Princip molekulárně genetické diagnostiky Rozpoznání a identifikace mutací v genech, které jsou v asociaci s danou chorobou. Jakmile je identifikována genetická příčina onemocnění na úrovni DNA, může se vyvinout specifický test k analýze relevantních genetických charakteristik pacienta Není zatím možné vyšetřit, zda proband bude trpět jakoukoliv dědičnou chorobou, vždy se vyšetřuje možnost poškození určitého konkrétního genu. Existují i vyšetření, které nezapadají do této definice, z těch běžných např. molekulárně genetická detekce aneuploidií Princip molekulárně genetické diagnostiky Rozpoznání a identifikace mutací v genech, které jsou v asociaci s danou chorobou. Jakmile je identifikována genetická příčina onemocnění na úrovni DNA, může se vyvinout specifický test k analýze relevantních genetických charakteristik pacienta Není zatím možné vyšetřit, zda proband bude trpět jakoukoliv dědičnou chorobou, vždy se vyšetřuje možnost poškození určitého konkrétního genu. Existují i vyšetření, které nezapadají do této definice, z těch běžných např. molekulárně genetická detekce aneuploidií SEKVENOVÁNÍ EXOMŮ, GENOMŮ V molekulárně genetické diagnostice jsou dva základní a navzájem zcela odlišné metodické přístupy vyšetření: •nepřímé (gene tracing) •přímé (direct testing). Molekulárně genetická diagnostika Přímá molekulárně genetická diagnostika Detekce kauzálních mutací v odpovědném genu vždy potvrdí klinickou diagnózu musíme znát: • gen , který má být analyzován • standartní (wild type) sekvenci tohoto genu Přímá molekulárně genetická diagnostika Metody detekce známých mutací (scoring) v genu asociovaném s danou chorobou Metody přímého vyhledávání neznámých mutací (scanning) v genu asociovaném s danou chorobou Metody detekce známých mutací (scoring) detekce určité kauzální mutace pro danou chorobu specifickou metodou Detekce známé sekvenční změny je možná u: 1) chorob s předpokládanou alelickou homogenitou, tzn. že patologická alela příslušného genu je reprezentovaná  jedinou mutací (srpkovitá anemie)  omezeným počtem mutací (1-antitrypsinový deficit)  rozsáhlou řadou mutací rozmístěných přes celý gen, kdy jedna nebo vícemutací se vyskytují s prevalující četností (CFTR, DMD)  expanzí trinukleotidových opakujících se sekvencí (HD, MD) 2) v rodinách s již charakterizovanou mutací v příslušném genu ) ve výzkumu (k potvrzení kandidátního genu a k odlišení nepatogeního polymorfismu) Přímá molekulárně genetická diagnostika Příklady chorob s vymezeným počtem mutací Srpkovitá anemie mutace E6V v HBB genu Cystická fibróza mutace F508del v CFTR genu Huntingtonova chorea, Myotonická dystrofie, Fragilní X nestabilní expanze trinukletidových repeticí Hemofilie A velka inverze v genu pro faktor 8 Duchennova muskulární dystrofie 60-70% mutací tvoří velké delece Tay-Sachsova choroba inzerce 4pb v exonu 11 genu HEXA Lebrova optická atrofie mitochondriální mutace nukleotidu v pozici 3460, 11778, 14484 Metody detekce známých mutací (scoring) detekce určité kauzální mutace pro danou chorobu specifickou metodou Amplifikace úseku s předpokládanou delecí detekce delecí Restrikční analýza PCR produktu mutací vzniká nebo zaniká specifické místo v DNA, rozlišované restikčním enzymem Hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy detekce bodových mutací PCR s alelově specifickými primery (ARMS test) detekce bodových mutací PCR s primery ohraničujícími předpokládané delece v DNA úspěšná amplifikace odhalí přítomnost specifické přestavby v DNA Analýza teploty tání PCR produktu pomocí real-time PCR změna teploty tání v porovnání s pozitivní a standartní kontrolou odhalí specifickou sekvenční změnu Triplet Primed PCR detekce expanze trinukleotidových repeticí v DNA Multiplex Ligation Probe Amplification MLPA detekce rozsáhlých delecí a duplikací, vhodná pro stanovení SNP genotypů a testovanání metylací v promotorové oblasti genů Přímá molekulárně genetická diagnostika • Metody přímého vyhledávání neznámých mutací (scanning) postupné nebo multiplexní screenování úseků genu asociovaného s danou chorobou pomocí vyhledávacích metod odhalí jakékoliv odchylky v analyzované sekvenci DNA pacienta ve srovnání se standartní sekvencí neodliší patogenní a nepatogenní změny v sekvenci DNA jsou náročnější časově i finančně Přímá molekulárně genetická diagnostika Přímá DNA diagnostika Metody přímého vyhledávání neznámých mutací (scanning) Přímá molekulárně genetická diagnostika Jednořetězcový konformační polymorfismus (SSCP) jednoduchá metoda doporučuje se pro krátké sekvence DNA neohaluje pozici změny Denaturační gradientová elektroforéza (DGGE) vysoká citlivost nutné primery s GC-clampy neodhaluje pozici změny Heteroduplexní analýza (HD) jednoduchá metoda doporučuje se pro krátké sekvence DNA omezená citlivost neodhaluje pozici změny Detekce zkráceného proteinu (PTT) vysoká citlivost pro terminační mutace pouze pro terminační mutace odhaluje pozici změny Analýza teploty tání na real-time PCR, HRM vysoká citlivost doporučuje se pro sekvence cca 250 bp neodhalí pozici změny Sekvenování detekce veškerých změn v DNA nadbytek informací plně charakterizuje mutace Scoring kauzálních mutací Scanning kódující oblasti genu Restrikční analýza ARMS Hybridizace Analýza teploty tání (Real-time PCR) Vyhledávací metody (SSCP,DGGE, DHPLC) Přímé sekvenování Identifikace dosud nepopsané mutace ??? Přímá molekulárně genetická diagnostika Aby mohla být sekvenční varianta detekována k prediktivnímu genetickénu testování potřeba nezávislého důkazu, že je patogenní •genetická charakterizace - aspekty evoluční konzervace - kosegregace mutace s chorobou v nejméně 2 rodinách - absence u 100 zdravých kontrol (<1%) •funkční charakterizace -rekombinantní in vitro exprese na definovaném genetickém pozadí -zkouška funkce proteinu s charakterizovanou mutací v ex vivo tkáních neznámá mutace – kauzální mutace??? Přímá molekulárně genetická diagnostika Využití polymorfních míst lidského genomu  Identifikace osob/vzorků DNA (A. Jeffreys 1985) (lidé obvinění z kriminálních činů, oběti katastrof)  Určování paternity (VNTR, STR)  Nepřímá diagnostika monogénních chorob  Hledání nových genů (poziční klonování genů)  SNP a multifaktoriální choroby Nepřímá diagnostika Nepřímá diagnostika gelová elektroforéza kapilární elektroforéza Nepřímá diagnostika Vazebná analýza je umožněna: – v rodinách s dvěma a více jedinci s klinicky potvrzenou diagnózou – rozlišením dvou chromozomů pomocí markerů na DNA – přiřazením DNA markerů (tj. chromozomu) k patologii v rodině Základní principy nepřímé DNA diagnostiky 1) odlišení dvou chromozomů rodičů (heterozygozyta markerů) 2) určení fáze (určení haplotypu - souboru alel polymorfních míst ve vazbě) 3) určení haplotypu (chromozomu) asociovaného s patologií v rodině Přísná rodinná specifita Nikdy nepotvrzuje diagnózu užitím vazebných markerů v rodinných studiích odhalí chromozom v asociaci s nemocí v rodině Nepřímá diagnostika chr.n chr.n chr.n chr.n [mt]+[=] [?]+[=] [mt]+[?] [=]+[=] [A1]+[ A3] [A1]+[A2] [A1]+[A2] [A1]+[A3] informativní Nepřímá diagnostika chr.n chr.n chr.n chr.n [mt]+[=] [mt]+[?] [=]+[=] [A1]+[A3] [A1]+[A1] [A1]+[A1] [A1]+[A3] neinformativní Nepřímá diagnostika Nepřímá diagnostika Neurofibromatóza typu 1 135 135 181 185 135 131 181 179 131 131 179 179 135 131 181 179 135 131 187 179 131 135 179 179 135 131 181 179 Polymorfní systémy GXAlu / i27b IVS38GT /i38 131 131 179 179 Autozomálně dominantní dědičbńost neznámá mutace haplotyp v asociaci s neznámou mutací A A 6 6 A C 3 5 A B 3 1 A B 3 1 A A 2 3 A C 2 2 A C 3 5 C A 5 6 C A 5 6 B A 1 3 A A 3 2 A D 2 2 A A 2 2 A D 2 2 A D 2 2A C 3 2 F508del neznámá mutace Polymorfní systémy IVS17BTA alely 1 -6 IVS8BTA alely A - D haplotyp v asociaci s neznámou mutací A D 3 2 Nepřímá diagnostika Cystická fibróza Autozomálně recesivní dědičnost Cystická fibróza Nepřímá diagnostika Lokalizace extra a intragenních polymorfních míst genu CFTR CFTR XV-2C TaqI KM19 PsrI J44 Xba1 IVS6A (GATTI)n IVS8 (CA) T854T AvaII IVS17b (CA)n TUB20 PrsII 0 50 100 150 200 230kb Nepřímá diagnostika Duchennova svalová dystrofie 243 251 178 193 251 242 175 190 251 242 153 198 243,243 251,251 175,178 190,193 243,251 251,242 175,153 190,190 243 251 175 190 243 251 178 193 243,251 251,242 175,153 190,198 Legenda STR50 STR49 STR45 STR50 243 251 175 190 neznámá mutace haplotyp v asociaci s neznámou mutací X vázaná dědičnost Duchennova svalová dystrofie Nepřímá diagnostika STR44 STR45 STR49 STR50 5´(CA)n 3´(CA)n 15´UTR 3 4 52 6 12 13 44 45 46 47 48 49 50 79 3´UTR Legenda •5´(CA)n alely 172 – 184 pb •pERT 87-8/Taq I alela 145 pb (-), 71 pb a 74pb (+) •pERT 87-15/BamH I alela 216 pb (-), 166 pb a 50 pb (+) •STR sekvence /(CA)n/: STR44 alely 174 – 204 pb, heterozygozyta 87% STR45 alely 156 – 184 pb, heterozygozyta 89% STR49 alely 227 – 257 pb, heterozygozyta 93% STR50 alely 233 – 251 pb, heterozygozyta 71% •3´(CA)n alely 131 – 137 pb Taq I BamH I Polymorfní místa v dystrofinovém genu Duchennova svalová dystrofie Nepřímá diagnostika proband sestra matka otec [F508]+[=] [=]+[=] [F508]+[=] [=]+[=] [F508]+[G542X] [A1]+[A1] [A1]+[A3] [A2]+[A5] [A1]+[A2] [A3]+[A5] Cystická fibróza Nepřímá diagnostika Postnatální vyšetření Pokud je prováděno u žijících osob, pak je cílem •potvrdit nebo upřesnit klinickou diagnózu • identifikovat přenašeče genetických onemocnění • stanovit presymptomatickou diagnózu, identifikaci onemocnění před jeho manifestací tj. odhalit, jestli v genomu probanda je taková molekulární změna na určitém genu, která způsobí, že v průběhu svého života onemocní příslušnou chorobou. Prenatální a preimplantační vyšetření odhalují závažná onemocnění před narozením dítěte má jasně preventivní úlohu Jeho cílem je zabránit nebo se připravit na narození postiženého dítěte. Historie prenatální molekulárně genetické diagnostiky se datuje od roku 1981, kdy bylo poprvé u plodu diagnostikováno, jestli bude postižen srpkovitou anémií, pro kterou byla jeho matka přenašečkou. Preimplantační genetické vyšetření Preimplantační genetické vyšetření Umožňuje vyšetřit embrya získaná metodami asistované reprodukce ještě před jejich přenosem do dělohy. Z embryí jsou mikromanipulačními technikami odebrány • jedna nebo dvě buňky (blastomery) získané z embrya starého 3 dny (72 hodin po oplodnění • více buněk z trofoektodemu blastocysty staré 5 dní Vyšetření více buněk z trofoektodermu eliminuje riziko mozaicismu Preimplantační genetické vyšetření embrya rozdělujeme na • preimplantační genetický screening – PGS využívá se pro screening nově vzniklých chromosomových vad (aneuploidií) • preimplantační genetickou diagnostiku – PGD při riziku vzniku přenosu monogenní choroby nebo chromosomové vady (strukturální aberace – translokace, ev. inverze) dané genotypem rodičů Preimplantační genetický screening – PGS PGS vyšetření metodou FISH, kdy jsou vyšetřeny pouze chromosomy 13, 18, 21, X a Y (ev. i chromosomy 15, 16, 22) se dnes již považuje za obsolentní. Dává se přednost metodám na technologii mikročipů (např. array CGH, SNP array) eventuálně sekvenování nové generace – NGS. Tyto metody dovolují vyšetřit aneuploidie všech 24 chromosomů Preimplantační genetická diagnostika – PGS PGD při chorobách s monogenní dědičností dosud většinou využívá nepřímou genetickou diagnostiku – PGH (preimplantation genetic haplotyping) pomocí STR markerů metodou PCR4 Zde je nutné vyšetření jak postiženého (postižených) rodinného příslušníka, tak rodičů. Vhodnou metodou je tzv. karyomapping, kterým je možné současně provést i screeningové vyšetření chromosomových aneuploidií. V blízké budoucnosti se rozšíří i využití metody sekvenování nové generace – NGS pro tyto účely. Preimplantační genetická diagnostika - PGS(aneuploidie) - PGD (monogenní choroby) Preimplantační genetický test PGT – A (aneuploidie) M (monogenní choroby) Selekce embryí pro in vitro fertilizaci (IVF) pro páry s rizikem přenosu dědičné choroby na potomky Pro genetickou analýzu vhodné tři typy buněk 1. Polární tělíska odebrané ze stádia oocyt/zygota 2. Buňky (blastomery) z embryí ve stádiu rýhování 3. Buňky trofoblastu z blastocyst Preimplantační genetická diagnostika monogenně dědičných chorob Monogenní choroby - metoda PCR Komplikace : ADO (alelic drop out) amplifikace jedné alely pod úrovní detekovatelnosti Minimalizace ADO protokol monitorující výskyt ADO: •multiplex PCR (koamplifikace mutace s polymorfními markery) •SSCP nebo DGGE analýzy ( detekující obě alely současně, potvrdí genotyp) •fluorescenční PCR - redukuje výskyt ADO, detekce DNA fragmentu je až 1000x citlivější ve srovnání s konvenční PCR technikou Prenatální vyšetření Zdroje fetální DNA - invazivní výkony • amniové fibroblasty – při amniocentéze 0,5-1% riziko spontánních potratů, • choriové klky 0,5-1% riziko spontánních potratů • fetální krevní buňky – při kordocentéze vyšší riziko spontánního potratu než u amniocentézy vysoké riziko aloimunizace matky Invazivní prenatální genetické vyšetření Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (QF-PCR) Prenatální vyšetření aneuploidií QF-PCR Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (QF-PCR) představuje metodu vhodnou k rychlé diagnostice nejčastějších aneuploidií a umožňuje okamžitý management patologických těhotenství QF-PCR Při analýze se využívá PCR amlifikace chromozom-specifických polymorfních STR markerů. Metody využíváme v prenatální i postnatální diagnostice a analýze potracených plodů Klasické metody vyšetření Vyšetření karyotypu (hodnocení barvených metafázických chromozomů v optickém mikroskopu) Klasické metody vyšetření Karyotyp • je soubor všech chromosomů v jádřě buňky. • V buněčných jádrech určitého druhu je konstantní do počtu, velikosti i tvaru chromozómů a jako takový se používá jako druhový znak • je jeden ze základních objektů cytogenetiky hodnocení barvených metafázických chromozomů v optickém mikroskopu) Vyšetření karyotypu • základní metodou vyšetření karyotypu (nejen) v rámci prenatální diagnostiky chromozomálních aberací Výhody • možnost prohlédnout celý karyotyp, zhodnotit strukturu každého jednotlivého chromozomu a i jejich počet. Nevýhody • časová náročnost klasické vyšetření karyotypu vyžaduje kultivaci získaných buněk ve speciálním médiu, což výrazně prodlužuje dobu, která uplyne mezi samotným odběrem vzorku a vydáním výsledku. - amniocentéza či odběr choriových klků je nutné počítat v průměru s minimálně dvoutýdenní lhůtou (výsledky CVS bývají obecně o něco dříve díky většímu růstovému potenciálu choriových buněk). - kordocentéza má v tomto případě značnou výhodu rychlého zpracování vzorku (obecně jen několik dní), neboť je odebírána fetální krev (velký růstový potenciál lymfocytů). • omezená schopnost detekovat určité chromozomální přestavby malého rozsahu (například mikrodelece) • určovat původ marker chromozomů apod. V této oblasti pak nastupují metody molekulární cytogenetiky jako je například FISH (fluorescent in-situ hybridization fluorescenční in-situ hybridizace). QF-PCR neboli kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction) • speciální aplikací klasické PCR metody, sloužící k namnožení definovaného úseku DNA. • V rámci prenatální diagnostiky se lze také setkat s označením amnioPCR (v souvislosti s amniocentézou - jako metodou, použitou k získání vzorku). • Tato metoda umožňuje vyloučit / potvrdit numerické odchylky vybraných chromozomů a to v extrémně krátkém časovém období jednoho, maximálně dvou dnů. • Nejčastěji jde o chromozomy, jejichž numerické abnormality tvoří většinu (cca 90 %) chromozomálních aberací: 13, 18, 21, X a Y. QF-PCR • Ze vzorku AMC, CVS se pomocí některé ze standardních metod nejprve izoluje DNA. • Polymerázová řetězová reakce-PCR QF-PCR Pro vlastní PCR metodu jsou připravené speciální „kity" s fluorescenčně značenými primery. Tyto primery ohraničují specifické lokusy na příslušných chromozomech (13, 18, 21, X a Y), které se pro potřeby této metody též označují jako markery. Jedná se o takové úseky, které obsahují vysoce polymorfní sekvence mikrosatelitní DNA - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats). QF-PCR Metoda PCR amplifikuje STR oblasti a vytváří fluorescenčně značené amplikony za pomocí lokus specifických primerů QF-PCR Multiplex PCR QF-PCR 7 markerů pro diagnostiku chromosomu 21 7 markerů pro diagnostiku chromosomu 18 7 markery pro diagnostiku chromosomu 13 7 markerů pro diagnostiku chromosomů XY. Multiplex PCR QF-PCR • Vzniklé PCR produkty jsou separovány a analyzovány pomocí automatického genetického analyzátoru. • Relativní množství každé STR alely je kvantifikováno pomocí výpočtu poměru obsahu píků, příp. jejich výšek. • STR se liší mezi jedinci velikostí, podle toho, kolikrát se opakují trojice, čtveřice nebo pětice nukleotidů. QF-PCR • V případě diploidie, je signál dvou alel 1:1, když se jedná o homozygota, pak jeden peak s dvojitým signálem. • Při trizomii dostaneme signál 2:1, 1:2, nebo 3 peaky 1:1:1. • Chybějící chromozom X u Turnerova syndromu je detekován pomocí poměru X vs. 7. chromosom. U normální ženy je tento poměr 1:1, u postižené je 1:2. QF-PCR • DNA amplifikovaná z normálního heterozygotního jedince (má alely s různou velikostí)pro specifickou STR sekvenci bude mít dva píky s odlišnou délkou v daném rozsahu • DNA amplifikovaná z trinomických jedinců vykáže buď další pík (tři různé alely) se stejnou plochou nebo jen dva píky (dvě různé alely), z nichž jeden má dvojnásobnou plochu, než ten druhý Trizomický troj-alelický marker (poměr ploch 1:1:1) Trizomický dvoj-alelický marker (8.3: poměr ploch 2:1; 8.4: poměr ploch 1:2) Heterozygotní marker (poměr ploch 1:1) QF-PCR •QF-PCR Homozygotní jedinci (mají alely se stejnou délkou) nebo monozomní vykážou pouze jeden pík Homozygotní/monozomní marker Jedinci homozygotní nebo monozomní jsou největším problémem pro testování abnormalit pohlavních chromozomů. Pokud použijeme STR specifické pro chromozom X, některé vzorky z normální ženy XX můžou vykázat homozygotní QF-PCR výsledek, který nelze odlišit od vzorků s jediným X, jako při Turnerově syndromu. Začleněním dalších STR markerů chromozomu X do analýzy redukuje pravděpodobnost homozygotnosti, ale neeliminuje ji zcela.Problém monosomie X řeší 7X marker pro relativní kvantifikaci chromozomů 7 a X. Pro normální ženu je poměr 7X 1:1 Pro normálního muže a ženu s monosomií X je typický poměr 2:1 Normální muž s poměrem 7X 2:1. .Normální žena s poměrem 7X 1:1. . Artefakta QF-PCR •Stutter píky jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jednu nebo několik repetic menší, než aktuální STR alela. Typický stutter pík má obsah menší, než 15% vůči příslušnému STR píku. . •-A píky (obr. 8.9) jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jeden pár bazí kratší, než PCR produkt s plnou délkou (+A pík) -A +A QF-PCR Typical electrophoretogram (Mix 1) showing the profile of a trisomic sample (47, XY +21) Hodnocení QF-PCR Výhody QF-PCR •odstraňuje nutnost opakovat některé testy s nejasným výsledkem (jako u kayotypizace), protože je každý syndrom analyzován pomocí mnoha STR současně. •pro každý chromozom jsou zahrnuty i velmi krátké STR úseky, díky nimž lze analyzovat i částečně degradovanou DNA. •test odhalí kontaminaci mateřskými buňkami, není nutné analyzovat současně vzorky rodičů. •test zjistí i případný mosaicismus •detekce Turnerova syndromu •reagencie v alikvotech zjednodušují použití a snižuje možnost kontaminace •. analýza trvá méně než 5 hodin, takže lze mít výsledky ještě týž den. • Hands-on doba je cca 90 minut Neinvazivní prenatální genetické vyšetření – fetální buňky v mateřské periferní krvi • neuplatnilo se pro nevýhodný poměr mateřských a fetálních buněk • technologicky obtížné oddělení fetálních a mateřských buněk • v krvi matky je lze identifikovat až 27 let po porodu plodu - tato skutečnost znemožňuje využití fetálních buněk v neinvazivní prenatální diagnostice, protože ne jsme schopni spolehlivě rozlišit, ze kterého těhotenství buňky pocházejí. – volná (nebuněčná) fetální DNA • fetální DNA z plazmy matky Prenatální vyšetření Zdroje fetální DNA - neinvazivní výkony Krev je složena z buněk a plazmy. V plazmě každému z nás kolují krví úlomky jeho vlastní dědičné informace, jeho DNA. Pocházejí z rozpadlých jader uhynulých a zničených buněk nejrůznějších orgánů. 1 Plazma 2 Destičky 3 Bílé krvinky 4 Červené krvin Volná DNA cfDNA Volná fetální DNA cffDNA Ženám se poměrně záhy po otěhotnění objeví v krvi také zlomky dědičné informace vyvíjejícího se embrya. V plazmě těhotné ženy se nachází směs úlomků DNA matky a plodu. „Dětské“ fragmenty tvoří asi desetinu všech zlomků DNA, jež lze v krvi matky najít. Prof. Dennis Lo Yuk-ming, Li Ka Shing Professor of Medicine and Chairman of the Department of Chemical Pathology at The Chinese University of Hong Kong (CUHK) Volná fetální DNA krvi matky byla objevena v roce 1997 Hongkongský genetik Dennis Lo prokázal, že z „dětských“ zlomků lze teoreticky poskládat kompletní dědičnou informaci. Nic z ní nechybí. V krvi matky se nachází genom jejího dítěte a nabízí se k přečtení. Jen je třeba vybrat z nepřeberné hromady zlomků ty správné. Prof. Dennis Lo Yuk-ming, Li Ka Shing Professor of Medicine and Chairman of the Department of Chemical Pathology at The Chinese University of Hong Kong (CUHK) Lo et al. vzali v úvahu podobnost mezi rychle rostoucím plodem a tumorem. Na základě poznatku, že v plazmě a séru onkologických pacientů lze detekovat volnou nádorovou DNA a využít ji pro molekulární diagnostiku (Sorenson et al., 1994), zkoumali, zda se v těhotenství do plazmy matky uvolňuje volná DNA plodu. Dokázali pomocí PCR přítomnost sekvencí chromozomu Y (gen DYS14) v mateřské plazmě i séru. Z 30 žen nesoucích plod mužského pohlaví byl pozitivní signál u 24 (80%) vzorků mateřské plazmy, u 21 (70%) vzorků mateřského séra, u 5 (17%) při vyšetření jaderných buněk plodu v krvi matky. Pro kontrolu byl stejný postup proveden i u netěhotných žen a u žen nesoucích ženský plod. U žádné z nich nebyla nalezena sekvence chromozomu Y. Volná fetální DNA cffDNA Za primární zdroj cffDNA v krvi matky je považována placenta. Apoptóza buněk trofoblastu – uvolňování fetální DNA do krve matky ve formě cell-free DNA (mimobuněčné DNA). Cell-free DNA (cfDNA) má charakter krátkých DNA fragmentů V těhotenství se v krvi matky nachází jak, cfDNA matky, tak také cfDNA plodu Množství fetální cff DNA představuje jenom část z celkové cfDNA( 4 –25%) Buňky plodu se dostávají do krevního řečiště na základě principu apoptózy placentálních buněk, tzn., že placentální buňky odumřou a odpadnou od stěny placenty a jsou nahrazeny buňkou novou. Odumřelé buňky jsou pak odnášeny cirkulující krví a nakonec jsou vyplaveny z těla ven. Jelikož buňky odumírají a jsou nahrazovány novými. Tento proces probíhá po dobu celého těhotenství. Objev fetální DNA cirkulující v krvi matky byl významným přínosem pro prenatální diagnostiku Volná fetální DNA cffDNA Volná fetální DNA cffDNA • fragmenty volné fetální DNA jsou v krevním oběhu matky detekovatelné zhruba od čtvrtého týdne těhotenství. • velikost se pohybuje přibližně v rozmezí od 100 - 700 bp, • fragmenty nad 1 kb patří převážně matce • jejich zastoupení v poměru k volné mateřské DNA je v průměru kolem 10 % • koncentrace se postupně zvyšuje I. trimestr do 3 % II. trimestr až 6 % Volná fetální DNA cffDNA Volná fetální DNA cffDNA FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ HLADINU cffDNA Faktory lze rozdělit podle toho, zda se přímo týkají matky nebo těhotenství a jeho/ s ním spojených komplikací. Charakteristiky matky 1. Váha a BMI 2. Fyzická aktivita 3. Kouření 4. Ostatní Charakteristiky těhotenství 1. Vícečetná těhotenství 2. Preeklampsie 3. Předčasný porod 4. Aneuploidie Volná fetální DNA cffDNA Volná DNA plodu (cffDNA) zůstává stabilní až 24 hodin po odběru krve, za tu dobu nedojde ke změně její koncentrace. Oproti tomu koncentrace volné maternální DNA se zvýší již 6 hodin po odběru. Prodleva mezi časem odběru a zpracováním vzorku tedy ovlivňuje pouze celkové množství volné DNA (cfDNA), nikoliv množství volné DNA plodu (cffDNA). Volná fetální DNA cffDNA Clearence Fetální DNA vykazuje rychlé vymizení z krve po porodu, na rozdíl od fetálních buněk, které byly nalezeny v krvi i po několika desítkách let, což může komplikovat vyšetření při dalším těhotenství. Vaginálním porod Není detekovatelné množství cffDNA již jeden den po porodu. Porod císařským řezem Průměrný čas, za který vymizí 50 % koncentrace cffDNA na 16,3 minuty (rozmezí 4-30 minut). U většiny žen není po 120 minutách od porodu cffDNA detekovatelná. Neinvazivní prenatální testování NIPT Neinvazivní prenatální screening NIPS Klinické aplikace neinvazivního prenatálního screeningu Zaměřené na identifikaci fetálních specifických DNA sekvencí • determinace pohlaví fetu • rhesus D genotypizace u rhesus negativních matek, • monogenní choroby získané od rodičů de novo • Pokročilé technologie analyzující jednotlivé molekuly DNA kdy je kvantifikována fetální i mateřská cffDNA, zejména vyšetření aneuploidií Neinvazivní prenatální screening NIPS Neinvazivní prenatální screening NIPS Detekce fetálních aneuploidií Metodou masivně paralelní sekvenace (MPS) Masivně paralelní sekvenování (MPS) Detekce fetálních aneuploidií Metodou masivní paralelní sekvenace (MPS) lze každý z milionů úlomků DNA v plazmě matky přiřadit k chromozomu, ze kterého pochází, a zjistit nadbytek DNA určitého chromozomu, který je způsoben trizomií plodu. Hahn S, Lapaire O, Tercanli S, Kolla V, Hösli I. Expert Rev Mol Med 2011:13:e16 Detekce fetálních aneuploidií Metodou masivní paralelní sekvenace (MPS) Detekce fetálních aneuploidií Metodou masivní paralelní sekvenace (MPS) NIPS – srovnání Chromozomy Aneuploidie, pohl.chr. Mikrodeleční syndromy Vícečetná těhotenství IVF Stanovení fetální frakce Výsledek Týden těhotenství Nepro- kazatelný výsledek Cena MaterniT21 PLUS Sequenom, US 21, 18, 13, X Y, 16, 22 ANO ANO ANO ANO ANO do 7 dnů 10 < 1,5 % 25.500,- Kč VisibiliT Sequenom, US 21, 18, Y ne ne ANO ANO ANO do 7 dnů 10 < 1,5 % 13.850,- Kč Harmony Ariosa, US 21, 18, 13, X, Y ANO ne ANO (dvojčata) ANO ANO do 11 dnů 10 < 4 % 16.500,- Kč Prenascan BGI, Honkong 21, 18, 13, X, Y ANO ANO ANO ANO ne Do 2-3 týdnů 10 v řádu procent 13.950,- Kč Verifi Verinata, US 21, 18, 13, X, Y ANO ANO ANO ANO ANO 7-11 dnů 10 ? cca 1000 USD Panorama Natera 21, 18, 13, X, Y ANO ANO ne ne ANO 9-12 dnů 9 ? Cca 800 USD LifeCodexx Germany 21, 18, 13 ne ne ne ? ne 6 / 10 10 ? 1.150/825 EUR Gendia Belgium 21, 18, 13 ne ne ANO (dvojčata) ? ? Do 2 týdnů 10 ? 690 EUR BambniTest, Berry Genomics Co.,Ltd, Shanghai 21, 18, 13, X, Y ANO ne ? ? ? ? ? ? cca 500 USD Clarigo Multiplicon Belgium 21, 18, 13, X, Y ANO ne ne ANO ANO Do 2 týdnů 12( 8) v řádu procent 12.500,- Kč * Informace uvedené v tabulce jsou doplněny na základě dostupných publikací a firemních materiálů Výsledky všech těchto prací ukázaly, že metodou masivního paralelního sekvenování lze odhalit téměř 100 % hledaných chromozomálních aberací, přičemž počet nevyhodnotitelných vzorků (příliš malé množství volné fetálníDNA) byl zanedbatelně nízký. !!! DNA TEST OTCOVSTVÍ BĚHEM TĚHOTENSTVÍ Z MATEŘSKÉ KRVE JIŽ V 9. TÝDNU JIŽ OD 29900,- Kč Bioquest Diagnostics DNA Center Volná fetální cfDNA (DNA plodu) K potvrzení otcovství je nutná shoda v pěti SNP lokusech. u domnělého otce analyzovat kromě krve a slin i další biologické vzorky, například sperma, nehty, zubní kartáček, nedopalek cigarety a podobně.