Mgr. Zuzana Strašilová
Krevní barviva – porfyriny, hemoglobin, bilirubin


Porfyriny
l


Porfyriny
§prekurzory hemu
§tetrapyrolové jádro (porfin)
§substiuenty (methyl, vinyl, acetyl, propionyl aj.)
§
§metaloporfyriny (Fe, Mg, Co, Pb)
§Podle počtu karboxylových skupin rozlišujeme
–okta (8, uroporfyrin), hepta (7), hexa (6), penta (5), tetra (4, koproporfyrin) porfyrin
l

Porfyriny
lPorfyriny - tetrapyroly, prekurzory hemu
lVznikají řadou na sebe navazujících reakcí
lDůležité 2 enzymy:
Øsyntáza kyseliny 5 – aminolevulové
– tvorba kyseliny 5 - aminolevulové (ALA) z glycinu a sukcinátu
Øporfobilinogensyntáza
lvznik porfobilinogenu z 2 molekul ALA
l
lGlycin + sukcinykoenzym A → kyselina 5.aminolevulová (ALA) → porfobilinogen (ze 2 ALA) →
uroporfyrinogeny → po oxidaci uroporfyriny→ koproporfyrinogeny → po oxidaci koproporfyriny →
protoporfyrin IX→ po přijetí atomu Fe vzniká červený hem
l
lPorfyrie -  defekt tvorby kteréhokoliv enzymu syntézy porfyrinů za stupněm ALA (typická vysoká
koncentrace ALA)

Syntéza hemu



http://www.reactome.org/figures/porphyrin_biosynthesis.jpg



Porfyriny
lPoruchy metabolismu porfyrinů:
lZískané (např. při otravě olovem)
lS dědičným podkladem – porfyrie
l

Porfyrie:
lMetabolické poruchy
lCharakterizovány:
–hromaděním porfyrinů nebo jejich prekurzorů v některých tkáních
–zvýšenou hladinou v plasmě či v erytrocytech
–zvýšeným vylučováním porfyrinů nebo jejich prekurzorů stolicí nebo močí
l
l

Porfyrie - dělení
vDle místa zvýšené koncentrace
–Erytropoetické
–Jaterní
–
–
vDle původu
–Vrozené
–Získané
l
vDle průběhu
–Akutní
–Chronické
–
–
vDle projevu
–Kožní
–Jaterní
l

Porfyrie – klinické příznaky
lAkutní bolest v břiše, neurologické příznaky
–Vysoká koncentrace  𝛿 – ALA a porfobilinogenu – neurotoxický účinek
–
lFotosenzitivita
–Intenzivní absorpce světla (400 nm) v kůži nemocných – aktivace porfyrinové molekuly – uvolnění
volných radikálů – poškození kůže
–

Porfyrie
A-K-Z-Vodítka Porfyrie: Typy, příznaky, příčiny a léčba - A-K-Z-Vodítka - 2021


Klinické projevy porfyrií
lPozdní kožní porfyrie (PCT)
l- vysoká zranitelnost kůže, spontánní tvorba puchýřům hyperpigmentace
l- klinická manifestace často iniciována současným jaterním postižením (nadměrná konzumace
alkoholu, hepatitida C, vzácně estrogeny)
l- neléčená může vést ke vzniku karcinomu jater
l
lAkutní ataky (AIP)
l- křečovité až agonizující bolesti břicha
l- další příznaky: např. tachykardie, zvracení, křeče
l
l
lPozn.: Důležitá prevence
l- akutní ataka často vyvolaná použitím léků, kt. nemocní nesmějí dostat
l- nutné, aby co nejširší okruh členů rodiny věděl, zda porfyrií trpí či nikoli
l- pokud je ale jedinec nositel genu, ale neprodělal klinický záchvat, je dg.          na základě
fluorescenčních a fotometrických metod obtížná -> zjišťování genové mutace
l

Porfyrie
lSymptomatická jaterní porfyrie (Porfyria cutanea tarda)
lnejčastější, patří mezi jaterní porfyrie (poškození jater)
lpři nedostatku uroporfirogen dekarboxylasy
lobjevuje se v pozdějším věku
l
lAkutní intermitentní porfyrie
lporucha přeměny porfobilinogenu a porucha metabolismu steroidů v játrech (hromadí se a indukují
tvorbu syntázy ALA)
l
lCelá řada dalších typů porfyrií
lRozlišení typů - analýza porfyrinů  nejčastěji v moči
l                        - zřídka v plasmě, erytrocytech a stolici
l                        - analýza enzymů  - výjimečně, v ČR se provádí ve
l                          VFN Praha (dehydratáza 5-aminolevulátu)




Stanovení porfyrinů
lKonjugované dvojné vazby – barevnost hemu, porfyrinů
lRedukované formy porfyrinů – bezbarvé,
po neenzymové oxidaci vzniklé porfyriny jsou barevné (absorbují záření s maximem 400nm, kyselé
roztoky nebo roztoky v org. rozpuštědlech po excitaci UV záření fluoreskují)

Stanovení celkových porfyrinů:



Stanovení jednotlivých porfyrinů:
lV kyselém prostředí po ozáření UV světlem (400 nm) silně fluoreskují v červené oblasti (550-650
nm)
lOkyselená moč metodou HPLC na reverzní fázi s použitím fluorescenčního detektoru (fosf. pufr,
metanol)
lMateriál – sbíraná moč za 24 hod, konzervovaná  Na2CO3
l                      Nutno chránit před
světlem

l
l Referenční rozmezí
l                    Uroporfyrin      :   do 0,050  µmol / 24 hod
l                    Koproporfyrin  :   do 0,280  µmol / 24 hod
l                    Heptaporfyrin  :   do 0,014  µmol / 24 hod
l                    Hexaporfyrin   :   do 0,006  µmol / 24 hod
l                    Pentaporfyrin  :   do 0,005  µmol / 24 hod
l

Stanovení celkových porfyrinů
Matouš B. a kol. Základy lék. chemie a biochemie. Galén Praha


Chromatogram s píky jednotlivých porfyrinů
ob1


Zdroj: TIETZ Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostic, Washington, 2006



Stanovení porfyrinů
a jejich prekursorů - kvantitativně
lStanovení porfobilinogenu (PBG) v moči - spektrofotometricky:
lReakce porfobilinogenu v kyselém prostředí
s p-dimetylaminobenzaldehydem
lVznik červeného kondenzačního produktu
lReferenční rozmezí: do 36 umol/l
l
l
lStanovení 5-aminolevulátu v moči - HPLC:
l5-aminolevulát se reakcí s acetylacetonem a formaldehydem převede na fluorescenční derivát
lStanovení HPLC metodou s fluorescenčním detektorem
lReferenční rozmezí: do 20 umol/l
l

Hemoglobin
l


Hemoglobin
§Transportní metaloprotein, červeně zbarvená bílkovina v erytrocytech
§Přenos krevních plynů - především O2 z plic do periferních tkání,
l      ale i části CO2 v opačném směru (reverzibilní vazba)
§Důležitý pufrační systém krve – vazba H+ na postranní řetězce His (především v periferní tkáni)
§Většina hemu se tvoří v kostní dřeni, při jeho odbourávání dochází
k tvorbě žlučových barviv
§Degradací globinu vznikají aminokyseliny
§Volný Hb se váže na haptoglobin – ochrana ledvin
l
§Koncentrace Hb v krvi:
l
B
P
U
ženy: 120-165 g/l
muži: 130-175 g/l
Do 50 mg/l
>300mg/l intravaskulární hemolýza
 0 arb.j.

Hemoglobin
§Tetramer – podjednotky spojeny H-můstky a iontovými vazbami
§Každá podjednotka složena z proteinové části – globinu a prostetické skupiny – hemu s centrálním
kationtem Fe2+ (pevně vázán koordinačně kovalentními vazbami)
lPatří mezi konjugované bílkoviny  - spojením bílkoviny s organickým komplexem obsahujícím kov
lHemoglobin tvořen z hemu (protoporfyrin IX s navázaným Fe2+ )
a bílkoviny globinu
lGlobin je tvořen 4 polypeptidickými řetězci: např. dvěma řetězci a
a dvěma řetězci b
lMolekula ve tvaru čtyřstěnu
lKaždý globinový řetězec je v jednom rohu, porfyrinové řetězce jsou umístěny v dutinách řetězců
s atomem Fe uprostřed
lHemoglobin: 4 polypeptidické řetězce (např. 2a a 2b), 4 hemy, 4 Fe
l
l

Hemoglobin
§několik typů molekul Hb – rozlišujeme podle globinových řetězců (α, β, γ, δ, ε a ζ):
l Adultní Hb (HbA):
l - HbA1 (2α2β): majoritní forma Hb u dospělých a dětí nad 7 měsíců
l - HbA2 (2α2δ): minoritní forma Hb dospělých
l
l Fetální Hb:
l - HbF (2α2γ): tvořen u plodu, po narození je odbouráván a nahrazován Hb A;
l u novorozenců až 70% celkového Hb
l
l Embryonální Hb
l - tvořen u embryí buňkami krevních ostrůvků žloutkového váčku v prvních týdnech vývoje, později
je nahrazen Hb F
l - Gower I (2ζ2ε), Gower II (2α2ε), Portland (2ζ2γ)
l
l
Podíl Hb u dospělých:
96% HbA1 (a2b2)
2-3% HbA2 (a2d2 )
1 % HbF (a2g2)

Deriváty hemoglobinu
lOxy-/deoxyhemoglobin (oxy/deoxyHb) – s navázaným O2 nebo bez navázaného O2 (železo ve formě Fe2+,
v oxidované i neoxidované formě)
l
lKarbaminohemoglobin (HbCO2) –  fyziologický komplex s oxidem uhličitým (CO2 navázaný přes
-NH2 konec β řetězce)
l
lKarbonyl /Karboxyhemoglobin (COHb) - vniká při otravách s CO reversibilní vazba CO, který se na
Fe2+ váže asi 200-300x pevněji než O2) - i když je vazba reverzibilní, za normálního tlaku jej O2 z
vazby nevytlačí; snížená schopnost krve transportovat kyslík ⇒ tkáňová hypoxie (kuřáci, otrava CO),
konc. v krvi
< 0,5 %
l
lSulfhemoglobin – směs oxidovaného a částečně denaturovaného Hb vzniklého během oxidativní
hemolýzy, během oxidace Hb vazba atomu síry, nemůže vázat kyslík ale CO ano
lKyanhemoglobin (HbCN) – otravy kyanidy
l
l

Deriváty hemoglobinu
lMethemoglobin (metHb) – vzniká z hemoglobinu oxidací železa Fe2+ na Fe3+
l      - neschopnost reverzibilně vázat kyslík, normálně konc. v krvi pod 1,5 %
l - hnědé zbarvení krve
l - zpětná redukce: NADH methemoglobin reduktáza (není plně vyvinutá u dětí do 1 roku, navíc: u
dětí větší aktivita interstinální flóry (hlavně E.coli) = větší redukční schopnost – přeměna
dusičnanů na dusitany)
l = riziko methemoglobinemie u dětí při pití vody s obsahem              dusičnanů
l    - oxidaci Fe2+ na Fe3+ mohou způsobovat např. i anilíny (barviva)      nebo sulfoamidy
(léčiva)
l      -  Kongenitální methemoglobinémie - údržba Fe2+ narušena nedostatkem NADH methemoglobin
reduktázy (riziko methemoglobinemie u dětí při pití vody s obsahem dusičnanů)
l - Metabolická acidóza nebo kóma  - zvýšení konc. methemoglobinu
l      -  Hladiny nad 70% mohou být letální
l

Deriváty hemoglobinu
lGlykovaný Hemoglobin (HbA1C)
-neenzymatická vazba glukózy na řetězce globinu udává se v mmol glykovaného/mol celkového
hemoglobinu
-za normálních podmínek asi 20 – 42 mmol/mol,
l      u dobré kompenzace diabetu do 53 mmol/mol
-parametr pro zpětné sledování compliance pacienta při léčbě diabetu
-Vysoká hodnota (>60 mmol/mol] – vysoké riziko rozvoje dlouhodobých komplikací (retino-, nefro-,
neuro-, kardiopatie)
-Posouzení dlouhodobé kompenzace diabetu (6-8 týdnů zpětně)
l

Talasémie, Hemoglobinopatie
lHemoglobinopatie:
lStrukturální abnormality jednoho nebo obou globinových řetězců (záměna aminokyseliny v řetězci)
lVíce než 900 typů, většina se klinicky nemanifestuje
lVíce než 100 druhů anemií má nestabilní a či b globinové řetězce – nestabilní hemoglobinová
hemolytická anémie
lSrpkovitá anémie - u homozygotů defekt  tvaru erytrocytů, anémie, bolest kloubů, infarkt různých
orgánů - S forma hemoglobinu (záměna kys. glutamové za valin)
l
lTalasémie:
lDědičné poruchy - změna poměru syntézy jednoho či druhého  globinového řetězce
la -talasémie (Afrika, jihovýchodní Asie) – redukce a řetězců
lb -talasémie (Středomoří, Indie, jižní Čína) – redukce b řetězců
lMnožství variant, kombinace talasémií
lNěkdy bez klinických příznaků, jindy s výraznou anémií
l

§Spektrofotometrické měření – tHb i jeho deriváty mají charakteristická absorpční spektra ve
viditelné oblasti záření
l     ⇒ typická výrazná absorpční maxima v oblasti 400–430 nm
l     (Soretův pás), další absorpční vrcholy jsou podstatně nižší
§
§

Stanovení hemoglobinu
lNejčastěji v plné krvi
lStopy v séru, plasmě, moči a stolici  - na základě pseudoperoxidázové aktivity - hem obsahující
Fe2+ katalyzuje oxidaci některých barviv benzidinového typu peroxidem vodíku
l
lStanovení Hb v plné krvi s hexakyanoželezitanem (Drabkin) –
l     referenční metoda (dříve jako součást stanovení krevního obrazu,1966 mezinárodní standard,
pomalá a nesnadno se automatizuje, toxický odpad):
lHb se lyzačním roztokem (hypotonický pufr) uvolní z erytrocytů
lHb + Fe (CN) 63- ® MetHb + Fe (CN)64-
lMet Hb + CN- ® MetHbCN
lVznik kyanidového komplexu, měří se fotometricky při 540 nm
l

Stanovení Hb v plné krvi
lSoučást  stanovení krevního obrazu (na hematologických automatech ):
l      - nejprve se přídavkem speciálního roztoku zlyzují erytrocyty
l      - pak se přidá transformační roztok – vzniká komplex lauryl sulfát  sodný – Hb (Sysmex) nebo
imidazol – Hb.
l      - vzniká opticky stálý komplex barevný komplex – stanoví se fotometricky
l       - metoda rychlá, netoxická, snadno se automatizuje, přesně měří i vzorky s obsahem
methemoglobinu a kontrolní krve
lV biochemii jako součást ABR analyzátorů - měření absorpce světla v plné krvi (využití rozptylu
světla červenými krvinkami - světelným zdrojem je laser
l
l

Stanovení derivátů hemoglobinu
(v plné krvi)
lProvádí se na oximetrech -samostatné přístroje
l      - oximetrický modul součást přístrojů na  ABR
lDeriváty hemoglobinu - měří se spektrofotometricky na základě Lambert-Beerova zákona
lStanovuje se celkový hemoglobin, oxyhemoglobin, karbonylhemoglobin, methemoglobin a sulfhemoglobin
lK methemoglobinu i sulfhemoglobinu jsou rovněž popsány fotometrické metody
l

Stanovení hemoglobinu
lStanovení glykovaného hemoglobinu:
lStanovení frakce HBA 1c  zvýšené u diabetiků
lMetody HPLC, kapilární elfo
l
lStanovení hemoglobinu ve stolici:
lScreening na OK – viz. screeningová stanovení
l
lStanovení hemoglobinu v moči:
lSoučást chemické analýzy moče s diagnostickými proužky

Stanovení volného hemoglobinu v plasmě nebo séru
l< 50 mg/l
lMetoda pro zjištění intravaskulární hemolýzy  (> 300 mg Hb/l)
lŠetrný odběr  - nádobka s heparinátem litným, stáčet při 2000ot/min
l
lRuční metoda:
lAbsorpční spektrum při 340 – 600 nm, derivuje se
l    max. 403 – 405 nm
l
lMetoda na automatickém analyzátoru:
lsemikvantitativní stanovení
lvyužívá měření sérových indexů (hemoglobin, lipidy, bilirubin).
lproměřuje se absorbance při  šesti vlnových délkách (480, 505, 570, 600, 660 a 700 nm)

Identifikace hemoglobinových variant
l
lDříve se používala  elektroforéza
lDnes dominují molekulární techniky, imunometody, HPLC,  kapilární elektroforéza a MS

Bilirubin
lLineární tetrapyrolové barvivo, hydrofobní charakter
lPřirozené žluté barvivo
lNení  jednotná látka - řada tetrapyrolů
lžlučové barvivo, nadbytek → žluté zabarvení sliznic a kůže – žloutenka (ikterus) lProdukt
katabolismu hemoproteinů (hemoglobin, myoglobin, katalasa, cytochromy) lVětšina (85%) vzniká z
uvolněného hemoglobinu při rozpadu erytrocytů
lV krvi většina bilirubinu vázána na albumin
l
Image result for bilirubine

Odbourávání Hb
lRetikuloendotelový systém (RES): játra, slezina, kostní dřeň
lŽivotnost erytrocytů 120 dní
lRozpad ery → uvolnění Hb → hem → biliverdin → nekoj. bilirubin → konj. bilirubin (játra) → žluč →
urobilinogen (střevo)  → sterkobilin (stolice) / urobilin (moč)
l
lDegradace hemu:
lBiliverdin (zelený) → nepřímý bilirubin (žlutý), ve vodě nerozpustný
lBilirubin  vázaný  na albumin  transportován do jater
lV játrech extrahován hepatocyty, uvolnění vazby na albumin, vazba na kyselinu glukuronovou – stává
se ve vodě rozpustným
lKonjugovaný bilirubin vylučován žlučovými cestami do tenkého střeva
lVe střevě redukce na bezbarvé urobilinogeny, které se dále přeměňují na další barevné produkty
urobiliny, sterkobiliny (oranžová barviva)
lČást vstřebána zpět do jater (enterohepatální oběh), část vylučována močí a stolicí
lU zdravého člověka se močí žádný bilirubin nevylučuje










Konverze hemu na biliverdin
a redukce biliverdinu na bilirubin


Hemová skupina, bilirubin
hem
bilirubin
Image result for bilirubine
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/be/Heme_b.svg/1024px-Heme_b.svg.png

Bilirubin- přímý a nepřímý
lBilirubin přímý
–Dává po přidání směsi diazočinidel k séru přímo zbarvení
–Přímý odpovídá bilirubinu konjugovanému - podíl, který již prošel játry, kde byl konjugován s kys.
glukuronovou
–
lBilirubin nepřímý
–Nerozpustný ve vodě, vázaný na albumin, dosud játry neprošel
–Nekonjugovaný, je třeba uvolnit z vazby na albumin (kofeinu, benzoátu sodného)
–Toxicita – proniká do lipofilní tkáně, včetně CNS
–
lSérum nutno chránit před přímým světlem – pokles

Ikterus
(hyperbilirubinemie)
lPrehepatální (hemolytická) žloutenka
–Zvýšený rozpad erytrocytů
–↑ nepřímý bilirubin v séru
–Negativní nález v moči
–Hemolytická anemie, novorozenecká žloutenka, Rh inkompatibilita matky a plodu
–
lHepatální (jaterní) žloutenka
–Poškozené hepatocyty (alkoholem, toxiny, viry)
–↑ celkový, konj. bilirubin v séru
–Pozitivní nález v moči
–
lPosthepatální (obstrukční) žloutenka
–Uzávěr žlučových cest (litiáza, nádor...)
–↑ celkový, konj. bilirubin v séru
–Pozitivní nález v moči
–Úplná obstrukce → přerušení odtoku žluči → absence degradačních produktů bilirubinu → acholická
stolice (šedo-bílá)
l

Referenční hodnoty
lBilirubin celkový S/P:
l               dospělí   do 20 umol/l
l               novorozenci 1den do 100 umol/l
l               novorozenci 2dny do 120 umol/l
l               novorozenci 3dny do 205 umol/l
l
lBilirubin přímý S/P:
l               dospělí    do 5 umol/l
lU     0 arb. jednotek
l

Bilirubin
lDoporučená rutinní  metoda: Jendrassik – Gróf, fotometrické metody s DCA a DPD
l
lReferenční metoda: Doumas – Perry

Stanovení bilirubinu - historie
lReakce bilirubinu s diazotovanou kyselinou sulfanilovou – Ehrlich v r. 1883 - současné metody z
reakce vychází
l

Stanovení bilirubinu
lMetoda  Doumase - Perry (r. 1985):
lVychází z metody Jendrassik – Gróf,
l     všechny kroky optimalizovány a specifikovány
l

Stanovení bilirubinu celkového a přímého
  s diazotovanou kyselinou sulfanilovou
lMetoda Jendrassik – Gróf ( r. 1938):
lAzokopulační metoda
lPřidat diazotovanou kyselinu sulfanilovou (činidlo z dusitanu sodného a kyseliny sulfanilové)
lVznik červeně zbarveného azobilirubinu s abs. max. 440 nm (interferuje hemolýza)
lModrá forma azobilirubinu – po 10 minutách k reakci přidat NaOH a vínan sodno-draselný - 600 nm,
hemolýza nevadí
lCelkový bilirubin - po přídavku akcelerátoru  - kofein + benzoát (Při stanovení bilirubinu
konjugovaného se tento krok vynechá)
lPři stanovení přímého bilirubinu reakci zastavit kyselinou askorbovou
l
l

Kopulace bilirubinu s diazotovanou kyselinou sulfanilovou - tvorba azobilirubinu
3


Stanovení bilirubinu celkového s DPD
lCelkový bilirubin v přítomnosti vhodného solubilizačního činidla kopuluje s diazoniovými ionty v
silně kyselém prostředí lRychlá reakce dichlorofenyldiazonium tetrafluoroborátu (DPD) s bilirubinem
-  tvorba  azobilirubinu
l                                               kyselina
l    Bilirubin + diazoniový iont  ----------> azobilirubin
l
lIntenzita červeného zabarvení je přímo úměrná celkovému bilirubinu a může být stanovena
fotometricky
lV praxi nejrozšířenější metoda
lHemolýza ruší až od vysokých koncentrací hemoglobinu

Stanovení bilirubinu
l
lEnzymové stanovení bilirubinu přes biliverdin:
lOxidace bilirubinu kyslíkem na zelený biliverdin
– s bilirubinoxidasou
lMěří se pokles absorbance – 424 - 465 nm
lBěžně se nepoužívá
l
lStanovení bilirubinu přímou spektrofotometrií
u novorozenců:
lAbsorbance se měří při 454 nm
lMetoda nelze použít u starších - přítomnost  karotenu a jiných pigmentů
l
l

Interpretace biochemických nálezů
lKámen žlučníku
lJaterní selhání
lVirová hepatitida
lAlkoholismus
lPorfyrie