Karel Kubíček, Ústav fyziky kondenzovaných látek, CEITEC MU, karelk@physics.muni.cz , +420 549 49 3253 Přístrojové metody molekulární biofyziky 11/10/2021 Karel Kubíček 1 CEITEC MU Life Sciences Research Programmes 01_zluta.jpg 1. Advanced nanotechnologies and microtechnologies 2. Advanced materials 3. Structural biology 4. Genomics and proteomics of plant systems 6. Molecular medicine 5. Brain and mind research 7. Molecular veterinary medicine Strukturně je CEITEC rozdělen do 7 programů z nichž 4 plně a jedna částečně jsou umístěny na CEITEC MU. Programy se dále dělí na výzkumné skupiny, které tvoří základní funkční jednotku v jejíž čele stojí vedoucí výzkumné skupiny. Tento velmi flexibilní systém umožňuje pohled na výzkumné týmy jako individuality, což umožňuje dobře identifikovat potřeby jednotlivých skupin a cíleně koordinovat fungování skupiny směrem k excelentním výsledkům. CEITEC MU Life Sciences Research Programmes 01_zluta.jpg 1. Advanced nanotechnologies and microtechnologies 2. Advanced materials 3. Structural biology 4. Genomics and proteomics of plant systems 6. Molecular medicine 5. Brain and mind research 7. Molecular veterinary medicine Structural Biology echovirus7_receptor_complex.jpg http://mbb.uchc.edu/images/photo_welcome_feature.jpg Strukturně je CEITEC rozdělen do 7 programů z nichž 4 plně a jedna částečně jsou umístěny na CEITEC MU. Programy se dále dělí na výzkumné skupiny, které tvoří základní funkční jednotku v jejíž čele stojí vedoucí výzkumné skupiny. Tento velmi flexibilní systém umožňuje pohled na výzkumné týmy jako individuality, což umožňuje dobře identifikovat potřeby jednotlivých skupin a cíleně koordinovat fungování skupiny směrem k excelentním výsledkům. •Biomolekulární vědy mají klíčový význam pro molekulární medicínu. -Budeme se zabývat zařízeními pro studium struktury, měření koncentrace (in-vitro i in-vivo), a pro studium vlastností membrán - •Nejběžnější zařízení založená na interakci elektromagnetického záření s makromolekulami –VIS, UV a IR spektrofotometry –Ramanovy spektrometry –Zařízení pro měření cirkulárního dichroismu –Zařízení pro rentgenstrukturní analýzu –Nukleární magnetickou rezonancí –Hmotnostní spektrometrie –Fluorescenční techniky –Elektronová mikroskopie – •Zařízení založená na jiných vlastnostech biomolekul (např. mechanických a elektrických) –Elektroforéza –Langmuir-Blodgettové technika – •Zařízení pro měření membránových potenciálů a koncentrace iontů v buňkách 11/10/2021 Karel Kubíček 4 Biofyzika a biomolekulární výzkum Tento výzkum je orientován zejména na strukturální studie, které umožňují porozumět např.: ØSpecifičnosti enzymatických a imunologických reakcí Ø ØÚčinkům některých léků (např. cytostatik) na molekulární úrovni. Ø ØMechanismům pasivního i aktivního transportu Ø ØBuněčnému pohybu Ø Ø…………….. 11/10/2021 Karel Kubíček 5 Screen Shot 2011-09-25 at 9.42.05 PM.png Screen Shot 2011-09-25 at 9.42.52 PM.png Screen Shot 2011-09-25 at 9.43.17 PM.png Screen Shot 2011-09-25 at 9.43.37 PM.png Screen Shot 2011-09-25 at 9.44.21 PM.png Screen Shot 2011-09-25 at 9.44.50 PM.png Screen Shot 2011-09-25 at 9.45.11 PM.png Screen Shot 2011-09-25 at 9.45.29 PM.png Screen Shot 2011-09-25 at 9.46.04 PM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 6 zobrazovani.png 11/10/2021 Karel Kubíček 7 EMSpec.gif 11/10/2021 Karel Kubíček 8 y:\Presentations\080513_KampusBohunice_Mornstein\composition_earth_seawater_human_body.png 11/10/2021 Karel Kubíček 9 11/10/2021 Karel Kubíček 10 Chemické složení lidského těla a.(65.0 %) Voda b.(20.0 %) Proteiny c.(12.0 %) Lipidy (tuky) d.(01.1 %) Nukleové kyseliny e.Ionty (Na+, K+, Cl-, PO43- ...) f.Plyny (O2, CO2, …), karbohydráty (glukóza), hydroxyapatit (forma vápníku a fosfátu – zuby, kosti), volné radikály, etc. g. 11/10/2021 Karel Kubíček 11 Proteiny A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V peptidova_vazba_2.png Karel Kubíček 13 Peptidová vazba – pseudo dvojitá vazba => amidová rovina peptidova_vazba.png peptidova_vazba_1.png peptidova_vazba_3.png 11/10/2021 Karel Kubíček 14 parametry_polypept_reterze.png Proteinová páteř, primární struktura, číslování od N-konce (terminu) směrem k C-konci 11/10/2021 C N amide_plane.png Karel Kubíček 15 AEKGYA.png f - CO, N, Ca, CO (CO někdy značeno C’) y - N, Ca, CO, N 11/10/2021 helix_3.png Karel Kubíček 16 Sekundární struktura 1)a-šroubovice (a-helix) 2)b-skládaný list (b-sheet) 3)Ohyb, smyčka (loop/turn) helix_1.png helix_2.png helix_zobr.png 11/10/2021 Karel Kubíček 17 Sekundární struktura 1)a-šroubovice (a-helix) 2)b-skládaný list (b-sheet) 3)Ohyb, smyčka (loop/turn) beta_sheet.png antiparalelní uspořádání paralelní uspořádání beta_sheet_zobr.png beta_sheet_zobr.png beta_sheet_zobr.png 11/10/2021 Karel Kubíček 18 Sekundární struktura 1)a-šroubovice (a-helix) 2)b-skládaný list (b-sheet) 3)Ohyb, smyčka (loop/turn) beta_smycka.png gama_beta_smycka.png b-smyčka/ohyb (4 residua) g-smyčka/ohyb (3 residua) 11/10/2021 Karel Kubíček 19 ramachandran.png Ramachandranův diagram - zobrazuje energeticky přípustné oblasti dihedrálních úhlů ψ v závislosti na φ 11/10/2021 11/10/2021 Karel Kubíček 20 Nukleové kyseliny 11/10/2021 Karel Kubíček 21 base_pairing.png AT.png GC.png Watson-Crickovské párování bazí 11/10/2021 Karel Kubíček 22 base_pairing.png AT.png GC.png Watson-Crickovské párování bazí 2 vodíkové vazby!!! 3 vodíkové vazby!!! 11/10/2021 Karel Kubíček 23 AT.png GC.png rozložení náboje v nukleobázích + 0 -, šipky označují dipólový moment 11/10/2021 Karel Kubíček 24 DNA_RNA.png RNA DNA 11/10/2021 Karel Kubíček 25 dna_karelk.jpg double.jpg DNA_Overview1.png 11/10/2021 Karel Kubíček 26 ABZ_DNA.png Nejběžnější typy DNA: B-DNA (a), A-DNA (b), Z-DNA (c) DNA konformace B A Z Směr vinutí pravotočivá pravotočivá levotočivá Počet parů bazí na otáčku 10.5 11.0 12.0 Průměr šroubovice ~2.0 nm ~2.6 nm ~1.8 nm Konformace cukru C2’-endo C3’-endo C2’-endo (pyr) C3’-endo (pur) Velký žlábek Major groove široký, hluboký úzký, hluboký plochý Malý žlábek Minor groove úzký, hluboký široký, mělký úzký, hluboký 11/10/2021 Karel Kubíček 27 Non-Watson-Crickovské (Hoogsteenovo – Karsten Hoogsteen) párování bazí Triplexové struktury triplex_bonding.png 11/10/2021 Karel Kubíček 28 Hoogsteen.png triplex.png Triplexové struktury (triple stranded DNA, H-DNA) 11/10/2021 Karel Kubíček 29 Quadruplexové struktury quadruplex.png 11/10/2021 30 Další významné formy DNA: 1)Hollidayův spoj (Holliday junction) klíčový meziprodukt v mnoha typech genetické rekombinace a také při opravě dvouřetězcových zlomů. 2) 2) 2) 2) 2)displacement loop (D-loop, D-smyčka) 3)R-loop (R-smyčka) 4) 4) 4)Křížová struktura DNA (cruciform) 5) 5) 5) 5)i-motif DNA 6) 6)DNA nanotechnologie – DNA origami Diagram, schematic Description automatically generated A screenshot of a computer Description automatically generated with medium confidence Diagram, schematic Description automatically generated Pictures credited to: wikipedia.org 11/10/2021 31 Další významné formy DNA: 1)Hollidayův spoj (Holliday junction) klíčový meziprodukt v mnoha typech genetické rekombinace a také při opravě dvouřetězcových zlomů. 2) 2) 2) 2) 2)displacement loop (D-loop, D-smyčka) 3)R-loop (R-smyčka) 4) 4) 4)Křížová struktura DNA (cruciform) 5) 5) 5) 5)i-motif DNA / i-motif RNA 6) 6)DNA nanotechnologie – DNA origami Pictures credited to: wikipedia.org 11/10/2021 Další významné formy DNA: 1)Hollidayův spoj (Holliday junction) klíčový meziprodukt v mnoha typech genetické rekombinace a také při opravě dvouřetězcových zlomů. 2) 2) 2) 2) 2)displacement loop (D-loop, D-smyčka) 3)R-loop (R-smyčka) 4) 4) 4)Křížová struktura DNA (cruciform) 5) 5) 5) 5)i-motif DNA / i-motif RNA 6) 6)DNA nanotechnologie – DNA origami Screen Shot 2014-10-21 at 08.40.13.png Screen Shot 2014-10-21 at 08.40.47.png Screen Shot 2014-10-21 at 08.44.03.png Screen Shot 2014-10-21 at 08.42.45.png 11/10/2021 Karel Kubíček 33 Lipidy 11/10/2021 Karel Kubíček 34 11/10/2021 Karel Kubíček 35 11/10/2021 Karel Kubíček 36 11/10/2021 Karel Kubíček 37 11/10/2021 Karel Kubíček 38 11/10/2021 Karel Kubíček 39 Zařízení založená na interakci elektromagnetického záření s makromolekulami 11/10/2021 Karel Kubíček 40 Druhy spektrofotometrů ØSpektrofotometry jsou laboratorní přístroje používané pro měření koncentrace látek absorbujících nebo emitujících infračervené, viditelné nebo ultrafialové světlo. Mohou být též použity pro studium jejich chemické struktury. Ø ØAbsorpční spektrofotometry: založeny na spektrální závislosti absorpce světla. Ø ØEmisní spektrofotometry: Zdrojem světla je sama analyzovaná látka, jež je injektována nebo rozprašována do bezbarvého plamene. Emitované světlo prochází optickým hranolem nebo mřížkou, takže můžeme získat celé emisní spektrum. Frekvence přítomné ve spektru umožňují identifikovat např. přítomné ionty. Ø ØSpektrofluorimetry: emise světla je vyvolána světlem o vlnové délce kratší než je vlnová délka světla emitovaného. 11/10/2021 Karel Kubíček 41 Absorpční spektrofotometry: Lambertův-Beerův zákon Absorpční spektrofotometrie je založena na absorpci světla při průchodu vrstvou roztoku. Jeho koncentrace může být zjištěna pomocí Lambertova-Beerova zákona: I = I0.10-ecx c je koncentrace rozpuštěné látky, x tloušťka vrstvy, I0 původní intenzita světla, I je intenzita světla po průchodu vrstvou. Konstanta e (epsilon, absorpční nebo extinkční koeficient) závisí na vlnové délce světla, na rozpuštěné látce a rozpouštědle. Její hodnoty pro běžné chemické sloučeniny lze nalézt v tabulkách. Tyto hodnoty jsou vždy udávány pro určitou vlnovou délku (obvykle absorpční maximum). Číselné hodnoty tohoto koeficientu závisejí na tom, jak je vyjadřována koncentrace rozpuštěné látky. Když použijeme mol.l-1, hovoříme o molárním absorpčním koeficientu. 11/10/2021 Karel Kubíček 42 Poměr intenzit světla prošlého a dopadajícího se nazývá transmitance (dříve transparence). Dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance se nazývá absorbance A. S ohledem na L.-B. zákon je tedy absorbance přímo úměrná koncentraci rozpuštěné látky a tloušťce absorbující vrstvy roztoku. A = e.c.x 11/10/2021 Karel Kubíček 43 Druhy absorpčních spektrofotometrů ØPodle konstrukce rozdělujeme spektrofotometry na jednopaprskové a dvoupaprskové. Ø ØU jednopaprskových spektrofotometrů jeden svazek světla prochází nejdříve srovnávacím a pak měřeným vzorkem (kyvety obsahující roztoky musí být pohyblivé). U dvoupaprskových spektrofotometrů jeden svazek světla prochází měřeným vzorkem a druhý srovnávacím vzorkem (blankem). Dvoupaprskové přístroje umožňují podstatně rychlejší měření, avšak jsou dražší. U jednoduchých přístrojů je nastavování vlnové délky světla ruční. U pokročilejších přístrojů se toto nastavování děje automaticky, což umožňuje přímo získávat absorpční křivky, tj. grafy závislostí absorbance na vlnové délce světla. 11/10/2021 Karel Kubíček 44 spekol Jednopaprskový spektrofotometr Zdrojem světla (1) je žárovka s wolframovým vláknem. Její polychromatické světlo prochází kondenzorem (2) a odráží se od zrcadla (3) na vstupní štěrbinu (4) monochromátoru (části 4 až 8, plus 12). Světlo je soustřeďováno čočkou (5) na odrazovou optickou mřížku (6), která tvoří barevné spektrum. Téměř monochromatické světlo je promítáno objektivem (7) na výstupní štěrbinu (8) monochromátoru. 11/10/2021 Karel Kubíček 45 spekol S mřížkou lze otáčet pomocí ovladače vlnových délek (12), čímž se zaměřuje světlo o určité vlnové délce na výstupní štěrbinu. Svazek světla pak prochází kyvetou (9) se vzorkem. Intenzita prošlého světla je měřena fotodetektorem (10, 11). Jeho signál je zesilován zesilovačem (13). Hodnota absorbance je zobrazena na displeji (14). Intenzita světla prošlého srovnávacím roztokem je vždy srovnávána s intenzitou téhož svazku světla prošlého měřeným vzorkem. Jednopaprskový spektrofotometr 11/10/2021 Karel Kubíček 46 Moderní UV/VIS/NIR spektrofotometr uv spec_fig2%20diode%20array spec_fig1%20scanning Světlo jedné vybrané vlnové délky nebo celé prošlé spektrum může být měřeno NIR = near infrared = blízká infračervená oblast 11/10/2021 Karel Kubíček 47 Absorpční UV spektrofotometrie ØUltrafialové (UV) světlo je absorbováno různými sloučeninami, zejména těmi, které mají konjugované dvojné vazby. Jak bílkoviny, tak nukleové kyseliny silně absorbují UV světlo, což lze využít pro jejich zkoumání. –Aminokyseliny tryptofan a tyrosin mají absorpční maxima při přibližně 280 nm. Fenylalanin při 255 nm. –Nukleotidy (dusíkaté báze) mají absorpční maxima v oblasti 260 - 270 nm. –Chromofory – jejich absorpční vlastnosti se mění podle chemického složení prostředí. 11/10/2021 Karel Kubíček 48 Absorpční spektrum volného fenylalaninu, tyrosinu a tryptofanu v UV oblast Podle:http://www.fst.rdg.ac.uk/courses/fs460/lecture6/lecture6.htm UV/Vis spektroskopie proteinů 11/10/2021 Karel Kubíček 49 Bathochromní efekt (červený posun) Hypsochromní efekt (modrý posun) Hypochromní efekt – snížení intenzity Hyperchromní efekt – zvýšení intenzity 11/10/2021 Karel Kubíček 50 Hypochromní efekt (HE) ØAbsorpce světla je ovlivňována dipólovými momenty chemických vazeb, které interagují s fotony. Stochasticky (náhodně) orientované dipólové momenty (denaturovaná bílkovina) absorbují světlo lépe než ve stavu uspořádaném (šroubovice). U bílkovin je HE způsoben peptidovými vazbami, které mají UV absorpční maximum kolem 190 nm. Ø ØDvoušroubovice DNA absorbuje UV světlo hůře vlivem patrových a vodíkových interakcí než jednořetezcová (denaturovaná/neuspořádaná). ADNA260nm v horké vodě > ve studené vodě Ø ØHelicita – relativní zastoupení uspořádaných částí makromolekuly 11/10/2021 Karel Kubíček 51 Hypochromní efekt u kys. polyglutamové. Při pH 7 tento polypeptid tvoří stochastické (neuspořádané) klubko (1), při pH 4 získává šroubovicovou strukturu (2). Absorpční maximum peptidových vazeb je snížené vlivem jejich prostorového uspořádání. e je molární absorpční koeficient a l je vlnová délka UV světla. [dle: Kalous a Pavlíček, 1980] 11/10/2021 Karel Kubíček 52 11/10/2021 Karel Kubíček 53 https://sandwalk.blogspot.com/2007/12/dna-denaturation-and-renaturation-and.html https://www.khanacademy.org/test-prep/mcat/physical-sciences-practice/physical-sciences-practice-tu t/e/melting-point-and-thermodynamics-of-double-stranded-dna-1 Teplota tání duplexů DNA Screen Shot 2011-11-04 at 8.58.40 PM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 54 redukovaný oxidovaný Screen Shot 2011-11-04 at 9.02.20 PM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 55 Zářivé procesy (absorpce, fluorescence, fosforescence) jsou indikovány rovnými šipkami. Nezářivé procesy jsou naznačeny zvlněnými šipkami. Diagramy tohoto typu byly zavedeny A. Jablonskim v jeho práci z r. 1935 na téma mechanismu fosforescence. Horizontální osa nemá fyzikální význam. Screen Shot 2011-11-04 at 7.49.38 PM.png Screen Shot 2011-11-04 at 7.50.27 PM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 56 Fluorescenční (Försterův) přenos energie Screen Shot 2011-11-04 at 8.05.28 PM.png Screen Shot 2011-11-04 at 8.02.41 PM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 57 Fluorescenční (Försterův) přenos energie Figure 1 Figure 2 Figure 3 11/10/2021 Karel Kubíček 58 giardia_viabilitystain.jpg Giardia lamblia (intestinalis) (A) is the cyst imaged by transmission (differential interference contrast), only. (B) is the cyst wall selectively imaged through use of fluorescent-labelled (TRITC) antibody that is cyst wall specific. (C) is the cyst imaged through use of carboxy fluorescein diacetate, a viability stain. (D) is a composite image of (B) and (C). (E) is a composite image of (A), (B), and (C). Bar = 10 microns; sample from gerbil feces. Image courtesy of US EPA 11/10/2021 Karel Kubíček 59 Screen Shot 2011-11-04 at 8.55.31 PM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 60 Zařízení pro měření fluorescenční anisotropie. V hlavním schematu polarizační filtr nebo hranol (P1) polarizuje dopadající světlo. Intenzita fluorescence je měřena druhým polarizátorem (P2), který může být kolmý nebo paralelní k P1. L – lampa, S – vzorek, PD – fotodetektor. IR spektrofotometrie ØInfračervené záření (IR) působí na rotační a vibrační stavy molekul. Složité molekuly mohou vibrovat nebo rotovat mnoha různými způsoby (módy). Různé chemické skupiny (-CH3, -OH, -COOH, -NH2 atd.) mají specifické vibrační a rotační frekvence, a proto absorbují IR světlo o specifických vlnových délkách. ØZ tohoto důvodu mají infračervená absorpční spektra mnoho maxim. Změna chemické struktury se projevuje jako změna polohy těchto maxim ve spektru. 11/10/2021 Karel Kubíček 61 Screen Shot 2011-11-02 at 9.43.05 AM.png Screen Shot 2011-11-02 at 9.42.53 AM.png Screen Shot 2011-11-02 at 9.42.35 AM.png Screen Shot 2011-11-02 at 9.42.22 AM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 62 Screen Shot 2011-11-02 at 9.32.13 AM.png Screen Shot 2011-11-02 at 9.31.59 AM.png Screen Shot 2011-11-02 at 9.37.56 AM.png CO2 H2O Vibrace n/cm-1 11/10/2021 Karel Kubíček 63 Screen Shot 2011-11-02 at 9.29.42 AM.png Screen Shot 2011-11-02 at 9.58.55 AM.png Ukázka IR spekter. Vlevo absorpční spektrum živé (fialově) a umírající (modře) buňky. Vpravo spektrum vanilinu. 11/10/2021 Karel Kubíček 64 Ramanova spektroskopie ØSir Chandrasekhara Venkata Raman – NC 1930 za fyziku „za jeho práci o rozptylu světla a objevu efektu pojmenovanám po něm“ Ø ØRayleighův rozptyl světla. Nastává interakce fotonů s molekulami, jež se projevuje jen velmi malou nebo žádnou změnou vlnové délky. Intenzita rozptýleného světla závisí na molekulové hmotnosti a také na úhlu rozptylu, což lze využít pro odhad tvaru makromolekul. ØRamanova spektrometrie. Při rozptylu fotonů nastává malá změna (posun) vlnové délky, způsobená malým poklesem nebo zvýšením energie rozptýlených fotonů během přechodu z původního do změněného vibračního nebo rotačního stavu interagující molekuly. Tyto stavy se mohou měnit v důsledku strukturálních změn molekul. ØProto změny v Ramanových spektrech (intenzita signálu v závislosti na posunu vlnové délky) odrážejí konformační změny molekul. 11/10/2021 Karel Kubíček 65 Ramanova spektroskopie Ramanovo spektrum polytenního chromosomu pakomára Chironomus. Při zvolených vlnočtech lze uskutečnit ramanovskou mikroskopii. Vybuzeno laserovým světlem o vlnové délce 647.1 nm. According to: http://www.ijvs.com/volume2/edition3/section4.htm raman 2 11/10/2021 Karel Kubíček 66 Cirkulární dichroismus (CD) Ø Měření optické aktivity (schopnosti stáčet rovinu polarizovaného světla). Konformační změny molekul mohou být sledovány jako změny optické aktivity při použití speciálního polarimetru. Ø U metody CD srovnáváme absorbance levotočivě a pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla, jehož vlnová délka je blízká absorpčnímu maximu bílkoviny. Ø CD lze využít též pro studium struktury nukleových kyselin. t1 Obrázek ukazuje změny elipticity syntetického polypeptidu, obsahujícího dlouhé sekvence poly-glu, po přídavku trifluoroethanolu (TFE), který zvyšuje podíl a-šroubovice. http://www-structure.llnl.gov/cd/polyq.htm elipticita 11/10/2021 Karel Kubíček 67 Screen Shot 2011-11-04 at 9.07.05 PM.png Screen Shot 2011-11-04 at 8.53.56 PM.png Screen Shot 2011-11-04 at 8.47.49 PM.png Screen Shot 2011-11-04 at 8.46.06 PM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 68 Nejčastěji se CD vyjadřuje jako závislost na Delta Espilon. eL a eR jsou definované levo-a pravo-točivé extinkční koeficienty, l je délka dráhy a d je molární koncentrace vzorku. Rentgenstrukturní analýza Krystalová mřížka působí na rentgenové záření jako optická mřížka na viditelné světlo. Nastávají ohybové jevy a na stínítku se objevuje difrakční obrazec. Tyto obrazce mohou být matematicky analyzovány, aby se získala informace o rozložení elektronů v molekulách tvořících krystal. Screen Shot 2011-11-02 at 10.09.35 AM.png Screen Shot 2011-11-02 at 10.10.21 AM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 69 Screen Shot 2011-11-02 at 10.11.11 AM.png Screen Shot 2011-11-02 at 10.10.43 AM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 70 Screen Shot 2011-11-02 at 10.08.49 AM.png Screen Shot 2011-11-02 at 10.19.23 AM.png Screen Shot 2011-11-02 at 10.09.08 AM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 71 Krystalogram B-DNA získaný v r. 1952 Rosalindou E. Franklinovou, na jehož základě Watson a Crick navrhli dvoušroubovicový model struktury DNA. C. & W. dostali v r.1962 společně s Mauricem Hugh Frederick Wilkinsem NC za fyziologii a medicínu „za jejich objevy týkající se molekulární struktury nukleových kyselin a jejich významu při přenosu informací v živých organizmech“ crick xrayhelix franklin watson F W C 11/10/2021 Karel Kubíček 72 11/10/2021 Karel Kubíček 73 Confidence in structural features of proteins determined by X-ray crystallography (estimates are very rough and strongly depend on the quality of the data) Structural feature Resolution 5 Å 3 Å 2.5 Å 2 Å 1.5 Å Chain tracing - Fair Good Good Good Secondary structure Helices fair Fair Good Good Good Sidechain conformations - - Fair Good Good Orientation of peptide planes - - Fair Good Good Protein hydrogen atoms visible - - - - Good 11/10/2021 Karel Kubíček 74 Screen Shot 2011-11-04 at 8.26.38 PM.png XAS = X-ray Absorption Spectroscopy XANES = X-ray Absorption Near Edge Structure EXAFS = Extended X-Ray Absorption Fine Structure SAXS/EXAFS Screen Shot 2011-11-04 at 8.30.51 PM.png Screen Shot 2011-11-04 at 8.27.57 PM.png Screen Shot 2011-11-04 at 8.27.00 PM.png Screen Shot 2011-11-04 at 8.26.38 PM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 75 EXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Spectroscopy) poskytuje informace o nejbližších slupkách atomů sousedících s absorbujícím atomem Fe N N N N His 108 Met 75 Met 86 Met 110 Cu(I) b4 b5’ H:\Personal\Thesis\Pictures\XAS.jpg X-Ray Absorption Spectroscopy Cu(I)DR1885 DE=-10.3 eV Ligand r(Å) 2s2.103(Å2) R-exafs e(fit index) Fit1 (1shell) 2S 2.299 4(1) 0.446 0.49 Fit2 (1shell) 3S 2.301 9(1) 0.403 0.41 Fit3 (2shells) 3S 2.300 8(1) 0.334 0.29 1N§ 1.982 4(1) Fit4 (2shells) 3S 2.303 8(1) 0.305 0.27 1N* 1.999 7(2) § no MS *His, MS 11/10/2021 Karel Kubíček 76 SAXS – Small Angle X-ray Scattering (RTG rozptyl pod malým úhlem) Terminology 1)X-ray – diffraction / scattering 2)XS - X-ray scattering 3)SAXS/WAXS - Small/Wide Angle X-ray Scattering 4)SANS - --------”---------- Neutron ---”--- A)Otto Kratky (1902, Vienna-1995, Graz) B)Günter Porod (1919 near Villach, 1984 Graz) C)Dmitri I. Svergun D) I)Scattering II)Scattering curve III)Guinier plot IV)PDF (Pair-distribution function) V) a)Bead model b)Bead model - / SAXS - envelope 11/10/2021 Karel Kubíček 77 Experimental setup Screen Shot 2012-03-13 at 7.07.10 PM.png SAXS X-ray 11/10/2021 Karel Kubíček 78 (very tiny) bit of theory Screen Shot 2012-03-13 at 7.07.10 PM.png q=2k.sinq => q/2/k=sinq, k=2p/l => q=4p/l.sinq Often q is denoted as s k q 11/10/2021 Karel Kubíček 79 Screen Shot 2012-03-13 at 7.13.29 PM.png => 1st step: scattering to scattering curve 11/10/2021 Karel Kubíček 80 Screen Shot 2012-03-13 at 7.03.23 PM.png What can we learn from the scattering curve: 1)Shape of the studied molecule 2) 2)Fold 3) 3)Secondary structure 4) 11/10/2021 Karel Kubíček 81 Screen Shot 2012-03-13 at 7.09.19 PM.png All information from the scattering curve together 11/10/2021 Karel Kubíček 82 Screen Shot 2012-03-13 at 7.25.50 PM.png Bead model Spherical harmonics problem to be solved 11/10/2021 Karel Kubíček 83 Screen Shot 2012-02-15 at 4.19.01 PM.png SAXSvsNMR_Cid.png Evaluation of the experimental data Screen Shot 2012-03-14 at 2.23.47 PM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 84 NMR 1)Jaderný spin ¹ 0 (1H, 13C, 15N, 31P) - počet neutronů a počet protonů jsou sudá čísla (12C=6p+6n) Þ nulový spin - počet neutronů plus počet protonů je liché číslo (1H=p, 13C=6p+7n) Þ neceločíselný spin (i.e. ½, 3/2, 5/2) - počet neutronů a počet protonů jsou lichá čísla (2H=p+n) Þ celočíselný spin (i.e. 1, 2, 3) 1) n=g*B (1) – pokud vložíme do magnetického pole intezity B, jádro mající nenulový spin může absorbovat foton frekvence n. Frekvence n závisí na gyromagnetickém poměru g jader 2)Z kvantové mechaniky víme, že spin I může nabývat 2I +1 orientací Þ jádro se spinem ½ může mít dvě orientace v externím magnetickém poli– nižší / vyšší energie N S N S N S E=h n (2) 11/10/2021 Karel Kubíček 85 y:\Presentations\080513_KampusBohunice_Mornstein\gyromagnetic.ratio.jpg Resonanční podmínka w0 = -gB0 11/10/2021 Karel Kubíček 86 Nuclear Magnetic Resonance Stručně Z (1) a (2): E=h g B N S N S 11/10/2021 Karel Kubíček 87 N S N S 11/10/2021 Karel Kubíček 88 Magnet •supravodivé solenoidy na bázi •Nb a Sn ponořené do heliové a dusíkové láznĕ •He-lázeň ~4 K dále snížena J-T •pumpou na ~2.1 K •v současnosti až 22 Tesla •magnetické pole země ~50mT - y:\Presentations\080430_UFKL_NMRSeminar\26542.jpg y:\Presentations\080430_UFKL_NMRSeminar\wirestrain.gif y:\Presentations\080430_UFKL_NMRSeminar\n4a02f3.jpg (Nb, Ta)3Sn supravodič o šírce 0.81 mm s 271 vlákny vnořenými do OFHC mĕdĕné matrice 11/10/2021 Karel Kubíček 89 y:\Presentations\080430_UFKL_NMRSeminar\fig6.jpg y:\Presentations\080430_UFKL_NMRSeminar\c-mag-4.gif Díra cca 55mm He-plnění N2-plnění 11/10/2021 Karel Kubíček 90 y:\Presentations\080430_UFKL_NMRSeminar\6914430-0-large.jpg y:\Presentations\080430_UFKL_NMRSeminar\probe.jpeg y:\Presentations\080430_UFKL_NMRSeminar\probe4.jpeg y:\Presentations\080430_UFKL_NMRSeminar\probe5.jpeg NMR měřicí sonda y:\Presentations\080430_UFKL_NMRSeminar\LRC.jpg 11/10/2021 Karel Kubíček 91 D:\karelk\Presentations\070314-UFKLSeminar\FID.gif CW vs. Fourier transform NMR Solution II. FT-NMR Þ all frequencies in a spectrum are irradiated simultaneously with a radio frequency pulse. Following the pulse, the nuclei return to thermal equilibrium. A time domain emission signal is recorded by the instrument as the nuclei relax. A frequency domain spectrum is obtained by Fourier transformation. D:\karelk\Presentations\070314-UFKLSeminar\1pulse.gif FT time domain frequency domain RF pulse 90° 11/10/2021 Karel Kubíček 92 earth-magfield.jpg magnetic field = 0 magnetic field > 0 For NMR, nuclear spin is needed!!! Spin analogy to a compass needle 02/11/2020 Karel Kubíček 93 Electron Proton Neutron Atom = In the planetary model of the atom, an electron orbits a nucleus, forming a closed-current loop and producing a magnetic field with a north pole and a south pole. Molecule is hence a group of small magnetic fields and each atom within the molecule experiences different local magnetic field. A picture containing game Description automatically generated 02/11/2020 Karel Kubíček 94 Size Relaxation FID NMR line(width) after FT slow (i.e. long t2 time) medium fast A close up of a glove Description automatically generated A picture containing ball, game Description automatically generated A yellow ball Description automatically generated A close up of a logo Description automatically generated Time Time Hz Hz Hz 02/11/2020 Karel Kubíček 95 Size Relaxation FID NMR line(width) after FT slow (i.e. long t2 time) medium fast A close up of a logo Description automatically generated A close up of a logo Description automatically generated Time Time Hz Hz Hz e.g. Cholesterol Biomolecules 5-30 kDa Large molecules 50+ kDa 02/11/2020 Karel Kubíček 96 NMR as a tool for study structure, dynamics and interactions of biomolecules 1)Structure determination of NAs and proteins 2)Protein – metal interaction 3)Protein – ligand interaction For most of the modern applications, enrichment by 13C, 15N and often 2H needed! 1) Isotope Ground state spin Natural abundance [%] Rel. Sensitivity 1H ½ ~100__ 1.00x10+0 13C ½ 1.10 1.59x10-2 15N ½ 0.37 1.04x10-3 19F ½ 100__ 8.30x10-1 31P ½ ~100__ 6.63x10-2 12C 0 98.90 - 16O 0 ~100__ - 02/11/2020 Karel Kubíček 97 D:\karelk\Presentations\070314-UFKLSeminar\NMR-11.jpg r1,2 r1,2; r1,3; r2,3≤ 6 Å 1Å=1.10-10m NOE: NMR as a tool for study structure, dynamics and interactions of biomolecules 0) AA/NA sequence, resonance assignment, standard chemical shifts 1)Structure determination of proteins/NAs 2)NMR can provide detailed information about the structure at the atomic level resolution relying on the spatial proximity of two interacting protons – nuclear Overhauser enhancement (NOE) 3)Additional structural information can be obtained (residual dipolar couplings – RDCs, J-couplings, backbone chemical shifts - CSI) 4) 02/11/2020 Karel Kubíček 98 http://www.fbreagents.com/basics_nmr/9proteins.htm Structure calculation Iterative procedure of structure determination by NMR N C Nrd1 CID PDB ID: 2LO6 Uncertainty of the final structure represented as a family of 10-20 structures with deviation among individual members indicated by RMSD (typically <1.5 Å2) Final structure 02/11/2020 Karel Kubíček 99 1H / ppm Studying interactions by NMR titration 1)Slow exch. regime (on the NMR timescale) – individual peaks for each of the studied states (e.g. free / complexed forms of a protein), peak intensity representing population of a given state 2)Intermediate exchange regime 3)Fast exchange regime – single peak whose chemical shift position is given by the molar ratio of the states present in solution Slow (KD<1 mM) Free Bound 100% 0% 50% 50% 0% 100% Intermediate (KD ~1-10 mM) Free Bound 100% 0% 50% 50% 0% 100% Fast exchange regime (KD>10 mM) Free Bound 100% 0% 50% 50% 0% 100% 02/11/2020 Karel Kubíček 100 backbone.eps CID-15N-HSQC_JCh.png 1H-15N HSQC, cca 155 aa, well folded, 600MHz, 293K 15N-1H HSQC – Heteronuclear Single Quantum Coherence 1)1 peak ≅ 1 amino acid 2)good estimate of the protein folding status 3)no information about sequential assignment (which peak is which amino acid) 4)for sequential assignment third dimension needed (13C) 5)once assignment of the peaks known – HSQC is optimal tool for monitoring interactions by NMR through titrations (i.e. stepwise addition of small amounts of ligand to the nearly constant volume solution with the isotopically enriched molecule) 02/11/2020 Karel Kubíček 101 CID-15N-HSQC_JCh.png Screen Shot 2013-10-09 at 9.53.04 AM.png 1H-15N HSQC, cca 155 aa, well folded, 600MHz, 293K 1H 1D, Cavanagh et al., 2007 backbone.eps 02/11/2020 Karel Kubíček 102 EPR - Electron Paramagnetic Resonance When the molecules exhibit paramagnetism as a result of unpaired electron spins, transitions can be induced between spin states by applying a magnetic field and then supplying electromagnetic energy, usually in the microwave range of frequencies. The resulting absorption spectra are described as electron spin resonance (ESR) or electron paramagnetic resonance (EPR). 1st EPR experiment in Kazan (Tatarstan, USSR), E.K.Zavoisky on CuCl2.2H2O, rf source @133 MHz. 11/10/2021 Karel Kubíček 103 Screen Shot 2014-04-15 at 11.06.23.png 11/10/2021 Karel Kubíček 104 Screen Shot 2013-04-04 at 11.16.14 AM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 105 An unpaired electron can move between the two energy levels by either absorbing or emitting a photon of energy hn such that the resonance condition, hn= DE , is obeyed. This leads to the fundamental equation of EPR spectroscopy: hn= gemBB0. Experimentally, this equation permits a large combination of frequency and magnetic field values, but the great majority of EPR measurements are made with microwaves in the 9000–10000 MHz (9–10 GHz) region, with fields corresponding to about 3500 G (0.35 T). Furthermore, EPR spectra can be generated by either varying the photon frequency incident on a sample while holding the magnetic field constant or doing the reverse. In practice, it is usually the frequency that is kept fixed. 11/10/2021 Karel Kubíček 106 Screen Shot 2013-04-04 at 11.21.48 AM.png Screen Shot 2014-04-15 at 11.18.52.png 11/10/2021 Karel Kubíček 107 Screen Shot 2013-04-04 at 11.17.26 AM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 108 Screen Shot 2013-04-04 at 9.56.38 AM.png Screen Shot 2013-04-04 at 9.59.38 AM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 109 Mass spectrometry mass_spectrometry.gif Screen Shot 2011-11-05 at 10.27.31 PM.png 11/10/2021 Karel Kubíček 110 H:\Personal\Thesis\MALDI\PepMapMALDI.png H:\Personal\Thesis\MALDI\DR1885_digerite.png Peptide Mapping with MALDI TOF Tryptic digestion o/n 1:30-50 (trypsin:protein) Analysis with PAWS (Genomic Solutions, Inc.) Apo Cu1+ Cu2+ 11/10/2021 Karel Kubíček 111 11/10/2021 Karel Kubíček 112 Elektronová mikroskopie Credit to Jiří Nováček 11/10/2021 Karel Kubíček 113 Diagram Description automatically generated Optický mikroskop Elektronový mikroskop 11/10/2021 Karel Kubíček 114 Diagram Description automatically generated Optický mikroskop Elektronový mikroskop 11/10/2021 Karel Kubíček 115 Diagram, engineering drawing Description automatically generated FEG - Field Emission Gun Diagram Description automatically generated SEM – skenovací EM, TEM – transmisní/prozařovací EM 11/10/2021 Karel Kubíček 117 Diagram Description automatically generated Focused Ion Beam (FIB) + SEM 11/10/2021 Karel Kubíček 118 A picture containing text, outdoor Description automatically generated 11/10/2021 Karel Kubíček 119 Background pattern Description automatically generated 11/10/2021 Karel Kubíček 120 A picture containing graphical user interface Description automatically generated TEM – příprava vzorku 11/10/2021 Karel Kubíček 121 A picture containing text Description automatically generated e.g. uranyl acetate Diagram Description automatically generated Vitrifikace vzorku 11/10/2021 Karel Kubíček 123 https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.04.006 Diagram Description automatically generated A picture containing several Description automatically generated Určování 3D biomolekulárních struktur pomocí kryoEM 1) Sample preparation – 2) vitrification – 3) measurement – 4) particle picking – 5) 2D classification – 6) 3D model reconstruction A picture containing diagram Description automatically generated A picture containing diagram Description automatically generated Skubnik, K; Sukenik, L; Buchta, D; Fuzik, T; Prochazkova, M; Moravcova, J; Smerdova, L; Pridal, A; Vacha, R; Plevka, P, 2021: Capsid opening enables genome release of iflaviruses. SCIENCE ADVANCES Výpočetní + experimentání metody Elektroforéza ØElektroforéza – pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Při rovnoměrném přímočarém pohybu sférické částice o poloměru r, je elektrostatická síla působící na částici v rovnováze se silou tření, jež je dána viskozitou. Sílu tření lze vypočítat dle Stokesova vzorce: F = 6.p.r.h.v kde v je rychlost částice a h je dynamická viskozita prostředí. ØElektrické pole působí na částici silou: F = z.e.E kde z je počet elementárních nábojů nesených částicí, e je elementární náboj (1,602.10-19 C) a E [V.m-1] je intenzita elektrického pole v daném místě. ØRychlost částice je pak v důsledku rovnosti obou sil: 11/10/2021 Karel Kubíček 125 Elektroforetická pohyblivost ØElektroforetická pohyblivost u nezávisí na intenzitě elektrického pole. Je definována jako podíl rychlosti částice a intenzity elektrického pole. Platí: Poznámka. Elektroforéza s dodecylsulfátem sodným. Tato sloučenina, která nese jeden negativní elementární náboj, se váže definovaným způsobem k bílkovinám a eliminuje jejich vlastní elektrický náboj. Molekuly bílkovin se pak pohybují s různou rychlostí jen proto, že mají různou velikost (poloměr). 11/10/2021 Karel Kubíček 126 Zařízení pro elektroforézu Electrophoresis http://library.thinkquest.org/C0122628/showpicture.php?ID=0064 Gelová plotna Zdroj napětí Jamky v gelu pro vzorky Látkový knot Roztok elektrolytu 11/10/2021 Karel Kubíček 127 Měření membránových potenciálů ØMembránové potenciály se měří s pomocí skleněných mikroelektrod, tj. skleněných kapilár s velmi jemnou úzkou špičkou. Průměr otvoru na konci špičky musí být menší než 1 mm, aby nedošlo při zavádění do buňky k jejímu významnému poškození. Vnitřní prostor špičky kapiláry je naplněn roztokem KCl o koncentraci 3 mol.l-1. Jako elektroda srovnávací se používá elektroda stříbrochloridová umístěná do mimobuněčného prostoru. ØPro skleněné mikroelektrody je charakteristický vysoký vnitřní odpor (kolem 10 MW), takže potřebujeme pro měření vysoce kvalitní zesilovače, abychom zamezili zkreslení měřeného napětí. 11/10/2021 Karel Kubíček 128 Experimentální uspořádání pro měření membránových potenciálů kapilárními mikroelektrodami Pomocí skleněných mikroelektrod lze také měřit jiné elektrochemické parametry buněk a membrán, např. koncentraci některých iontů. Mohou být připraveny jako elektrody iontově selektivní pro Na+, K+, Ca2+, H+ … 11/10/2021 Karel Kubíček 129 Metoda patch-clamp („terčíkový zámek“) Některé iontové kanály mohou být předem uzavřeny nebo otevřeny, náplň mikroelektrody může obsahovat ligandy, schopné interagovat s iontovými kanály, a všeobecně jakékoliv látky, jež mohou ovlivňovat funkci membrány. Tato metoda umožňuje studium aktivity jednotlivých iontových kanálů nebo jejich malých skupin. Tupá skleněná mikroelektroda se přiloží k povrchu buňky nebo k části biologické či umělé membrány. Otvor na konci mikroelektrody je zcela uzavřen „terčíkem“ membrány a měřená elektrická napětí nebo proudy se proto týkají jen malého okrsku membrány, v němž se nalézá jen malý počet iontových kanálů. 11/10/2021 Karel Kubíček 130