Obecná
virologie,
sérologické
vyšetřovací
metody,
základy
imunologie
Doc. RNDr. Lenka Zdražilová Dubská, PhD.
MUDr. Markéta Hanslianová
Ústav laboratorní medicíny – Oddělení klinické
mikrobiologie a imunologie, FN Brno
Obrana proti infekci - imunita
•nespecifická
(vrozená, přirozená)
✓proti mnoha různým
patogenům
✓již při narození
✓působí okamžitě
✓probíhá vždy stejně
•specifická
(získaná, adaptivní)
✓proti konkrétnímu
patogenu
✓vyvíjí se postupně
✓nástup účinku
pomalejší
✓při opakovaném
kontaktu výraznější
Nespecifická imunita
1. Bariéry vůči usazení a průniku mikrobů: kůže, ochranné reflexy,
běžná mikroflóra
2. Vnitřní mechanismy nespecifické imunity (buněčné- fagocytóza,
humorální- komplement, cytokiny)
3. Horečka
4. Zánět
Bariéry proti usazení a průniku mikrobů
•Kůže: pro mikroby neprostupná (výjimka leptospiry,
papilomaviry, larvy parazitů)
•Sliznice: hlen, sliny, slzy, obměna buněk
•Ochranné funkce a reflexy: kýchání, kašel, zvracení,
zrychlená střevní peristaltika, mrkání
• Normální mikroflóra: brání usídlení patogenních mikrobů
Vnitřní mechanismy nespecifické imunity
Buněčné
✓fagocyty
✓NK buňky
✓eosinofily …
Humorální
✓komplementový systém
✓interferony
✓cytokiny, proteiny akutní
fáze…
Fagocyty
•Pohlcování a likvidace cizorodých částic
•Neutrofily (polymorfonukleáry) – proti původcům
hnisavých infekcí (většina bakterií)
• Makrofágy – proti intracelulárně se množícím agens (intracelulární
bakterie, viry)
monocyt makrofág
neutrofil
Fagocytóza
1. Chemotaxe
pohyb fagocytů směrem k místu infekce; chemotaxiny: C5a,
C3a, IL-8, bakteriální oligopeptidy
2. Adherence
přichycení cizorodé látky na povrch fagocytů; fagocytární
lektiny, nespecifické opsoniny (C3b), specifické opsoniny
(protilátky)
3. Vlastní pohlcení
fagosom-fagolysozom
4. Nitrobuněčné ničení
enzymy, laktoferin, bazické proteiny, reaktivní kyslíkové
metabolity
Komplementový systém
•systém bílkovin přítomných v krevním séru C1 – C9
(fragmenty a, b)
• kaskádový jev – produkt jedné reakce katalyzuje další reakci
•aktivace klasickou, alternativní a lektinovou drahou
•Význam: chemotaxe (C5a, C3a), opsonizace (C3b), lýza
buněk (membránový útočný komplex C56789)
Mechanismy nespecifické imunity
• Horečka: exogenní pyrogeny (mikrobiální produkty)
endogenní pyrogeny (interleukiny, makrofágový zánětlivý protein)
• Zánět
Specifická imunita
Buněčná
✓T lymfocyty
Humorální
✓B lymfocyty
✓protilátky
T lymfocyty
•kmenové buňky z kostní dřeně
•T - dozrávání v thymu
✓cytotoxické T buňky (Tc) – zabíjejí antigenně změněné
buňky (buňky infikované viry)
✓pomocné T buňky (Th) – produkují cytokiny, Th1
(aktivace makrofágů, intracelulární patogeny), Th2 (aktivace
B buněk, extracelulární patogeny)
✓regulační T buňky (Treg) – tlumí imunitní reakci
B lymfocyty
•B – u ptáků dozrávání ve Fabriciově burse, u savců v
kostní dřeni (bone marrow)
•lymfocyty B plazmatické buňky
produkce protilátek(imunoglobulinů)
Protilátky
•imunoglobuliny schopné
specificky se vázat na
antigen
•tvořeny plazmatickými
buňkami (plazmocyty)
•třídy imunoglobulinů:
IgG, IgM, IgA, IgD, IgE
Typy
imunoglobulinů
•IgG: opsonizace, neutralizace toxinů a virů, aktivace
komplementu klasickou drahou, přestup přes placentu
•IgM: začátek imunitní reakce, aktivace komplementu
klasickou drahou
•IgA: slizniční imunita
•IgE: ochrana proti parazitům
•IgD: receptor B buněk pro příslušný antigen
Imunizace
= proces vedoucí ke vzniku imunity
přirozená umělá
Imunizace přirozená aktivní
– po infekci
Imunizace přirozená pasivní
– transplacentární
Imunizace umělá aktivní
– po očkování
Imunizace umělá pasivní –
po podání imunoglobulinu
Imunizace aktivní
• Vakcíny:
1. Živé oslabené (TBC)
2. Inaktivované (celobuněčné, subjednotkové, polysacharidové,
anatoxiny)
3. Rekombinantní (VHB)
Viry
• lat. virus – „šťáva, jed“, v lékařské terminologii „infekční činitel“
• 1676- Anton van Leeuwenhoek- první pozorování baktérií vlastnoručně
vyrobeným mikroskopem
• 1879 – 1882: první pokusný přenos virového onemocnění- Adolf Mayer
(mozaiková choroba tabáku),
• Dimitrij Ivanovskij- filtrace viru
• Beijerinck-použit termín virus
• 1898: první pokusný přenos živočišného viru (virus slintavky a kulhavky)
• 1939: první elektronoptické snímky viru mozaikové choroby tabáku
• 40. léta 20. století: mohutný rozvoj virologie
Schéma viru mozaikové choroby tabáku
Elektronoptický snímek viru
mozaikové choroby tabáku
Mozaiková choroba tabáku
Povaha virů
•viry nejsou organizovány jako buňky, ale jako částice
(podbuněčné organismy)
•obsahují jediný typ nukleové kyseliny: buď RNA nebo
DNA
•nemnoží se dělením, ale syntézou svých složek
•syntéza je závislá na ribosomech hostitelské buňky
Stavba virionu
virion = virová částice
- vnitřní část – dřeň neboli nukleoid obsahuje nukleovou kyselinu
- zevní část – kapsida obsahuje bílkovinu
nukleoid + kapsida = nukleokapsida (neobalené
viry, např. pikornaviry, adenoviry)
nukleokapsida může být uložena ve virovém obalu
(obalené viry, např. herpesviry)
Neobalené viry
Obalené viry
1 – kapsida, 2 – nukleoid, 3 – protomera, 4 – nukleokapsida, 5 –
nukleokapsida s obalem, 6 – lipoproteinový obal, 7 - glykoproteiny
Nukleová kyselina
•Typ a organizace virového genomu:
• RNA nebo DNA
• jednořetězcová nebo dvouřetězcová
• segmentovaná nebo nesegmentovaná
• lineární nebo kruhová
Kapsida
•sestavena z bílkovinných podjednotek neboli protomer
uspořádaných symetricky
- kapsida s kubickou (ikosaedrální) symetrií – tvar dvacetistěnu (např. herpesviry,
adenoviry)
- kapsida se spirální (helikální) symetrií – tvar válce (např. orthomyxoviry)
- kapsida s komplexní symetrií – např. bičíkaté fágy, poxviry
Neobalené viry
Obalené viry
1 – kapsida, 2 – nukleoid, 3 – protomera, 4 – nukleokapsida, 5 –
nukleokapsida s obalem, 6 – lipoproteinový obal, 7 - glykoproteiny
Komplexní symetrie
Kubická (ikosaedrální) symetrie
Spirální (helikální) symetrie
Velikost virů: 20 nm (pikornaviry) – 300 nm (poxviry)
Třídění virů
- dle charakteru genomu:
RNA viry, DNA viry
- dle přítomnosti obalu:
neobalené viry, obalené viry
- dle symetrie kapsidy: viry s kubickou symetrií, spirální
symetrií, komplexní symetrií
- dle povahy hostitele: viry bakterií (bakteriofágy), kvasinek, prvoků, rostlin,
hmyzu, obratlovců
- dle vyvolávaných syndromů (klinicko-epidemiologické rozdělení): respirační
viry, neuroviry, exantematické viry…
Reprodukce virů
1. Adsorpce (přilnutí) na vnímavou buňku
Receptory na povrchu buněk, tkáňový tropismus
Vazba na buňky, ve kterých se viry nemnoží -erytrocyty-
hemaglutinace
2. Penetrace (průnik) virionu do buňky
3. Rozbalení virionu- ztráta kapsidy a virového obalu-uvolnění
nukleové kyseliny
4. Replikace virového genomu- viru využije metabolismus hostitelské buňky k
tvorbě virových bílkovin a NK
5. Maturace (dozrávání) virionů- organizace virových bílkovin kolem NK viru,
tvorba kapsidy
6. Uvolnění nových virionů z buňky
adsorpce
penetrace
replikacetranskripce
translace
maturace
uvolnění
Reprodukce virů
• +ssRNA virus – SARS-CoV-2 • RNA Retrovirus - HIV
Buněčné změny při virové infekci
• Cytocidní infekce- virová buňka odumírá ke konci cyklu množení viru;
enteroviry (cytopatický efekt viru)
• Necytocidní infekce- virová NK se množí nezávisle, ale dostatečně
pomalu a nenarušuje metabolismus hostitelské buňky; herpesviry
Průběh a formy virových nákaz
• Vstupní brána infekce: respirační trakt, sliznice GIT, kůže a podkoží,
sliznice urogenitálního traktu, spojivka
• Šíření viru- z buňky do buňky, pasivní šíření krví, lymfou,
mozkomíšním mokem, sekrety
• Vylučování viru- viriony nebo infikované rozpadající se buňky
Průběh a formy virových nákaz
•infekce inaparentní (bezpříznaková)
•infekce manifestní:
• forma klinická – všechny typické příznaky
• forma abortivní – jen některé příznaky
• forma subklinická – nespecifické příznaky
•infekce lokální, systémová, generalizovaná
•infekce akutní, chronická:
infekce perzistentní - nejsou klinické příznaky, virus lze
prokázat
infekce latentní - nejsou klinické příznaky, virus nelze
prokázat
Diagnostika virových infekcí
1. Přímá- , mikroskopie, tkáňové kultury, průkaz antigenu, nebo
nukleové kyseliny viru
2. Nepřímá- průkaz protilátek
Přímý průkaz viru
• Mikroskopický průkaz- elektronový mikroskop
• Izolace viru na tkáňových kulturách- pěstování viru na kulturách
buněk (opičí ledviny)- cytopatický efekt (destrukce buněk, fúze
buněk, tvorba ložisek, zmenšení buněk). Efekt po 24-48 h, někdy po
několika týdnech
Viry nelze pěstovat na běžných kultivačních
půdách!
Přímý průkaz viru
• Průkaz antigenu
• laterální průtokové testy (lateral flow
assay) - lze jako POCT
(imunochromatografie – vizuální či
fluorescenční)
• EIA (HBsAg, SARS-CoV-2)
• Průkaz nukleové kyseliny viru- PCR
• Detekce RNA nebo DNA
• Průkaz kvalitativní nebo kvantitativní
• Molekulární podtypy viru
Infekční imunologie (serologické reakce,
buněčná imunita)
Nepřímý průkaz
✓průkaz protilátek
✓ patogen-specifická
buněčná imunita
Serologické reakce
• Reakce mezi antigeny a protilátkami in vitro
• krev, likvor, synoviální tekutina
Přehled serologických metod
1. Precipitace
2. Aglutinace
3. Komplement fixační reakce (KFR)
4. Neutralizace
5. Reakce se značenými složkami:
- imunofluorescence
- enzymová imunoanalýza
- Western blot (imunoblot)
Precipitace
•antigen koloidní povahy
•precipitační neboli vločkovací testy na lues
VDRL, RRR, RPR
kardiolipin + protilátky v séru precipitace
Aglutinace
•antigen korpuskulární povahy
•antigen + hledaná protilátka viditelný shluk
(aglutinát)
•průkaz protilátek u salmonelózy (Widalova reakce),
yersiniózy, listeriózy, tularémie
• přímá, nepřímá (na nosičích)- antigen je navázán na povrch vhodné
částice (pasivní hemaglutinace- TPHA)
Komplement fixační reakce
princip: komplex Ab/Ag váže (fixuje) komplement --> komplement
nelyzuje erytrocyty
✓komplex antigen + hledaná protilátka
✓komplement
✓indikátorový neboli hemolytický systém (beraní
erytrocyty senzibilizované králičí protilátkou)
zábrana hemolýzy hemolýza
pozitivní reakce negativní reakce
Komplement fixační reakce
pozitivní negativní
Neutralizace
• protilátka brání biologickým
účinkům antigenu
(streptolyzin)
• ASLO – průkaz
antistreptolyzinu O
přítomnost ASLO ve
vyšetřované
zábrana hemolýzy …
pozitivní reakce
zábrana cytopatického efektu …
pozitivní reakce
Neutralizační reakce - průkaz ASLO
Reakce se značenými složkami-
Imunofluorescence
•jedna složka značena fluorescenčním barvivem,
průkaz pomocí fluorescenčního mikroskopu
•přímá – průkaz antigenu: T.pallidum
•nepřímá – průkaz protilátek: syfilis, anaplazmóza,
HHV6
Nepřímá imunofluorescence
- protilátky proti T.pallidum
titrace
Reakce se značenými složkami-enzymová
imunoanalýza
•jedna složka značena enzymem, který rozloží přidaný
substrát za vzniku barevného produktu
•Výsledek: barevná reakce
•Hodnocení: měření absorbance
•ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
•průkaz antigenu: HBsAg, respirační viry, chlamydie
•průkaz protilátek: univerzální použití
Princip metody ELISA
ELISA – průkaz HBsAg
Souprava pro vyšetření
metodou ELISA
Reakce se značenými složkami Western
blot
Antigen rozdělený na jednotlivé polypeptidy dle
molekulové hmotnosti na nitrocelulózovém
pásku
1. vazba hledaných protilátek ze séra na příslušné antigenní frakce
2. přidání protilátky značené enzymem
3. přidání substrátu
4. výsledná reakce – barevný proužek
Western blot T.pallidum IgG
Interpretace serologických výsledků
•průkaz protilátek svědčí pro setkání s antigenem (kdy
?), k diagnóze infekce většinou nestačí
•dynamika imunitní reakce:
setkání s antigenem průkaz protilátek
10 dní
Serologický průkaz infekce
•vyšetření dvou vzorků séra: akutní na začátku
onemocnění, rekonvalescentní za 10 až 14 dní
•průkazný nález: čtyřnásobný vzestup titru nebo
serokonverze
•vzorky nutno vyšetřit zároveň !
titr protilátek = nejvyšší (poslední) ředění, v němž
ještě došlo k prokazatelné serologické reakci
•IgM – první protilátky, přetrvávají týden až několik
měsíců, svědčí pro čerstvou infekci
•IgA – přetrvávají o něco déle, svědčí pro čerstvou nebo
nedávnou infekci
•IgG – nejvyšší hladina měsíc po začátku onemocnění,
mohou přetrvávat roky
Patogen-specifická buněčná odpověď
• Funkční test na přítomnost imunitní odpovědi (T-lymfocyty) na
antigeny patogenu
• Inkubace plné krve se antigeny
• Detekce produkovaného interferonu gamma (… IGRA ev. ELISPOT)
Prevence a terapie virových nákaz
• antivirová chemoterapeutika – antiherpetika, antiretrovirotika,
protichřipková chemoterapeutika
•pasivní imunizace (podání imunoglobulinů) –
antirabické sérum, profylaxe hepatitidy A a B, varicelly,
cytomegalovirové infekce
• aktivní imunizace (očkování)
Děkuji za pozornost