Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 3: Fyziologie bakterií, kultivační půdy Množení bakterií (růst) •Bakterie přijímají živiny z okolí •Po dosažení určité velikosti se příčně rozdělí na dvě •Před rozdělením duplikace genomové DNA •generační doba – doba od vzniku jedné konkrétní buňky do jejího rozdělení na dvě –Každá bakterie má svou generační dobu (zpravidla minuty, u některých dny) •Ideální množení by existovalo pouze kdybychom neustále přidávali živiny a popř. kyslík a odebírali odpadní produkty Množení bakterií (růst) •Doba zdvojení - doba potřebná k tomu, aby se počet buněk v populaci zdvojnásobil big_22248 pristroje3 Otevřený systém Kontinuální kultivace Uzavřený systém •Růst v uzavřeném systému (zkumavka, Petriho miska) •Časem klesá množství živin •Narůstá množství zplodin metabolismu • Reálná růstová křivka •Fáze lagu– adaptace, bakterií nepřibývá •Fáze exponenciální – růst se zrychluje •Fáze stacionární – rostou pořád stejně rychle •Zpomalení a zastavení růstu – došly živiny, je příliš mnoho odpadů, nebo bakterie samy regulují svůj počet pomocí „quorum sensingu“ Růstová křivka bakterií v uzavřeném systému 400px-R%C5%AFstov%C3%A1_k%C5%99ivka 1 Lag fáze 2 logaritmická (exponenciální) fáze 3 stacionární fáze 4 fáze odumírání Výživa bakterií •Zdroj energie –Fototrofní –Chemotrofní – chemolitotrofní, chemoorganotrofní •Zdroj uhlíku –Autotrofní – CO2 –Heterotrofní – organická látka –Mixotrofní - CO2, organická látka • •Fotoautrofní - sinice, fotoheterotrofní – purpurové sirné bakterie, chemoautotrofní – nitrifikační bakterie, chemoheterotrofní – většina bakterií •Výsledkem metabolismu látek je ATP Výživa bakterií •Zdroj dusíku –Amoniak, dusičnany, aminokyseliny, peptidy, bílkoviny –(Některé jsou schopné fixace vzdušného dusíku) •Akceptor elektronů –Vzniká katabolismem donoru elektronů (zdroj E, např. glukóza) •Fermentace (kvašení) –Kyslík •Aerobní respirace –Dusík, síra •Anaerobní respirace Růstové faktory •Molekula – komponenta buňky, kterou bakterie nedovede vyrobit z živin. Chybí jí enzymy. •Prototrofní – umí si vyrobit všechny stavební složky, nepotřebuje růstové faktory •Auxotrofní – neumí to, vyžadují růstové faktory v prostředí Fyziologie bakterií •Tak jako každý organismus, i bakterie mají svůj katabolismus a anabolismus •Katabolismus může být trojí: –Fermentace – štěpení bez potřeby kyslíku. Málo energeticky výhodný, ale nepotřebuje kyslík - 2 molekuly ATP –Aerobní respirace – z mála živin se získá hodně energie, je ale nutný kyslík – 38 molekul ATP –Anaerobní respirace – není nutný kyslík, ale je nutný jiný akceptor elektronů (například síra); málo významné u klinicky významných bakterií pyruvát 38 ATP + CO2+ H2O Aerobní respirace Anorganická molekula jako konečný akceptor vodíku 34 ATP+NH3+H2S. atd. anaerobní respirace glukóza acetyl-CoA Krebsův cyklus Elektron transportní systém Jiná anorganická sloučenina (např. NO3, SO4, atd.) kyslík Fermentace (organická molekula jako konečný akceptor vodíku) 2 ATP + kyseliny, alkoholy, atd. Vztah bakterií ke kyslíku •Aerobní a fakultativně anaerobní (případně také aerotolerantní) bakterie můžeme pěstovat za normální atmosféry •Striktně anaerobní bakterie vyžadují atmosféru bez kyslíku •Bakterie se speciálními nároky na kyslík vyžadují speciální atmosféru (mikroaerofilní a kapnofilní bakterie) Jak spolu souvisí katabolismus a vztah ke kyslíku? •Typ katabolismu je úzce spjat se vztahem ke kyslíku. •Fermentující bakterie jsou zpravidla fakultativně či striktně anaerobní. •(Pravé fakultativně anaerobní bakterie umějí „přepínat“ fermentaci na aerobní respiraci; ty, které to neumějí, pouze fermentují a přesto kyslík snášejí, se správně nazývají aerotolerantní. V praxi se často obě skupiny nerozlišují.) •Naopak aerobně respirující bakterie bývají striktně aerobní. •Existují ovšem i výjimky Substráty •Fermentovat i respiračně odbourávat lze různé substráty. Substrátem může být polysacharid, monosacharid, aminokyselina, lipid apod. •Pro různé bakterie existují typické substráty, které umějí buďto fermentovat nebo respiračně odbourávat. To se využívá v diagnostice. •Typické substráty zpravidla souvisejí s adaptací mikrobů na určité prostředí nebo s tím, jaké produkty či třeba jaké pH bakterie potřebují ke svému životu. Co chutná… třeba takové salmonele •Manit? Mňam! •Sacharóza? Fuj! SAEN_ŠVE_Martínek Příklad – ureázová aktivita helikobaktektera Ureáza Urea (močovina) se v žaludku vyskytuje, a její štěpení helikobakterům umožňuje zvýšit ve svém těsném okolí pH a vzdorovat tak žaludeční kyselině Mikrobiologické metody – rozdělení (opakování) •Metody přímého průkazu –Přímý průkaz ve vzorku (pracujeme s celým vzorkem, například sputem, mozkomíšním mokem, močí apod.) –Identifikace kmene (pracujeme s jedním kmenem, který byl ze vzorku izolován) • Postavení kultivace v systému metod •Přímé metody (mikrob – část – produkt): –Mikroskopie – průkaz ve vzorku i identifikace –Kultivace – průkaz ve vzorku i identifikace –Identifikace –Průkaz antigenu – průkaz ve vzorku i id. –Průkaz nukleové kyseliny – zpravidla jen průkaz ve vzorku –Pokus na zvířeti – zpravidla průkaz ve vzorku Vzorek a kmen •Vzorek je to, co se odebírá pacientovi. Vzorek obsahuje buňky makroorganismu, různý počet druhů mikrobů (nula až třeba dvacet) a další příměsi •Kmen – izolát – je populace jedné bakterie, izolovaná ze vzorku na pevné půdě •Abychom získali kmen, musíme bakterii pěstovat na pevné půdě a dobře rozočkovat Smysl kultivace bakterií •Proč vlastně v laboratoři bakterie pěstujeme? –Abychom je udrželi při životě a pomnožili. K tomu slouží kultivace na tekutých půdách i na „pevných“ půdách (to jsou půdy, které netečou, jejich základem je většinou agarová řasa) –Abychom získali kmen – můžeme použít pouze pevné půdy –Abychom je vzájemně odlišili a oddělili •používají se diagnostické a selektivní půdy, sloužící k identifikaci Robert Koch koch.gif (8018 bytes) Německý mikrobiolog Robert Koch se narodil 11. prosince 1843 v.Clausthal-Zellerfeldu jako jedno z 13 dětí důlního technika. Už v pěti letech ohromil rodiče, když jim oznámil, že se podle novin naučil číst. V.roce 1862 odešel Koch na univerzitu do Göttingenu studovat medicínu. Po obdržení doktorátu v roce 1866 odešel na šestiměsíční studium chemie do Berlína. Po období všeobecné praxe se jako dobrovolník přihlásil do služby v ve francouzsko-pruské válce v roce 1870 a od roku 1872 do 1880 ve wollsteinském okresu. Zde uskutečnil své epochální výzkumy, které ho vynesly do čela vědeckých pracovníků. Zabýval se zejména bacilem antraxu, tuberkulózními bacily a cholerovým vibriem. Koch byl během života vyznamenám mnoha medailemi a odměněn mnoha cenami, získal také několik čestných doktorátů a stal se čestným občanem několika měst. V roce 1905 obdržel Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu. Kochovy postuláty Robert Koch zemřel 27. května 1910 v Baden-Badenu http://www.quido.cz/osobnosti/koch.htm Ještě jednou Robert Koch http://www.educationforum.co.uk/kochlesson.htm Robert Koch in his Lab Robert Koch při expedici do Egypta při cholerové epidemii roko3.jpg (37534 Byte) Podmínky pěstování (kultivace) bakterií •Pro kultivaci (pěstování) bakterií jsou nutné určité podmínky, bez kterých není pěstování možné •Nestačí přitom takové, aby bakterie přežívala. Musí být i schopna se množit •Podmínky kultivace: voda, živiny, zdroj energie, teplota, atmosféra, pH, osmotický tlak - koncentrace solí, redox potenciál, růstové faktory, případně minerální látky –nepůsobí jednotlivě, kombinují se –podmínky lze zajistit nastavením inkubátoru neboli termostatu (teplota, CO2), jiné složením půdy Když se mění určité faktory Fyzikální vlivy Kultivace bakterií obecně •Bakteriím musíme připravit přijatelné vnější podmínky •Aerobní a fakultativně anaerobní bakterie můžeme pěstovat za normální atmosféry •Striktně anaerobní bakterie vyžadují atmosféru bez kyslíku – Clostridium difficile •Bakterie se speciálními nároky na kyslík vyžadují zvláštní zacházení –mikroaerofilní snížený podíl kyslíku 20 % - kampylobakter –kapnofilní zvýšený podíl CO2 asi 10 % - neisseria •Používáme různá kultivační média, sloužící k určitým účelům Kultivace bakterií obecně •Většinou vyžadují teplotu kolem 37 °C, ovšem při různě širokém rozmezí. –bakterie se dělí na psychrofilní (do 20 °C), mezofilní (20–40 °C), termofilní (40 °C a více), případně hypertermofilní s optimem kolem 80 °C –Ale bakterie původem z vnějšího prostředí preferují nižší teploty, ptačí patogeny naopak vyšší (ptáci mají vyšší teplotu těla) •Většinou vyžadují pH kolem sedmi (6 - 8), neutrofilní • Alkalofilní - Vibrio cholerae (7,4 - 9,6) • Acidofilní - kvasinky, plísně, laktobacily (5 - 6) – Kultivace bakterií obecně •Osmotický tlak – běžné kultivační půdy 0,5 % NaCl •Vyšší obsah solí - halofily –halotolerantní - nevyžadují – enterokoky; stafylokoky - jsou zvyklé žít na zpocené kůži –obligátní halofily - nerostou za běžné koncentrace - Vibrio parahaemolyticus (1 % NaCl) Pěstování anaerobních bakterií Anae1 Anae3 www.medmicro.info www.medmicro.info Pojem kolonie •Kolonie je útvar na povrchu pevné půdy. Pochází z jedné buňky nebo malé skupinky buněk (dvojice, řetízku, shluku) •V některých případech můžeme z počtu kolonií odhadnout počet mikrobů ve vzorku – nebo přesněji počet „kolonii tvořících jednotek“ (CFU) •Popis kolonií má významné místo v diagnostice •Kolonie je vždy tvořena jedním kmenem. Pojmy „kolonie“ a „kmen“ ale nejsou synonyma, kmen nemusí mít tvar kolonie. S3 www.medmicro.info Kultivační doba •Kultivační doba je časový úsek nezbytný k tomu, aby z jedné nebo několika bakterií vyrostla viditelná kolonie •Kultivační doba je závislá na generační době, samozřejmě je ale daleko delší (pro vznik viditelné kolonie nestačí, když se z jedné bakterie stanou dvě, ba ani čtyři nebo osm, nezbytné jsou miliardy bakterií) Kult1 Praktická kultivace Význam kultivace v tekutých půdách Význam kultivace na pevných půdách Typy tekutých půd Typy pevných půd www.medmicro.info Kultivační podmínky – opakování •Pro kultivaci bakterií jsou nutné určité podmínky •Nestačí takové, aby bakterie přežívala. Musí být i schopna se množit •Podmínky musí být splněny, co se týče teploty, pH, koncentrace solí a mnoha dalších věcí. Některé jsou dány nastavením termostatu, jiné složením kultivační půdy. •Nepůsobí přitom jednotlivě, kombinují se Je to dobře, nebo špatně, že různé bakterie jsou různě náročné? •Je to špatně, protože se špatně definují podmínky, které by vyhověli většině (neřkuli všem) klinicky významným bakteriím •Je to dobře, protože díky tomu můžeme i kultivaci využít v diagnostice (např. schopnost růst na půdě s 10 % NaCl dobře odliší stafylokoky od jiných bakterií, které na ní nerostou) Kult1 cloperf Půdy obecně versus půdy v.klinické mikrobiologii •V průmyslové mikrobiologii či v některých jiných aplikacích se zpravidla používají chemicky přesně definované půdy - minimální média. Víme, kolik je v nich čeho, a můžeme taky sledovat, kolik čeho přibylo nebo ubylo. •V klinické mikrobiologii nepotřebujeme vědět přesné složení. Často i složky půd jsou chemicky nedefinované - médium komplexní (krvinky, extrakt z kvasnic). Kult2 prmi32 saenmal S32 basu6 Tekuté půdy a pevné půdy •Základem tekutých půd je masopeptonový bujon (hovězí vývar + bílkovinný hydrolyzát). Používají se především k pomnožení. Výsledek se špatně hodnotí: v podstatě jen čirý bujon / zakalený bujon (roste /neroste) •Základem většiny pevných půd je tentýž bujon, ale doplněný výtažkem z agarové řasy - agar. Bakterie na pevných půdách rostou pomaleji, ale zato velmi rozmanitě, a lze je rozočkovat. Kult5 Různé vzorky – různá kultivace •Jak ovlivňuje typ vzorku typ kultivace? –Vzorky, kde je obvykle málo mikrobů se dávají jen do tekutých půd, kde se mikroby rychle pomnoží. Teprve pak se (v případě zákalu = pozitivity) mikroby vyočkují (subkultivují) na pevnou půdu. Příklad: výtěr ze spojivkového vaku –Vzorky, kde může být hodně i málo mikrobů a i případné malé množství mikrobů je významné, očkujeme na pevné i tekuté půdy. Pokud na pevné půdě nic vidět není, ale tekutá půda je zakalená, provádí se subkultivace (subkultura) z tekuté půdy na pevnou. Příklad: stěry z ran –Vzorky, kde je většinou hodně mikrobů, popř. i fyziologická běžná flóra se očkují pouze na pevné půdy. Příklad: výtěry z krku Kult6 Krevní agar je půda, která obsahuje ovčí červené krvinky Betadelta Kult8 Kult9 P9250011 •Bakterie •Klebsiella pneumoniae •na Endově agaru klpn35 Tatáž bakterie na krevním agaru Použitá půda versus vlastnosti bakterií •Různé vlastnosti, např. barvu, ovlivňují substráty přítomné v půdě, proto na různých půdách mohou mít bakterie různou barvu. •Pochopitelně také například hemolýzu můžeme studovat pouze na půdách, které obsahují krvinky Pojmy vzorek a kmen •Vzorek je to, co se odebírá pacientovi. Vzorek obsahuje buňky makroorganismu, různý počet druhů mikrobů (nula až třeba dvacet) a další příměsi •Kmen – izolát – je populace jedné bakterie, izolovaná ze vzorku na pevné půdě •Abychom získali kmen, musíme bakterii pěstovat na pevné půdě a dobře rozočkovat •Nejdříve si ale probereme půdy tekuté, i když jimi kmen nezískáme… Tekuté půdy P1010001 www.medmicro.info Rozdělení tekutých půd •Tekuté půdy mnoho kategorií nemají. Vlastně jen dvě: •Půdy pomnožovací jsou nejběžnější a univerzální. Příkladem je bujón pro aerobní kultivaci a VL-bujón pro anaerobní kultivaci (VL = viande-levure, z.francouzštiny – obsahuje masokvasničný extrakt) •Půdy selektivně pomnožovací mají za úkol pomnožit určitou bakterii a potlačit množení jiných. Příkladem je selenitový bujón pro salmonely Růst bakterií v bujónu https://is.muni.cz/do/rect/el/estud/prif/js17/cviceni_mikrobiologie/web/pages/pozorovani_mikroorgan izmu.html Kult5 Pevné půdy www.medmicro.info Pevné (agarové) půdy •Abychom využili všech výhod, které pevné půdy nabízejí, musíme vzorek (kultivace vzorek à kmen), ale i kmen (kultivace kmen à kmen) dobře rozočkovat. Klasickým způsobem rozočkování je tzv. křížový roztěr. V praxi se zpravidla natře např. na polovinu misky tamponem a pak se rozočkovává kličkou. Někdy se ještě doplňují různé čáry a disky – o nich jindy. Proč je potřeba mít izolované kolonie •Protože jen v tom případě lze identifikovat větší počet patogenů, které jsou ve směsi •Ale také proto, že pouze jednotlivé kolonie umožňují pozorovat typické vlastnosti kolonie. •Sebelepší klaun vám nepředvede nic ze svého umění, držíte-li ho v kamrlíku nahečmaného na spoustu dalších klaunů. V případě směsi vytvoří každá bakterie svoje kolonie (při dobrém rozočkování) Rozočkování 1 – očkování směsi bakterií (naznačeny tečkami), 2 – výsledek kultivace: v prvních úsecích směs, až na konci izolované kolonie Postup očkování vzorku Očkování vzorku Vzorek se nanese na menší či větší plochu, a pak se rozočkovává jako při přeočkování kmene Výtěr z krku – reálný výsledek www.medmicro.info Co lze popisovat u kolonií •Velikost •Barva •Tvar (okrouhlý…) •Profil (vypouklý…) •Okraje (výběžky..) •Povrch (hladký, drsný) •Konzistence (suchá…) •Průhlednost •Vůně/zápach •Okolí kolonie* *Přesný význam tohoto pojmu záleží na druhu půdy. Například u půd s krvinkami se hodnotí narušení krvinek v okolí kolonie Morfologie kolonií https://is.muni.cz/do/rect/el/estud/prif/js17/cviceni_mikrobiologie/web/pages/pozorovani_mikroorgan izmu.html Pevné selektivní půdy •Účelem je selektovat (vydělit) ze směsi baktérií pouze určitou skupinu nebo skupiny –podporují růst jedněch bakterií a potlačují růst jiných •Příkladem je agar pro stafylokoky s 10 % NaCl •Někdy je selektivnosti dosaženo přidáním antibiotika. –Krevní agar s amikacinem je selektivní pro streptokoky a enterokoky. –Půdy pro kultivaci kvasinek zpravidla obsahují kombinaci antibiotik (abychom potlačili bakterie, kvasinkám antibiotika nevadí, takže rostou) Selektivita hypersolného agaru 6,5 % 10 % Většina Enterokoky Stafylokoky Kult6 Půdy diagnostické Kult11 •Nepotlačují růst žádného mikroba •Zato díky svému složení rozlišují mikroby podle určité vlastnosti •Příkladem je krevní agar ke sledování hemolytických vlastností a VL krevní agar (podobný, ale na anaeroby) •Zvláštním případem půdy chromogenní a fluorogenní www.medmicro.info www.medmicro.info Půdy s krví – základ klinické mikrobiologie •Všechny půdy s krvinkami (krevní agar, VL krevní agar, agar s pranými erytrocyty apod. – netýká se ale krevního agaru s 10 % NaCl, kde jsou krvinky lyzovány) jsou schopny rozlišit: Hemolýzy Úplnou hemolýzu Částečnou hemolýzu Nepřítomnost hemolýzy Viridaci (zezelenání) Půdy chromogenní a fluorogenní 26 Chromogenní půda na listerie •Chromogenní půdy obsahují barvivo, na které je navázaný specifický substrát à barevnost se ztrácí, není to už barvivo, ale chromogen •Bakterie schopná štěpit specifický substrát změní chromogen zpět na původní barvivo •Půda může obsahovat i více chromogenů (pro současné určení více druhů bakterií) •Fluorogenní půdy podobné, s.fluorescenčním barvivem www.oxoid.com Ukázka chromogenní půdy na kvasinky Čtyři různé kvasinky rostou v typických koloniích – jedna v zelených, jedna v modrých, jedna v suchých růžových a jedna v hladkých růžových. Ostatní druhy kvasinek jsou na této půdě bílé. www.medmicro.info C:\Users\Petra\Desktop\projekt foto\původní foto\fotoatlas2016\Kvasinky\IMG_3454CAAL.JPG C:\Users\Petra\Desktop\projekt foto\původní foto\fotoatlas2016\Kvasinky\IMG_3442CCrusei.JPG C:\Users\Petra\Desktop\projekt foto\původní foto\fotoatlas2016\Kvasinky\IMG_3448CTropicalis.JPG C:\Users\Petra\Desktop\projekt foto\původní foto\fotoatlas2016\Kvasinky\IMG_3457CGlabrata.JPG Půdy selektivně-diagnostické •Kombinují v sobě selektivní a diagnostické vlastnosti •Příkladem půda Endova: –Rostou pouze některé G- bakterie (selektivita), obsahuje bazický fuchsin –Ty, co rostou, lze rozlišit na laktóza pozitivní (červené) a negativní (bledé) - diagnostická funkce Kult9 Podobná je půda McConkeyho, ve světě běžnější Selektivně diagnostické jsou i půdy XLD, MAL, CIN aj. www.medmicro.info Půdy XLD a MAL na salmonely C:\Users\Petra\Desktop\projekt foto\moje červen 2016\P6253296.JPG C:\Petra - dokumenty\doktorát\výuka\fotky praktika\Enterobacteriaceae\Salmonella\MAl\P6202514.JPG Kult3 www.medmicro.info Půdy selektivní, diagnostické a selektivně-diagnostické – shrnutí Půda selektivní Kmen A neroste Kmen B roste Půda diagnostická Kmen C roste, má kolonie makové Kmen D roste, má kolonie takové Půda selektivně diagnostická Kmen E neroste Kmen F roste, má kolonie makové Kmen G roste, má kolonie takové Půdy obohacené a selektivně obohacené •pro náročné mikroby •obsahují různé nutriční faktory •Příkladem je čokoládový agar pro neisserie a hemofily a Levinthalův agar pro hemofily •Mohou být selektivně obohacené (GC agar), tedy kombinace selektivity a obohacení Hemofil na ČA www.medmicro.info Půdy ke speciálním účelům atbstau17 atbpsae21 •Sledování faktorů virulence (žloutkový agar pro histotoxická klostridia, půda s kongočervení pro stafylokokový sliz) •In vitro testování citlivosti na antimikrobiální látky: Müllerův-Hinton agar; slouží zároveň ke sledování pigmentů bakterií www.medmicro.info Poznámka • V případě kultivačně náročných bakterií se i testování citlivosti provádí na obohacených půdách. • Müllerův-Hinton agar s přídavkem krve NEGO_ČAG_antibiotika www.medmicro.info Současné trendy v kultivaci •Navzdory rozvoji genetických metod si kultivace zachovává svou klíčovou úlohu při diagnostice zejména baktérií •Standardizace nutí přecházet od půd vyráběných „na koleně“ k půdám komerčně vyráběným •Chromogenní a fluorogenní půdy se i přes vyšší cenu zvolna prosazují Anae3 Pěstování anaerobních bakterií Anae1 Anae2 www.medmicro.info Nashledanou •Příště budeme pokračovat povídáním o biochemické identifikaci bakterií P1010008 www.medmicro.info