012 2013 2014 2 015 2 016 2017 fakultní nemocnice brno https://www.fnbrno.cz/ Analýza mikrobiálních populací • Metataxonomika (16S rRNA profilování) • Metagenomika • Metatranskriptomika (analýza mRNA) • Metabolomika (analýza metabolitů) Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Využití různých metod pro studium mikrobiomu Metagertomic analysis DNA detraction ■ ■■ ■ ;■ ■■! iii i ■ GDMfl b li^íil Im Ľiitia preprocessing Wlicrö&lil MAG Domppsitkon construction Tamncmc i □xjnümi: S, lunctiDnaF arutyses fakultní nemocnice brno Metataxonomlc analysis :x kí iXLK DNA extraction Sequencing Data preprocessing ,__+_ * r-.1 =tr-.--äj .j Diversity composition analy&i* l.jxortamic analys is Metatranscriptomic analysis DXIM DGXI RNA extraction r.-nrv:rryiSrrTH) £n>ií>r>rrvj i_ninf Scqur-nci ng LJjr-Ti- ta HAH 'n ftjuuua Ic* -Tumly twaA- □ata preprccesstrig Abundance D\HnntlÍHi gSno estimation Hpríssiaunaljsis ♦_# ŕ -1 1/ ■ - -r* — (icne sei ŕnnciimcnt analysis https://www.fnbrno.cz/ Metobolomic analysis O._ •/■ v I "LJ^'U 'q i__ľfj y ;_V Metatmllte e Jtrarton Data acquKŕiliŕn r, ■ C d '.lI pročesal ng 5IMCA (íl J V Clustering dala ä visualizar.on .-"•-7- , ■ Biolog Oniics in gut microbiome analysis Tae Womig Whon'", Na-Ri Shin , Toon Yong Kim1, and SeongWoon Roh1* Analýza mikrobiálních populací • Metataxonomika • Běžně dostupná metoda • Využití 16S rRNA profilování (limity identifikace) • Neumožňuje identifikaci taxonů na detailní úrovni • Nepopisuje variabilitu na úrovni jednotlivého druhu (např. faktory virulence) Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Ribozom v taxonomii bakterií FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO https://www.fnbrno.cz/ Ribozom v taxonomii bakterií Konzervativní oblasti (možnost návrhu „univerzálních" primem) Variabilní oblasti (databáze různých taxonů) .. » - -a ví * mi:n» gwi^* ,...... V4 V:; ti* — _ ja« W .'' r-f >T;fW' "2=5 -V,'- " _» -y:v- Gram stain) +sannple prep witti Mi Sag Mycobacterium tuberculosis m. tuberculosis (i) UKrei. lab. DST MGIT culture DST in MGIT 2 weefcs l-3weEks 1 3we?ks 1-3 DST in sofid culture (1st line drugs) MGiT DST in MGIT culture (2nd line drugs) (ii) This study 2 MGIT culture Sequencing witii HiSeq (Hi) MGIT/MiSeq I MGIT culture I I Sequencing wilti MiSeq Garn of 5-9 weeks Gain of 1O-16 weeks EFAKULTNÍ NEMOCNICE https://www.fnbrno.cz/ BRNO Sekvenování nové generace a vyšetření citlivosti • Predikce pravděpodobnosti antibiotické rezistence I Detekce genů rezistence => predikce vysoké pravděpodobnosti rezistence predikce vysoké pravděpodobnosti citlivosti - NE - neplatí ekvivalence... Efakultní nemocnice https://www.fnbrno.cz/ brno Využití pro vyšetření infekcí CNS Meningitis/ M eningoencep ti alitis Encephalitis Bacteria Viruses. y mí sites Fungi Advantages • Rapid identification of known and novel pathogens in a single run ■ Rapid sequencing of pathogen full genomes • Selection of antimicrobial therapy ■ Impact on clinical outcomes, neurological consequences, ancf mortality • Epidemic dynamics and prediction of outbreaks ■ High sensitivity and specificity Limitations ■ Background and contaminating bacteria • DNA contamination from C5F pleocytosis i Limited bioinformatics tools and reference databases > Evidence from small retrospective studies > Costly and labor intensive Evaluating Infectious, Neoplastic, Immunological, and Degenerative Diseases of the Central Nervous System with Cerebrospinal Fluid-Based Next-Generation Sequencing Konstantinos I.Tsamis1'2 . Hercules Sakkas3 Alexandres Glannakis1. Han Suk Ryu* - Constantina Gartzonlka3 lliai P. Nikas3 FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO https://www.fnbrno.cz/ Sekvenování nové generace • Aplikace ve virologii • Uplatnění v molekulární epidemiologii • Dosud poměrně drahé • Pomalé (2-5 dní) • Naděje v případě sekvenace třetí generace (několik hodin) • Zásadní je interpretace dat - potřeba BIOINFORMATIKA, případně speciálních bioinformatických nástrojů Závěr EFAKULTNÍ NEMOCNICE https://www.fnbrno.cz/ BRNO Strategie v klinicko-mikrobiologické diagnostice prediction -ft ! PLfhlic Heahfi Healthcare oiganizatinns Industry c u (ture dependent J9 ■n ďr ťíl'ííp IT" C ô ť'lijTrplTiV c Scientific community HTSVMs infectious disease curture inrJependent generation xqcícnong Bžoin formatics analysis ->- Curated c no irrer- sound n g a ľ? ne teň c n ď a La t a Z BE " ge-por/iei g er oun e- based diagnosis Hours li Djrrojŕr>ijrriľiIre ŕiSirapy if 2J -4B ■72 : data celled or and centralization E-case report i phenotype -i- pathogen sequences + genome-based diagnosis} Pathos*™ 2«U..i. :5fi-::'í:d^i:M.-lW;paihfi;fiií.'<0.ii:řJÍ pathogens ISSN 2076-Ü8J7 www.mdpi.coriVii'iimaiyr^rlinpLin- High-Throughput Sequencing, a Versatile Weapon to Support Genome-Erased Diagnosis in Infectious Diseases: Applications to c linii-al Bacteriology ^(■tf'jli'i* L dbudlt [A-*. LbTlstopbi: AudrUtrt J-'] Mil UbWil Hal 131 FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO https://www.fnbrno.cz/ Výzkumná laboratoř EFAKULTNÍ NEMOCNICE https://www.fnbrno.cz/ BRNO Kam kráčí klinická mikrobiologie • Mikrobiologická diagnostika zaznamenává bouřlivý rozvoj • Vždy je však za vzorkem potřeba vidět pacienta • Funkční metody mohou přispět k další personalizaci medicíny • Vývoj nových metod klinické virológie EFAKULTNÍ NEMOCNICE https://www.fnbrno.cz/ BRNO Sekvenovanf DNA https://www.youtubexom/watch?v=vK-HIMaitnE - Sanger sequencing https://www.voutube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8 - lllumina https://www.voutube.com/watch?v=E9-Rm5AoZGw - Nanopore https://www.voutube.com/watch?v=v8p4ph2MAvl - Pacific Biosciences