ZAVODY PRŮMYSLOVÉ AUTO IVIATIZACE KQÖIRE ZÁVODY PRŮMYSLOVÉ AUTOMATIZACE KOŠÍŘE NOSITEL ŘÁDU PRÁCE odbytové odděleni, ul. R. Naskové 1, 150 56 Prah* 5 — Koiiře. Telefon : 52 18 41-9. 52 47 51 . Telegram: PRUMAUT KOSIRE Dálnopis : 121 45 4 IM A V O O počítací komůrka PODLE BURKERA Obchodně technické služby ZAVDDY F»R CJ MVS LOVÉ AUTOMAT1ZAC KOŠIŔ OBSAH 1. Použití 2. Technické údaje 3. Potrebné pomůcky 4. Přípravné práce 5. Pozorováni a počítáni 6. Výpočet krvinek 7. Čistení komůrky 3 3 5 6 7 9 11 1. POUŽITÍ Počítací komůrky M E 0 P T A s dělením počítacích síti podle BÚrkera se používá k počítaní červených a bílých krvinek a k počítání krevních destiček. 2. TECHNICKÉ ČDAJE Výška počítacího prostoru (hloubka komůrky) ., 0,10 +0,002 mm Počet počítacích síti ........................ 2 g Plocha jedné počítací sítě................... 9 mm Plocha pro počítání červených krvinek 2 12 (malý čtverec) ................ 0,0025 mm" » "Jfjô" ma Obsah prostoru nad malým 3 13 čtvercem..................... 0,00025 mm ■ —-—mm 4000 Plocha pro počítání červených krvinek (obdélník = 4 malé o 12 čtverce)..................... 0,01 mm « TfiQ~ mm 3 1 Obsah prostoru nad obdélníkem 0,001 mm « ,3 ľ ' 1000 mm Plocha pro počítání bílých krvinek (velký čtverec=16 ma- lých čtverců)................ 0,04 mm = t^t- mm Obsah prostoru nad velkým 3 13 čtvercem..................... 0,004 mm = mm Vzájemný poměr malého čtverce, obdélníku a velkého čtverce ... 1 : 4 : 16 3 Síla rytí počítacích sítí ..... 0,003 mm Nejvyšší numerická apertura objektivu mikroskopu pro počítání krvinek..........•...... 0,65 Vhodné celkové zvětšení mikroskopu pro počítání krvinek .......... 300 x až 400 x - 3 - # Celkové zvětšení o průměr zorného pole mikroskopu (v mm) s optikou MEOPTA: Okular H 6x H 8x H lOx 0 lOx 0 15x 0 20x Achromat. objektiv č.výr. 1-0702 1-0703 1-0704 1-0740 1-0741 1-0742 10x0.30 1-1022 60x 80x lOOx lOOx 150x 200x 1,8 1,6 1,3 1,6 1.3 0,8 20x0,45 45x0,65 1-1023 120x 160x 200x 200x 300x 400x 0,9 0,8 0,6 0,8 0.6 0,4 1-1030 270x 360x 450x 450x 675x 900x 0,4 0,35 0.3 0,35 0,3 0.2 Velký čtverec 55 mm íhilé krvinky) Malý čtverec 4o75 mm2 (červené krvinky) Obdélník (červené krvinky) Plocha 1 mm2 (bíle krvinky) POČÍTACÍ Sít KOMŮRKY 2.1 Složení komůrky Počítací komůrka MEOPTA (podle Burkera)má tyto části: a) základní skleněná deska s dvěma počítacími sítěmi b) krycí sklo (současně se dodává jedno náhradní krycí sklo) c) dva držáky krycího skla d) pouzdro na počítací komůrku 3.POTŘEBNĚ POMLČKY K pozorování a počítání krvinek dále potřebujeme: a) Jakýkoliv dobrý přesný mikroskop s křížovým vodičem preparátu. Výhodný je mikroskop s binokulární hlavicí, ježto umožňuje mikroskopické pozorování a počítání krvinek současně oběma očima. Pro počítání krvinek lze použít všech typů mikroskopů MEOPTA, jež se popříp, doplní křížovým vodičem preparátu MEOPTA (č.výr. 1-0947) pokud není mikroskop vybaven křížovým kulatým nebo čtvercovým stolem s vodičem preparátu. Vhodné jsou zejména tyto typy: D 716 SV (č.výrobku 1-0158) DN 716 Bi (Č.výrobku 1-0170) D 712 3V (č.výrobku 1-0156) po doplnění křížovým vodičem DN 712 Bi (č.výrobku 1-0168) preparátu MEOPTA (č.v.1-0947) Pro počítání krvinek se doporučuje toto optické vybavení: achromatický objektiv MEOPTA 20x0,45 (č.výr.1-0605) okulár ortoskopický 0 lOx (č.výr. 1-0740) okulár ortoskopický 0 15x (č.výr. 1-0741) b) Mísící pipety pro červené a bílé krvinky nebo mísící banky s odměrnými pipetami. c) Roztoky zřeďování krve: ca) Hayemův roztok k zřeďování krve pro počítání červených krvinek tohoto složení: sublimát............................ 0,5 g síran sodný .......................... 5,0 g - 5 - chlorid sodný................,., doplněno destilovanou vodou na ?00 cm3. 1.0 g cb)Turkův roztok k zředování krve pro počítání bílých krvi-nek tohoto složení ledová kyselina octová ............... l%ní vodní roztok gentianové violeti doplněno destilovanou vodou na 300 cm . d) Pinsety,zkumavky,hodinková sklíčka a jiné. 4.PŘÍPRAVNÉ PRÁCE 3o cm J cm a) Především si obvyklým způsobem připravíme mikroskop podle návodu,přiloženého k mikroskopu. Do výměnné objektivové hlavice zašroubujeme potřebné objektivy a do okulárového tubusu vložíme vhodný okulár. Většinou pozorujeme a počítáme červené krvinky achromatickým objektivem MEOPTA 25x0,45 a ortoskopickým okulárem MEOPTA 0 lOx nebo 0 15x„ Můžeme použít i Huygensových okulárú,s nimiž má mikroskop poněkud menší zorné pole. Zorné pole or toskopických okul árii je asi o třetinu větší než okulárú Huygensových. Bílé krvinky obvykle pozorujeme a počítáme achromatickým objektivem MEOPTA 20x0,45 a ortoskopickým okulárem MEOPTA 0 lOx nebo 0 15x. b) Na dokonale čistou počítací komůrku položíme krycí sklo,jež opatrně silněji přitlačíme na postranní vyvýšené opěrné plochy, až vzniknou Newtonovy barevné pruhy.Krycí sklo přidržíme dvěma pérovými držáky, c) V příslušných mísicích pipetách nebo mísících baňkách přesně zředíme odebranou krev a to pro počítání červených krvinek Hayemovým roztokem v poměru 1:200 (při chudokrevnosti výjimečně v poměru 1:100); pro počítání bílých krvinek Turkovým roztokem v poměru 1:20. d) Mísící pipetou nebo baňkou dobře protřepáváme po dobu dvou až tří minut, aby nastalo dokonalé promísení krve se zředující tekutinou. V pipetách však nesmí poklesnout výška hladiny krve. e) Z mí sici pipety (z kapiláry) odstříkneme trochu tekutiny, jež neobsahuje krev. f) Kapičku směsi vytlačíme mírným fouknutím z pipety a necháme ji volně ulpět na hrotu pipety; pipetu přiložíme ze strany ke skulině mezi plochou počítací sítě a krycího skla komůrky. Přenášená kapka nesmí být příliš velká, aby nebylo zaplaveno též druhé počítací pole za střední rýhou. g) Naplněnou počítací komůrku necháme ve vodorovné poloze asi tři minuty v klidu, aby se mohly krvinky usadit. h) Počítací komůrku položíme na stůl mikroskopu mezi raménka vodiče. Otevřeme úplně aperturní clonu kondenzoru a osvětlíme zespodu počítací pole komůrky. Pohledem ze strany pouhým okem pozorujeme zakalení naplněné komůrky.Nejeví-li počítací pole stejnoměrné zakalení, vyčistíme počítací komůrku a provedeme znovu její naplnění. 5.VLASTNÍ POZOROVÁNÍ A POČÍTÁNÍ a) Pozorování krvinek mikroskopem. Aperturní clonu kondenzoru poněkud přivřeme a zaostříme mikroskopem na krvinky,přičemž podle potřeby kondenzor snížíme tak, aby byly zřetelné krvinky i rytí sítě. 1 2 b) Červené krvinky počítáme v malých čtvercích { miu ) nebo v obdélnících í -j-j^j-mm2) , a to celkem v 80 malých čtvercích 1 0 nebo ve ?0 obdélnících, tedy na plose -g- mm « Pro přesnější určení počtu červených krvinek v krvi naplníme obě počítací pole komůrky příslušně zředěnou krví a v každém počí tací cm poli spočítáme krvinky v 80 malých čtvercích, tj. celkem v obou počítacích polích ve 160 malých čtvercích. Zjištěný počet krvinek dělíme dvěma, abychom dostali průměrný počet krvinek v 80 malých čtvercich,potřebný pro vlastní výpočet krvinek. - 6 - 7 - c) Bílé krvinky počítáme ve 125 velkých čtvercích,tj.na ploše 5 mm''. o Bílé krvinky můžeme počítat též na ploše 6 nebo 9 mm , a to tak, že sčítáme krvinky v 6 nebo 9 velkých čtvercových plochách, ohraničených trojitými čarami. (Každá o tato plocha má výměru 1 mm , při čemž jako hraniční čáru považujeme střední ze tří přímek.) d) Pozorování a počítání krvinek v jednotlivých čtvercích (obdélnících) provádíme postupně pomocí křížového vodiče preparátu (nebo křížového stolu s vodičem preparátu): ca) Po spočtení krvinek v jednom čtverci (obdélníku) posu-neme podélným posuvem vodiče počítací komůrku tak, aby další čtverec (obdélník) byl ve středu zorného pole mikroskopu. Tento postup opakujeme, až spočítáme krvinky v jedné radě počítacího pole komůrky. cb) Příčným posuvem vodiče (nebo příčným posuvem horní desky stolu) najedeme na další řadu, v níž opět postupně prohlížíme a počítáme krvinky způsobem uvedeným výše pod a), avšak posouváme podélným posuvem opačným směrem. cc) Po spočítání krvinek v celé řadě příčným posuvem posuneme komůrku na další řadu a celý postup opakujeme, až spočítáme krvinky v potřebném počtu čtverců (obdélníků) . e)Pro počítání krvinek platí toto pravidlo (podle Biirkera): Krvinky,které se dotýkají nebo leží na hraničních čarách čtverců nebo obdélníků, se počítají pouze tehdy,jde-li o horní pravou stranu čtverce (obdélníků), kdežto krvinky, které leží nebo se dotýkají dolní nebo levé strany, se nepočítají. Krvinka se však nepočítá, leží-li sice na horní straně, ale současně se dotýká levé hraniční čáry. Rovněž se nepočítá krvinka, která sice leží na pravé hraniční čáře, ale dotýká se současně dolní strany. Vzorový propočet krvinek f) Krvinky se uchycují též na spodní straně krycího skla komůrky a proto při počítání krvinek pohybujeme nepatrně mikrometric-kým posuvem mikroskopu (nejdříve snižujeme a potom zvyšujeme tubus), abychom nepřehlédli žádnou krvinku. 6. VÝPOČET KRVINEK 3 Pro stanovení počtu krvinek v 1 mm obecný vzorec: p.v.h.z P ■ y kde i nezředěné krve platí tento krve 3 - celkový počet krvinek v 1 mm p = počet spočítaných krvinek v = převratná hodnota plochy jednoho políčka, v němž jsou počítány krvinky h = převratná hodnota hloubky komůrky z = zředění krve y = počot políček, v nichž jsou počítány krvinky. Červené krvinky v 1 mm nezředěné krve vypočítáme při zředřní krve v poměru 1:200 a spočítání červených krvinek v 80 malých čtvercích (nebo ve 20 obdélnících) tak,že počet zjištěných červených krvinek násobíme číslem 10.000 (při zředění krve 1:100 násobíme číslem 5.000). - 8 - 9 - Bílé krvinky v 1 mm nezředěné krve vypočítáme při zředění krve v poměru 1:20 a spočítání bílých krvinek ve 125 velkých čtvercích tak, že počet zjištěných bílých krvinek násobíme číslem 40 (při zředění 1:10 násobíme číslem ?0). 6.1 Chyby počtu krvinek Při počítání krvinek provádíme všechny úkony pečlivě a přesně, zvláštní pečlivost věnujeme zejména těmto úkonům: 1. správnemu a přesnému zředění krve, 2. dokonalému promísení krve zřeďující tekutinou, 3. bezvadnému přiložení krycího skla, 4. zjištění rovnoměrného rozdělení krvinek v komůrce, 5. správnému sečtení krvinek v předepsaném počtu čtverců nebo obdélníků. Při méně pečlivém provádění těchto úkonů se může stát, že totiž základní počet krvinek v komůrce neodpovídá skutečnosti. Tato chyba se značně zvětšuje při propočtu krvinek v nezředěné krvi vynásobením příslušným koeficientem. V důležitých případech omezíme celkovou chybu v počtu krvinek též tím, že sčítáme krvinky ve větším počtu čtverců, případně spočítáme krvinky též v druhém počítacím poli a z obou počtů krvinek zjistíme průměrnou hodnotu, které použijeme pro další výpočet krvinek v nezředěné krvi. Při počítání červených krvinek je podle E. Pondera (viz knihu Netoušek: Nauka o krvi) možno omezit chyby,zaviněné zřeďováním krve a počítáním buněk v počítací komůrce až na +1 %. Chybu způsobenou nestejnoměrným rozdělením červených krvinek v komůrce lze obtížně vyloučit. -Hřední hodnota (J J této chyby je podle E. Pondera dána vzorcem. I = -CL . 100 (v %) v němž "p" znamená počet krvinek napočtený v komůrce. Při spočítání 1000 krvinek je střední chyba J;3,2 %, při spočítání 2Ó00 krvinek je střední chyba +.2,3 % - tedy chyba je tím větší, čím sečteme méně krvinek. Spočítá-ine-li pouze 500 krvinek, je střední chyba +4,5 %, a při-počteme-li k tomu chybu, jež je způsobována zřeďováním a počítáním buněk v komůrce a kterou jen pečlivou prací snížíme na +1 %, činí celková chyba asi +_6 %, tedy celkem 12 % čili 600000 červených krvinek při úhrnném počtu 5,000.000 červených krvinek. Chybu při počítání bílých krvinek odhaduje proí. Netoušek o pri sečtení 100 velkých čtverců (tj. plochy 4 mm )na + 500 bílých krvinek, tedy celkem 1000 bílých krvinek. Vzhledem k tomu se doporučuje v důležitých případech spočítat krvin- 2 2 ky na plose 6 mm nebo dokonce na ploše 9 mra , tj. na ploše celé počítací sítě komůrky. 6.2 Počítání krevních destiček V počítací komůrce MEDPTA s dělením podle Burkera je možno počítat též krevní destičky. Krev pro tento účel se mísí v poměru 1:200 s 3,6procentnlm roztokem citronanu sodného (Beránek). Krevní destičky se sčítají v 50 velkých čtvercích, ľro stanovení počtu krevních destiček v 1 mm krve se zjištěný počet krevních destiček násobí tisícem. 7. ČISTĚNÍ POČÍTACÍ KOMÚHKY Počítací komůrku s krycím sklem po použití ihned očistíme, a to nejprve vodou,potom lihem a nakonec éterem. Rovněž všechny příslušné potřeby,zvláště pipety.udržujeme v bezvadné čistotě. Po každém použití ihned řádně očistíme vodou,lihem a éterem. Zaschne-li náhodou krev v pipetách, odstraníme ji tím způsobem, že pipetu ponoříme na několik hodin do louhu nebo čpavku. Kapiláru pipet vyčistíme protažením koňskou žíní. Nikdy nesmíme používat drátku nebo injekčních jehel. ODBORNÁ LITERATURA O počítaní krvinek pojednávají zejména tyto knihy: Wolf, Mikroskopická technika Jírovec, Zoologická technika Netoušek, Nauka o krvi Foltýn, Laboratorní metody Popis a vyobrazení v tomto návodu jsou nezávazné a výrobní závod si vyhrazuje v duchu technického rozvoje a v zájmu uživatelů přístrojů provádět změny sloužící zlepšení funkce a vzhledu přístroje. Z toho důvodu se nemusí všechny údaje v textu a všechna vyobrazení vždy zcela shodovat s dodávaným přístrojem.