Stanovení patogenních mikroorganismů selektivní pomnožení inkubace x g nebo x ml vzorku + 9x ml mTSB + N 41,5 °C, 18 - 24 hodin, aerobně imunomagnetická separace koncentrace E. coli 0157 na imunomagnetických částicích promývání sterilním pufřem resuspenzace imunomagnetických částic izolace inkubace 1. půda - CT-SMAC 2. půda - např. SMAC s BCÍG 37 °C, 24 hodin, aerobně 37 °C, 24 hodin, aerobně 1 5 charakteristických kolonií (z každé misky) 1 konfirmace biochemická konfirmace (tvorba indolu), sérotypizace Schéma 19: Průkaz baktérií Escherichia coli 0157 v potravinách. 4.5. Stanovení Cronobacter sakazakii Cronobacter sakazakii (dříve Enterobacter sakazakii) je řazen do rodu Cronobacter, čeled Enterobacteriaceae a patří mezi tzv. koliformní bakterie. Příslušníci tohoto rodu jsou gramnegativm, fakultativně anaerobní, nesporotvorné tyčinky. Tvoří běžnou součást střevní mikroflóry zvířat a některých ptáků, v lidském střevě se obvykle nevyskytují. Cronobacter sakazakii vyvolává u novorozenců velmi těžká onemocnění - zejména meningitídy, bakteriemie a meningoencephalitídy. Nejčastějším zdrojem bývá sušené počáteční kojenecké mléko. Stanovém Cr. sakazakii v potravinách se provádí kvalitativně, tzn. jedná se o průkaz nebo vyloučení jeho přítomnosti v předepsané navážce vzorku. Ke kultivaci se používají neselektivní pomnožovací média a dále selektivní tekuté půdy obsahující látky inhibuiící růst doprovodné mikroflóry (např. vancomycin), k vlastní izolaci se používají chromogenní půdy. Suspektní kolonie jsou konfirmovány na základě tvorby žlutého pigmentu a vybraných biochemických reakcí. 4.5.1. Metoda průkazu Cronobacter sakazakii Průkaz baktérií Cronobacter sakazakii zahrnuje 4 po sobě jdoucí stupně: předpomnožení v neselektivní tekuté půdě, pomnožení v selektivní tekuté půdě, izolaci a konfirmaci. 4.5.1.1. Princip metody Zkoušený vzorek se inokuluje do tekuté půdy pro neselektivní pomnožení - puf r ováná pepíonová voda (PPV médium), a inkubuje se aerobně při 37 °C po dobu 16-20 hodin. Získaná kultura se preočkuje do tekuté selektivní půdy - modifikovaná laurylsulfát tryptózová půda s vankomycinem (mLST médium) a inkubuje se aerobně při 44 °C po dobu 24 hodin. Ze selektivního pomnožení se provádí vyočkování na Mikrobiologie potravin - praktická cvičení II. půdu - Enterobacter sakazakii izolační agar (ESIA agar) nebo jiná chromogenní půda poskytující shodné výsledky (např. HiChrome Ent. sakazakii agar, CHES). Inokulované misky se inkubují aerobně při 44 °C po dobu 24 hodin a zjišťuje se přítomnost typických kolonií presumptivních Cr. sakazakii. Následně se u vybraných suspektních kolonií provede posouzení tvorby žlutého pigmentu a biochemická konfirmace. Výsledkem je průkaz přítomnosti či absence baktérií Cronobacter sakazakii v navážce vyšetřovaného vzorku. 4.5.1.2. Postup metody > Neselektivní pomnožení: odebereme zkušební vzorek (obvykle 25 g nebo 25 ml) a připravíme výchozí ředění, jako ředící roztok použijeme devítinásobné množství (tj. 225 ml) PPV média. Inkubujeme aerobně v termostatu při 37 °C po dobu 16-20 hodin. > Selektivní pomnožení: po ukončení inkubace přeneseme 0,1 ml výchozí suspenze do zkumavky s 10 ml mLST půdy a inkubujeme aerobně v termostatu při 44 °C po dobu 24 hodin. > Izolace: z půdy pro selektivní pomnožení provedeme vyočkování sterilní bakteriologickou kličkou (plná klička, cca 10 ul) na chromogenní půdu (např. ESIA agar). Inokulované Petriho misky obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme aerobně v termostatu při 44 °C po dobu 24 hodin. 4.5.1.3. Konfirmace a hodnocení výsledků Při hodnocení sledujeme nárůst kolonií charakteristických pro druh Cronobacter sakazakii, pro konfirmaci náhodně vybereme z každé plotny 5 charakteristických kolonií. Kolonie vybrané pro konfirmaci subkultivujeme vyočkováním na sójový agar s tryptonem (TSA), po inkubaci sledujeme přítomnost žlutého pigmentu. Při biochemické konfirmaci standardně provedeme následující testy: průkaz oxidázy, průkaz lyzinděkarboxylázy, průkaz ornitindekarboxylázy, průkaz arginindihydrolázy, průkaz fermentace různých cukrů a využití citrátu (viz. tabulka 9). Pro biochemickou konfirmaci je dovoleno použít komerční identifikační soupravy. Na základě výsledků konfirmace potvrdíme nebo vyloučíme přítomnost baktérií Cronobacter sakazakii v navážce vyšetřovaného vzorku. Tabulka 8: Interpretace biochemických testů. Konfirmační test Pozitivní nebo negativní reakce % E. sakazakii projevujících reakci Tvorba žlutého pigmentu + >99 Oxidáza - >99 L-lyzindekarboxyláza - >99 L-ornitindekarboxyláza + ±90 L-argininhydroláza + >99 Kyselina z - fermentace D-sorbitolu - ±95 - fermentace L-ramnózy + >99 - fermentace D-sacharózy + >99 - fermentace D-melibiózy + >99 - fermentace amygdalinu + >99 - hydrolýza citrátu + >95 78 Stanovení patogenních mikroorganismů Morfologie charakteristických kolonií: Po 24 hodinách inkubace mají narostlé kolonie následující morfologii: > ESIA agar - typické kolonie jsou malé až středně velké (1-3 mm), zelené až modrozelené barvy. > CHES agar - typické jsou tmavě modré kolonie o průměru 1-3 mm. neselektivnípomnožení x g nebo x ml vzorku + 9x ml PPV inkubace 37 °C, 16- 20 hodin, aerobně selektivní pomnožení 0,1 ml kultury + 10 ml mLST + VAN inkubace 44 °c, 24 hodin, aerobně izolace . vyočkování na selektivní chromogenní agar inkubace 44 °c, 24 hodin, aerobně odečet počtu presumptivních Cr. sakazakii i 5 charakteristických kolonií (z každé misky) 1 konfirmace tvorba žlutého pigmentu biochemická konfirmace Schéma 20: Průkaz baktérií Cronobacter sakazakii v potravinách. 4.6. Stanovení Clostridium perfringens Clostridium perfringens (čeleď Clostridiaceae) je grampozitivní, obligátně anaerobní, nepohyblivá, sporotvorná tyčinka dlouhá 3-9 um. Vyskytuje se jednotlivě, ve dvojicích nebo krátkých řetízcích, spory jsou oválné, umístěné centrálně nebo paracentrálně. Klostridia jsou obecně značně biochemicky aktivní, důležitý diferenciační znak je schopnost redukovat sulfity na sirovodík. Roste při teplotách 20 - 50 °C, optimální teplota růstu je 45 °C. Vegetativní buňky neprežívajípasterační záhřev 72 °C, spóry pasteračním záhřevem poškozovány nejsou. Clostridium perfringens je součástí normální střevní mikroflóry člověka i zvířat. Produkuje asi 13 termolabilních toxinů. přičemž alimentární otravy vyvolává převážně sérotyp A. Ke vzniku onemocnění (otravy enter otoxinem) je zapotřebí, aby se C. perfringens v kontaminované potravině nejprve dostatečně pomnožilo (106 - IQ7 KTJ/g). 79