Základy klinických laboratorních oborů, které se uplatňují v diagnostice humánních chorob prof. MUDr. Dalibor Valík, Ph.D., KLM LF MU, FÚ LF MU …o které obory jde? • klinická chemie/biochemie/toxikologie • hematologie, hemostáza/hemokoagulační poruchy a transfusní medicína • imunologie a imunopatologie • lékařská mikrobiologie • patologie, molekulární patologie a molekulární diagnostika • …tradičně se uvádí, že cca 60-70% diagnostických rozhodnutí se odvíjí od laboratorních výsledků při cca 5% nákladem na laboratoře (Forsman, Clin.Chem. 1996) souhrnně – laboratorní medicína • historie: kde se objevil koncept klinické laboratoře • 1861, Dr. F.H.Brown, Boston MA: “…každá nemocnice by měla mít na konci oddělení malou místnost, která bude sloužit jako obecná laboratoř” • jednou z prvních v Evropě: 1886 v Mnichově, Hugo Wilhelm von Ziemssen • 1895 v USA, Filadelfie, The William Pepper Laboratory of Clinical Medicine • hematologie: Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723) • mikrobiologie: Louis Pasteur (1822-1895) • molekulární diagnostika, 1986, 1987 • …zásadní byl objev PCR, popsán v r. 1971, ale realizoval jej až Kary Mullis 1983 (dostal Nobelovu cenu) • v současnosti jsou zejména patrné tendence k agregaci laboratoří, automatizaci, vč preanalytických procesů, postanalytické fáze profil absolventa, alias - co bychom rádi, aby z vás bylo? • stručný, indikativní profil absolventa: • vzdělaný, komunikativní, zvídavý se zájmem o práci v klinické laboratoři v relevantních odbornostech s vědomím zásadní důležitosti laboratoře v diagnostickém procesu • kompatibilní se způsobem práce v klinické laboratoři (bezpečnostní standardy apod.,) adherence ke správné laboratorní praxi, s profesionálním respektem ke zkušenějším kolegům, respektování etických aspektů chování • součástí je ochota se vzdělávat v průběhu své profesionální kariéry (semináře, seznamování se s novinkami, kvalifikační rozvoj dle možností) základní pojmy pro metriku/metrologii laboratorních vyšetření • jednotky, resp. rozměr veličiny, která je výsledkem laboratorního testu • referenční meze, koncept normální Gaussovy distribuce, parametrické a neparametrické rozložení jednotky a veličiny • rozlišujme kvalitativní, semikvantitativní a kvantitativní vyšetření • kvalitativní = binární výsledek: pozitivní, negativní, teplo/zima, v medicíně také ale…bolí/nebolí • semikvantitativní = výsledek na hrubé škále, kupř. čtyřelementové: 0_+_++_+++, apod., • kvantitativní výsledek: vždy vztažen k veličině, resp. kvantitě kalibrantu užitého k ustanovení vztahu signál/koncentrace (tj. kalibraci) …malý historický exkurs: výborně zpracováno v: BLAHOVÁ, Kristýna. Vývoj měr a vah v českých zemích: bakalářská práce. Brno: Masarykova univerzita, Fakulta pedagogická, Katedra fyziky, chemie a odborného vzdělávání, 2020. Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Lukáš Pawera. • Blahová K: “…císař Ferdinand III. vydal reskript ke sjednocení jednotek v Brně a Olomouci, zavedl předchůdce katastru” • …..metrické jednotky: Francie v období po Velké francouzské revoluci • …..imperiální jednotky Britského impéria a USA • ,…i dnes kombinace (např. krevní tlak, kde se kPa neujaly ani v Evropě), britská/standardní míle, námořní míle, “uzly” pro vyjádření rychlosti v námořnictví, v lab. kupř: “psi” jako jednotka tlaku - HPLC o jaké jednotky jde – SI , a ty ostatní… u nás v ČR: vyhláška 264/2000 o základních měřicích jednotkách, atd… • …snaha u SI jednotek versus jednotky “ostatní”, angloamerické,… • …jednotky odvozené od “definitivní” metody, třeba gravimetrie (kg), jednotky záření, • metody jsou: definitivní, referenční, terénní (field) • jednotky “relativní”, konvenční, konsensuální (kupř. proteinové standardy WHO) biologická variabilita - zdroje • věková škála, • pohlaví jedince, • pracujeme s binárním pohlavím mimo skutečnost diagnostikovaných chromozomálních odchylek (XX, XY, varianty) • genetický fundament jedince • interakce genetika<>vývoj<>prostředí/environment • chronobiologie (biologické rytmy i) časové, ii kontextuální, např. fysiologický mestruační cyklus) zvláštnosti a specifika věkových období člověka • škála života člověka je cca 1- 100 let • růstovým a vývojovým obdobím je zejména dětský věk (pediatrická medicína), dospělý věk, následné presenium/senium, tj stáří • příklady: bilirubin neonatální vs dospělý, naproti tomu monoklonální gamapatie pohlaví jedince, • …pracujeme s binárním pohlavím mimo skutečnost diagnostikovaných chromozomálních odchylek (XX, XY, varianty) • diverzifikace a diference začínají být patrny v době puberty • kromě zjevných změn většinou endokrinologických se tyto změny také promítnou do některých laboratorních vyšetření (svalová hmota kreatinin, menstruační cyklus – RBC,železo genetický základ jedince • studiem se zabývá lékařská genetika s řadou subspecializací • je popsána celá řada genetických poruch a abnormalit (McKusick catalogue: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2686440/) • u některých je možnost tzv. screeningu, tj. procesu, kdy vzorek pacienta/novorozence je předmětem laboratorního vyšetření za účelem zjištění přítomnosti jedné ze screenovaných chorob • u nás v ČR zejména ÚDMP VFN Praha (https://udmp.lf1.cuni.cz/file/6111/metabolicka-prirucka-2020.pdf) • FN Brno – screening CF a endokrinopatie, dnes i pilotní program pro SMA,SCID a CF interakce genetika<>vývoj<>prostředí/environment • řada stavů spojených s tzv. náchylností na/k nějakému stavu….snížené tolerance některých potravin, léčiv • vědním obory jsou • farmako/genetika/genomika • ekotoxikologie, ekogenetika chronobiologie (biologické rytmy: i) časové, ii kontextuální, např. fysiologický mestruační cyklus) • základní dělení je: cirkadiánní, infradiánní, ultradiánní ve vztahu ke dni • existují delší cykly ve vztahu k fázi měsíce, roku, resp. ročnímu období, rytmus cirkannuální(https://www.google.com/search?source=univ&tbm=isch&q=c hronobiologie) …a zpět k jednotkám a referenčním intervalům • pojem “normalita” je vztažen ke statistické distribuci (Gaussovo normální rozložení) • od něj je odvozen tradiční koncept “normálních” hodnot (+- 1,96 SD,) • v praxi spíše neparametrická rozložení, vyjadřuje se percentily (centil, decil, kvartil, medián je střední hodnota 50. percentilu, modus je hodnotou nejčetnější Charakteristiky variability • Směrodatná odchylka (popř. rozptyl) • Ukazuje jak se každá jednotlivá hodnota liší od průměru • Variační koeficient • Relativní míra variability vztažená k průměru • Rozpětí • Vzdálenost mezi největší a nejmenší hodnotou • Mezikvartilové rozpětí • Rozpětí 50 % prostředních hodnot Když jsem v roce 1859 prohlásil, že evoluce postupuje nahromaděním nepatrných rozdílů mezi jedinci, uvedl jsem do biologického myšlení představu nepřetržité variability. Charles Darwin Přesnost, preciznost, pravdivost  Pravdivost = Těsnost shody mezi průměrem opakovaných naměřených hodnot a referenční hodnotou  Preciznost = Těsnost shody mezi opakovanými naměřenými hodnotami na stejném objektu  Přesnost = pravdivost + preciznost Referenční hodnota Referenční hodnota Normální rozdělení • Modeluje náhodné děje vyskytující se v přírodě či společnosti • Přesně řídí jen málo veličin, ale jeho význam spočívá v tom, že za určitých podmínek dobře aproximuje řadu jiných pravděpodobnostních rozdělení • Symetrické rozdělení, které je charakterizováno střední hodnotou (průměrem) a směrodatnou odchylkou Norma může označovat něco obvyklého nebo typického, avšak normou označujeme i velmi mocná etická omezení. Normální rozdělení • Je základem velkého množství statistických testů • Referenční rozmezí • „Zákon chyb“ Norma může označovat něco obvyklého nebo typického, avšak normou označujeme i velmi mocná etická omezení. Měření – odhad skutečné hodnoty II. Měření provedeme pouze jednou • Odhady 1. Bodový odhad Výsledek uvedeme jako: měření 2. Intervalový odhad Výsledek uvedeme jako: měření ± číslo (rozšířená nejistota) Nejistota = parametr přidružený k výsledku měření, který charakterizuje míru rozptýlení hodnot, které by mohly být důvodně přiřazeny výsledku Vychýlení měření Proč uvádět výsledek měření včetně nejistoty? Referenční hodnota Cut-off Oblast negativity Oblast pozitivity Proč uvádět výsledek měření včetně nejistoty? Referenční hodnota Cut-off Oblast negativity Oblast pozitivity Referenční rozmezí =hodnoty laboratorního testu, které ohraničují většinu hodnot referenční populace • Co je většina? 95 % (99 %) • Hranice (Meze) • Oboustranné DRM-HRM • Jednostranné pod HRM nad DRM • Co je referenční populace? Referenční populace =množina všech jedinců splňujících určité předpoklady, týkající se jejich zdravotního stavu, případně další definované požadavky (věk, pohlaví, rasa) • Zdraví jedinci či jedinci, kteří nemají chorobu ovlivňující příslušný laboratorní ukazatel • Volba požadavků na referenční jedince, je poměrně problematická záležitost a může zásadně ovlivnit výsledné hodnoty referenčních mezí a jejich interpretaci • Jedinci s chorobou nejsou uvažování! Referenční populace Výběr z referenční populace Statistické uvažování Metody určení referenčního rozmezí • Přímý × nepřímý způsob • Parametrický přístup × neparametrický přístup Průměr Směrodatná odchylka Výběrové populace Normální rozdělení 1. 2. 3. nejmenší 118. 119. 120. největší 2,5 %2,5 % 2,5 % 2,5 % 5 % zdravých jedinců bude mít hodnotu parametru mimo referenční rozmezí Co je třeba uvážit při použití Referenčního rozmezí • Odhad referenčních mezí je konstruován bodově, ale pro každou mez je možné konstruovat interval spolehlivosti • Každé měření má svou nejistotu DRM HRM Co je třeba uvážit při použití Referenčního rozmezí • Požadavky na referenční populaci (rasa, pohlaví,…) • Výsledek mimo referenční meze(abnormalita) může upozornit na patologický stav • je třeba kombinace s jinými statistickými nástroji Rozhodovací mez =Hodnota výsledku laboratorního testu, podle které se rozliší jedinci s přítomností choroby od jedinců bez její přítomnosti DRM HRM Zdraví Nemocní PozitivníNegativní Cut-off Rozhodovací mez =Hodnota výsledku laboratorního testu, podle které se rozliší jedinci s přítomností choroby od jedinců bez její přítomnosti DRM HRM Zdraví Nemocní PozitivníNegativní Cut-off SN SP FP FN Specificita= 𝑺𝑵 𝒁𝒅𝒓𝒂𝒗í Senzitivita= 𝑺𝑷 𝑵𝒆𝒎𝒐𝒄𝒏í Rozhodovací mez =Hodnota výsledku laboratorního testu, podle které se rozliší jedinci s přítomností choroby od jedinců bez její přítomnosti DRM HRM Zdraví Nemocní PozitivníNegativní Cut-off SN SP FP FN Specificita= 𝑺𝑵 𝒁𝒅𝒓𝒂𝒗í Senzitivita= 𝑺𝑷 𝑵𝒆𝒎𝒐𝒄𝒏í Rozhodovací mez =Hodnota výsledku laboratorního testu, podle které se rozliší jedinci s přítomností choroby od jedinců bez její přítomnosti DRM HRM Zdraví Nemocní PozitivníNegativní Cut-off SN SP FP FN Specificita= 𝑺𝑵 𝒁𝒅𝒓𝒂𝒗í Senzitivita= 𝑺𝑷 𝑵𝒆𝒎𝒐𝒄𝒏í ROC křivka Podíl falešně pozitivních (100-specificita) Podílsprávněpozitivních(senzitivita) Shrnutí Referenční rozmezí • Pouze zdravá populace • Překročení signalizuje abnormalitu • Mají svou nejistotu • Zdravý jedinec bude mít výsledek mimo referenční meze s pravděpodobností 5 % Cut-off • Populace s chorobou i bez • Překročení je spojeno s lékařskou akcí • Bodový pojem • Zdravý jedinec přesáhne cut-off s pravděpodobností (100specificita) % ,…děkuji za pozornost • statistická část: • RNDr. Bc. Iveta Selingerová, Ph.D.,MOÚ, FÚ LF MU