Bílkoviny krevního séra/plazmy 2022 David Zeman, ÚLM-OKB FN Brno e-mail: Zeman.david@fnbrno.cz • Sérum získáme ze srážlivé krve (necháme stát 30 min při teplotě místnosti =^> proběhne koagulace) centrifugací • Plazmu získáme z nesrážlivé krve (přídavek antikoagulačních činidel: heparin, EDTA) centrifugací (lze ihned po odběru) Funkce bílkovin v organismu • Enzymy (>1500) • Strukturální (kolagen, keratin) • Kontraktilní (aktin, myosin - kontrakce svalů) • Protilátky (imunoglobuliny) • Transportní (albumin, transferrin, lipoproteiny) • Proteohormony (např. insulin) „Celková bílkovina" = suma všech bílkovin v analyzovaném materiálu Referenční meze: 60 - 85 g/L Snížení: ztráty bílkovin, zejm. albuminu Zvýšení: dehydratace, paraproteinémie • Stanovení: 1) Kj eldahlova metoda (dříve referenční) 2) Biuretová metoda (dnes referenční) Stanovení nízkých koncentrací (moč, likvor): 1. Vazba barviva (Coomassie Brilliant Blue, pyrogallolová červeň/molybdenan) 2. Turbidimetricky (zákal reakcí s TCA, benzethonium-chloridem), popř. nefelometricky (měření rozptýleného světla) Kjeldahlova metoda: Parnasův-Wagnerův přístroj pro destilaci amoniaku vodní parou Kjeldahlova metoda (obr. z Volka a kol. Analytická chemie II. VŠCHT Praha 1995) Obr.6.65 amoniaku 1 - vyvíječ vodn i páry; 2 - kondenzační trubice; 4 - chladič; 5 - jlmadlo; 6 - destilační baňka Parnasův-Wagnerův destilační přístroj pro stanoveni — plnicí otvor 1. Izolace sérových bílkovin srážením (oddělení „nebílkovinného dusíku") 2. Katalyzovaná redukční mineralizace varem s koncentrovanou H2S04 3. Ze vzniklé amonné soli se působením koncentrovaného NaOH uvolní v uzavřené aparatuře NH3 4. NH3 se vydestiluje vodní párou do známého objemu odměrného roztoku kyseliny (nejčastěji H2S04) o známém titru (nebo jímárle do slabé kyseliny - H3B03- a stanovujeme přímo acidimetricky) 5. Neutralizací vznikne opět amonná sůl a nadbytek kyseliny se stanoví titrací odměrným roztokem hydroxidu 6. Výpočet: n(NH3) = n(N) = n(H+) - n(OH") 7. Přepočet na průměrný obsah dusíku v bílkovinách (16 %) Kjeldahlova metoda - reakce • 1) Digesce - varem vzorku v kyselině sírové za přítomnosti katalyzátoru: organický N + H2SO^ -> OVf/4)2S04 + H20 + CO2 + H2SO^ + vedlejší produkty matrice • 2) Destilace: a) produkt digesce je kvantitativně převeden do destilačního aparátu a v přebytku se přidá NaOH - dojde ke konverzi síranu amonného na volatilní amoniak: (NH4)2S04 + NaOH -> 2NH3 + Na2S04 + 2H20 + NaOH b) amoniak je jímán buď do roztoku silné kyseliny, jejíž malý přebytek je poté zpětně titrován standardní zásadou, nebo do kyseliny borité jako dihydrogenboritan amonný: NH3 + H3B03 -> NH4H2B03 + H3B03 • 3) Titrace: při destilaci amoniaku do kyseliny borité následuje jediný titrační krok - titrace silnou kyselinou (zprav. H2S04) za použití acidobazického indikátoru se změnou pH mezi 4 a 6 (smíšený indikátor bromkrezolové zeleně s methylčervení): 2NH4H2B03 + H2S04 -> (NH4)2S04 + 2H3B03 Kjeldahlova metoda - finální výpočet koncentrace celkové bílkoviny (CB, TP = total protein) • TP (g/L) = (V • T • 0.14007 • 6.25)/Vvxorku V= spotřeba titračního činidla v mL na vzorek (přesněji: s odečtením spotřeby titračního činidla na blank); T= titr titračního činidla (mol/L) Faktory 0.14007 a 6.25 slouží k přepočtu titračního činidla na N (mg), resp. TP (g/L) Blíže viz Chromý V et al. Crit Rev Anal Chem 2015;45:106-11 a Vinklárková B et al. Crit Rev Anal Chem 2015;45:112-18 Biuretová reakce (schéma vpravo z F. Novák: Úvod do klinické biochemie. Karolinum, Praha 2002) „Bhiret" vzniká ze dvou molekul močoviny zahřátím za uvolnění amoniaku; není to reagencie, ale sloučenina, která reaguje s Cu2+ v alkalickém prostředí analogicky jako peptidová vazba v bílkovinách) 0=C\ Ctt* 0=C/ I NH, NH2 1 ,c=o NH NH o=C \ / 1 i \ a* m / \ \ 1 / 0=<\ / NH NH vc=o 0=C' ] 1 Nti, NHj Cutompla ObnH Biuretová reakce Komtaprcteb-biureí proti rragtnfnímu blanku 600 600 Vlnová dŕíka H Ob, 6.3 íUsoíN 8* "im*víl,o ftfe • C» ÍSW# Biuretová metoda • Reakce Cu2+ v alkalickém prostředí s peptidovou vazbou (-CO-NH-) v bílkovinách • Intenzita vzniklého červenofialového komplexu je úměrná počtu peptidových vazeb • Fotometrická detekce při 540 -550 nm • Interference: lipémie, hemolýza, hyperbilirubinémie (falešně vyšší hodnoty) Složení činidla: CuS04, vínan draselno-sodný (komplexuje Cu2+ , který by jinak v alkalickém prostředí vypadl jako Cu(OH)2), jodid draselný (antioxidant-zabraňuje autoredukci Cu2+), NaOH Zpravidla end-point stanovení, čas > 8 min (ustálení reakční rovnováhy za 15-30 min; za 10 min dosaženo 95-98 % celkového zbarvení) Biuretová reakce pro stanovení bílkovin v moči • Precipitace bílkovin TCA nebo HCl+fosfo-wolframovou kyselinou v ethanolu • Koncentrace precipitovaných bílkovin centrifugací • Rozpuštění bílkoviny a reakce s biuretovým činidlem • Folin-Lowryho metoda • Činidlo = fosfowolframová + fosfomolybdenová kyselina + alkalický roztok Cu • Reakce s Tyr a Trp • Produkce modrého zbarvení měřeného při 650 nm • Detekční limit 5-10 mg/L Turbidimetrické stanovení bílkovin reakcí s benzethonium chloridem (doporučená metoda pro stanovení celkové bílkoviny v moči a likvoru) • Bílkoviny v alkalickém roztoku reagují s benzethonium chloridem (kvartérní amoniovou solí) • Vzniklý zákal je stabilní a málo závislý na teplotě • Větší zákal s albuminem než s globuliny • Velmi vysoká koncentrace bílkovin =^> nerovnoměrně rozptýlený zákal =^> falešně nízké hodnoty !! Stanovení bílkovin podle Bradforda (1976) • Vazba barviva (Coomassie Brilliant Blue G250) na bílkovinu způsobí posun absorpčního maxima barviva od 465 k 595 nm • K vazbě dojde do 2 minut a vzniklé zbarvení je stabilní 1 hodinu • Výraznější reakce s albuminem než s globulíny • Detergent SDS zeslabuje reakci s albuminem více než reakci s globulíny a nízkomolekulárními proteiny Marion Mckinley Bradford (28. 10. 1946-3.5.2021) • A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;72:248-54 Stanovení bílkovin metodou s pyrogallolovou červení a molybdenanem • Při vazbě bílkovin na směs pyrogallolové červeně s molybdenanem za pH = 2,5 se přesune absorpční maximum od původních 460 nm (samotné činidlo) k600 nm (580-620 nm-komplex) • Absorbance při 580-620 nm je v omezeném rozsahu úměrná koncentraci bílkovin v roztoku Elektroforéza bílkovin se provádí s cílem zjistit abnormality bílkovin krevního séra. [gjp Bílkoviny jsou rozděleny podle svých elektroforetických pohyblivostí do skupin (frakcí), které vytvářejí charakteristický obrazec. §p Změny v tomto obrazci souvisí s různými druhy onemocnění nebo s různými patologickými stavy. Bílkoviny se dělí na 5 - 6 hlavních frakcí: + Albumin 56 - 66 % + al globulíny 2 - 3 % + a2 globulíny 8-12 % + P globulíny (PI, p 2) 7-10% + y globulíny 10-18% Elektroforeogramy HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 Iftf Sebia 16 17 1fl 19 20 21 22 23 24 25 26 27 26 29 30 Denzitometrické vyhodnocení 1 \ \ \ \ 3 4 8 9 10 1. prealbumin 8. Transferin 2. albumin 9. Beta-lipoprotein 3. oc-lipoprotein, ot-fetoprotein 10. C3 4. AlAT,orosomukoid 11. IgA,IgM, fibrinogen, „M", VLŘ 5. o^antichymotrypsin, Gc 12. IgG, CRP, „M", VLŘ globulin 6. A2M,Hp 7. hemoglobin Stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin • V naprosté většině případů reakce se specifickou protilátkou (výjimky: albumin, fibrinogen, A1AT -lze i jiným způsobem) • Radiální imunodifúze (RID) - precipitační metoda (d2 precipitačního prstence je úměrná koncentraci anály tu) • Reakce v roztoku (protilátka vždy v nadbytku!!) - úbytek intenzity záření ze zdroje po průchodu kyvetou s roztokem daný rozptylem světla na imunokomplexech (turbidimetrie) nebo měření rozptýleného světla (nefelometrie); pro nízké koncentrace (cca 0,5 - 10 mg/L) je specifická protilátka navázaná na latexové částice (nižší detekční limit - viz dále) • Reakce se značeným třetím reaktantem (pro velmi nízké koncentrace analytu <0?1 - 1 mg/L) Kvantitativní stanovení: pro koncentrace nad 5-10 mg/L A) Imunoprecipitační reakce v gelu (RID podle Manciniové) B) Elektroimunostanovení (EID) podle Laurella C) Imunoprecipitační reakce v roztoku ( s turbidimetrickou nebo nefelometrickou detekcí) A) Imunochemická reakce v gelu RID (Manciniová) 3 © ® 9 ® o o O o o o o o o o O O o o o O O o o O O c o O o c o O O o o o O o O o o o O O O O o o o o Measurement of the diameter of the precipitin rings PRECIPITACNI PRSTENEC V ZÓNĚ EKVIVALENCE GEL S INKORPOROVANOU PROTILÁTKOU Kvantitativní měření Imunochemická reakce v gelu Kvantitativní měření Elektroimunodifuze dle Laurella —1 í ' 7 m íl Imunoprecipitace v roztoku: Prostředí: PEG Detekce: nefelometrie, turbidimetrie Stanovení koncentrace: IgG? IgA? IgM? proteiny akutní fáze II TURBIDIMETRIE zdroj světla =1 kyveta s precipitátem detektor rozptyl světla NEFELOMETRIE detektor Měřící techniky r o © ® fotometrie Turbidimetrie a nefelometrie Radiální imuno difúze Ví J_ fluorescence luminiscence radioaktivita Heidelbergerova-Kendallova kfivka (Heidelberger M, Kendall FE. A quantitative theory of the precipitation reaction. J Exp Med 1935, 62: 697-720) Množství antigénu Vliv koncentrace protilátky na zónu „bezpečí" range Figure 19. Dose-response curves illustrating the effect of increasing antibody concentration on the security range (dotted line). 1: Low, 2: Medium, 3: High antibody concentration. Využití latexových částic (pro nízké koncentrace analytu) Ag from the sample + • AID bouncl to lala* Measw neměřit of turtiidlrrketry Kinetika versus end-point stanoveni z H. Reiber: Methodische Grundlagen der Analytik. In: Wildemann, Oschmann, Reiber (Eds.): Neurologische Labordiagnostik. Thieme, Stuttgart, 2006: p. 20.) End point nefelometrie Vi End-point ♦ fixni cas Buffer Ag Ab Time Figure 3. Signal development as a function of time. The addition of buffer, antigen (Ag), and antibody (Ab) to the reaction cuvette is indicated by arrows. Rate nefelometrie Buffer Ag Time Figure 4. Reaction velocity (rate) as a function of time. The addition of buffer, antigen (Ag), and antibody (Ab) to the reaction cuvette is indicated by arrows. UJ o Antigen Level E or H? J \ Get Cal Dilution Third injection of Cal Dilution Response if Antibody Excess (E) / Response if Antigen Excess (H) 60 85 REACTION TiME \) X einfallender Lichtstrahl Richtung und Intensität des Streulichts Partikeidu rchmesser Wellenlänge Nefelometr BN 100 Hale \ Focusinglens \ \ Receiver-- Board u i j j i 840 nm Nefelometr Immage 680 nm NIPIA režim (near infra-red particle immunoassay) - často třeba vícebodová kalibrace Certifikovaný referenční materiál (CRM) na bázi lidského séra: ERM-DA470k/IFCC Protein Certifikovaná hodnota nejistota Alfa2-makroglobulin (A2M) | 0,06 g/L ^| Alfal-kyselý glykoprotein (AAG) 0,617 g/L 0,013 g/L Alfal-antitrypsin (AAT) 1 0,03 g/L ^| Albumin 37,2 g/L 1,2 g/L C3c 1,00 g/L 1 0,04 g/L ^| C4 0,162 g/L 0,007 g/L Haptoglobin (HPT) 0,889 g/L 1 0,021 g/L f IgA 1,80 g/L 0,05 g/L | 0,18 g/L ^| IgM 0,723 g/L 0,027 g/L Transferin (TRF) 2,36 g/L 1 0,08 g/L ^| Transthyretin (prealbumin) (TTR) 0,220 g/L 0,018 g/L Beta2-mikroglobulin (B2M) 2,17 mg/L 1 0,07 mg/L f Plazmatické bílkoviny: obvyklé referenční meze Secchiero S, Sciacovelli L, Plebani M. Harmonization of units and reference intervals of plasma proteins: state of the art from an EQA scheme. Clin Chem Lab Med 2019; 57(1): 95-105 Bílkovina Ref.meze 1 Bílkovina Ref.meze Albumin 35 - 52 g/L ^| Prealbumin 0,2 - 0,4 g/L IgG 7-16g/L AAT 0,9 - 2,0 g/L 0,7 - 4,0 g/L AAG 0,5-1,2 g/L IgM 0,4 - 2,3 g/L A2M 1,3-3,0 g/L C3 ^^^^^B 0,9-1,8 g/L Mľl l^^^^^l 0,3 - 2,0 g/L C4 0,1-0,4 g/L CRP <5 mg/L Prealbumin = transthyretin (TTR) M.r. 54 000 Syntéza v játrech (a v plexus choroideus mozkových komor) Asociace s retinol-vázajícím proteinem Krátký biologický poločas =^> citlivý ukazatel stavu výživy a proteosyntézy v játrech Schopnost vázat dvě molekuly T4 nebo T3 Referenční meze: 0,2 - 0,4 g/L Snížení: snížený příjem proteinů; jaterní nemoci (snížená syntéza) Zvýšení: onemocnění ledvin (snížená rychlost glomerulární filtrace) Albumin • M.r. 67 000 • Gen na 4. chromosomu • Jeden řetězec, 585 aminokyselin; neobsahuje sacharidy (není glykoprotein) • Referenční meze: 35-52 g/L • FUNKCE: • Fyzikálně-chemické: zajišťuje koloidně-osmotický (onkotický) tlak, pufrovací kapacita • Transportní funkce Albumin - transportní funkce • Látky ve vodě nerozpustné: - nekonjugovaný bilirubin - Mastné kyseliny - Hormony - Léky(!) • Látky hydrofilní (adsorpcí): - Ca++ - Zn++ - Kyselina močová Stanovení albuminu (schéma vpravo z F. Novák: Úvod do klinické biochemie. Karolinum, Praha 2002) Vazba barviva =^> změna jeho absorpčního maxima: bromkresolová zeleň (BCG); bromkresolový purpur (BCP), 2-(4'- hydroxyazobenzen)benzoová kyselina (HABA) BCG: v prostředí o pH 4,2 fotometrické měření při 630 nm: pozitivní interference (ax a oc2-globuliny) se zvyšuje s časem a teplotou =^> měřit rychle (30 s po smíchání séra s barvivem) Reakcí se specifickou protilátkou proti lidskému albuminu (RID, turbidimetrie, nefelometrie) Stanovení CB + výpočet koncentrace albuminu z elfo (denzitometrické vyhodnocení) 400 500 Vlnová délka (um) 600 Obr. 6-4 Spektra BCO, HABA a jejich komplexů s albuminem Barviva využívaná pro stanovení albuminu Bromocresol green (BCG) 3,3 ',5,5 '-Tetrabromo-m-cresolsulfonphthalein M.w. 698.01 Bromocresol purple (BCP) 5,5'-Dibromo-o-cresolsulfonphthalein M.w. 540.22 Figure 1 Average and range for albumin values, as tested by bromocresol green (BCG) and bromocresol purple (BCP) ... 20 15 ^ 10 ^ c I o o 0 CD 3 8 3 H, n u u n □her u □ +1.96 SD 13.3 Mean U XJ n ■"fa u ° 6.4 -1.96 SD -0.4 -5 ■10 1 10 20 30 40 50 Average of BCG and BCP 60 Lab Med, Volume 49, Issue 4, November 2018, Pages 355-361, ir The content of this slide may be subject to copyright: please see the slide notes for details. C\ OXFORD 7 UNIVERSITY PftESS Výhody a nevýhody metod pro stanovení koncentrace albuminu v séru/plazmě Moreira VG et al. Lab Med, Volume 49, Issue 4, November 2018, Pages 355-361 Bromkrezolový purpur (BCP) Bromkrezolová zeleň (BCG) Podhodnocuje koncentraci albuminu u selhání ledvin a dialyzováných pacientů Nadhodnocuje koncentraci albuminu v oblasti nízkých koncentrací, podhodnocuje koncentraci albuminu v oblasti vysokých koncentrací Specifičtější, protože se váže na lidský albumin a neváže se na globuliny Interference specifické pro metodu - váže se nejen na albumin, ale také na al - a a2-globuliny Okamžitá reakce Delší inkubace zvyšuje vazbu BCG na jiné bílkoviny než albumin Výsledky v dobré shodě s imunonefelometrií a elektroforézou Pozitivní bias oproti imunonefelometrií a elektroforéze Snadno automatizovatelná Snadno automatizovatelná Vyžaduje kalibrátory a kontroly na bázi lidského séra (nízká afinita pro non-humánní albumin) Lze použít zvířecí kontroly a kalibrátory Alfa-1 -glob uliny • Alfa-1-fetoprotein (AFP) • Alfa-1-lipoprotein (HDL) • Alfa-l-glykoprotein (orosomukoid; AAG = alfa-l-acid glycoprotein) • Alfa-1-antitrypsin (AAT) • Alfa-l-antichymotrypsin Alfa-1 -antitrypsin (AAT, o^-inhibitor proteinas= otj-Pi) • Kvantitativně nej významnější inhibitor proteinas v plazmě • 33 genetických variant • Defektní alely: deficit AAT - nedostatečná inaktivace proteinas (elastasy) vznikajících při fagocytóze v plicních sklípcích => proteolytická destrukce elastinu => plieni emŕyzém => porucha ventilace, náchylnost k těžkým infekcím dýchacích cest Alfa-1-antitrypsin (AAT) • Indikace vyšetření: - podezření na vrozený nedostatek AAT aj-globulinové frakce na elfa!) - Pacienti s plicním emfyzémem - Novorozenci a kojenci s nejasnou hepatopatií • Metody stanovení: 1) Imunochemicky (RID? nefelometrie) 2) Amidolytické stanovení: AAT + trypsin (v nadbytku) —» komplex AAT-trypsin + zbylý volný trypsin BAPA (chromogen) —» benzoylarginin + p-nitroanilin (fotometrické stanovení při 405 nm) Alfa-1 -antitrypsin • Referenční meze: Novorozenci 2,0 - 4,0 g/L Kojenci 1,3 - 2,4 g/L Děti 1,3-3,0 g/L Dospělí 1,9-3,5 g/L • Speciální vyšetření při nedostatku AAT: - Izoelektrická fokusace - Určení genotypu molekulárně-biologickými metodami Alfa-1 kyselý glykoprotein (AAG, o roso muko id) • M.r. 40 000, pí 2,7; poločas: 2-3 dny • 45 % sacharidů • Syntéza v j átrech • Referenční meze: 0,48 - 1,26 g/L • Reaktant akutní fáze (vzestup za 12-24 hodin, maximum za 4 dny) => výhodné stanovení současně s CRP (začátek/vrchol/ odeznívání onemocnění) Alfa-2-globuliny • Ceruloplazmin • Inhibitor Cl-esterasy (Cl-INH) • Haptoglobin (Hp, HPT) • Alfa-2-makroglobulin (A2M) • Pre-beta-lipoprotein (VLDL) Ceruloplazmin (CPL) • M.h. 150 kD • 1 molekula váže 8 atomů mědi • 95 % Cu2+ v séru je vázáno na ceruloplazmin • Funkce: a) transport mědi, b) jako ferroxidasa -oxiduje Fe2+ na Fe3+ (nutný krok pro zabudování Fe2+ do molekuly transferrinu) • Referenční meze: 165-660 mg/L • Zvýšení: jako (později reagující) protein akutní fáze (antioxidační působení?) při zánětech, cholestáza, cirrhosa jater, nádorová onemocnění; vlivem estrogenů (v těhotenství, při užívání perorálních kontraceptiv) • Snížení: Wilsonova nemoc, Menkesův syndrom Haptoglobin (HPT) • Dva lehké řetězce (a) a dva těžké řetězce (p) navzájem spojené disulfidovými můstky • Syntéza v játrech • Poločas odbourávání 3,5-4 dny • Funkce: vychytávání uvolněného hemoglobinu (zábrana ledvinného poškození a ztrátám Fe)? antiproteinasová aktivita • Referenční meze: podle typu (Hp 1-1, 2-1, 2-2) • Zvýšení: reaktant akutní fáze • Snížení: tvorba haptoglobin-hemoglobinových komplexů (intravaskulární hemolýza; komplex vychytáván z krevního oběhu za 9 minut) Stanovení fenotypu haptoglobinu - výsledky (vzorky zprava doleva): vlevo 3. 10. 2022\ v pozici 7 Hpl-1; v pozici 3 Hp2-2; v pozicích 2,4,5,6,8,9,10 Hp2-1 vpravo 10. 10. 2022: v pozici 2,6,10 Hpl-1; v pozici 1,8 Hp2-2; v pozicích 3,4,5,7,9 Hp2-1 Alfa-2-makroglobulin (A2M) • M.r. 725 000 • Inhibitor proteinas • Vysoká molekulová hmotnost => u nefrotického syndromu (ztráty bílkovin - viz dále) zůstává v plazmě a odpovídá za relativně vysokou hodnotu alfa-2 frakce • Referenční meze 1,3-3,0 g/L Beta-globuliny • Beta-lipoprotein • Beta-2-mikroglobulin (LDL) • Zčásti • Hemopexin (Hx) imunoglobuliny • Transferrin (Tf) • Komplement (C3, C4) • Fibrinogen (Fbg) • CRP Hemopexin • M.r. 57 000 • Váže uvolněnou hemovou skupinu a přenáší ji do jater k metabolické konverzi na bilirubin • Referenční meze: 0,5 -1,5 g/L • Snížen tehdy, kdy se v plazmě objeví volný hem • U hemorhagické pankreatitidy a krvácení do tělesných dutin je hemopexin snížen při + normálních hodnotách haptoglobinu Transferin • M.h. 76 kD • Referenční meze: 2,0-3,6 g/L • Funkce: každá molekula transferinu má dvě vazebná místa pro Fe3+ • Může vázat také Mn, Cu a jiné kovy • Apo-transferin syntetizován zejména v játrech, syntéza stoupá při nedostatku železa Glykoformy transferinu tetrasialo- (80%) > pentasialo- (14%) > trisialo (4%) > disialo- (1%) a hexasialo- (1%) Cano A et si. J Clin Med 2021; 10(13): 2932 I i Sorbitol I | Fructose j Glucose j- Sucrose \ f Fructose-6-P f Fructtise-l-P | I MP1 Jsl ttpMHMtftW Mannose-6-P Gliceraldehyde DHAP ^ GDP \ fan nose ___|_L K / Goljrj CDT - AsialoTf NH, L>isiali)Ji HUOC^. A/ HOOf HOOf r 1 HOOC. TrisialoTf TerrasialoTf PunrasiainTf HexasialoTf ♦ Sialic acid 0 ■ M.in now o GlcNAc Transferin • Saturace transferinu - výpočet: • TfS (%) = 3,98*Fe-S (|imol/L)/Transferin (g/L) • Index selektivity S: • S = (IgG-U/IgG-S) : (Transferin-S/Transferin-U) • S < 0,1 ... selektivní Proteinurie • S > 0,2 ... neselektivní Proteinurie • 0,1 < S < 0,2 ... selektivitu nelze vyhodnotit • Alternativa: Albumin/IgG index CDT: Carbohydrate deficient transferrin („bezsacharidový transferin") CDT původně označovalo sumu asialo-, monosialo- a disialotransferinu • Biomarker alkoholismu • Definován jako % disialotransferinu z celkového transferinu (IFCC) • Referenční metoda: HPLC (standardizace IFCC) se spektrofotometrickou detekcí TRF saturovaného železem při 470 nm • Další metody: kapilární elektroforéza; imunonefelometrie (použití monoklonální protilátky selektivně detekující disialoformu spolu se zpravidla zanedbatelným množstvím monosialo- a asialotransferinu -kit firmy Siemens Healthineers) • Referenční meze: < 1,7 % (jasně patologické jsou hodnoty >2?0 %; při sledování je významná změna oproti „baseline" hodnotě o >0,2 %) B- Chromatogram izoforem transferinu A - typický obraz se zvýšenou frakcí disialotransferinu u alkoholika; atypický obraz se spojenou di- a trisialofrakcí u pacienta s jaterní cirhózou Stewart SH, Reuben A, Anton RF. Alcohol Alcohol. 2017; 52(1): 24-28 1500- 1000 500 10.0 JI I 1 Q / U /\s\ 1 dl tri tetra penta B 17.5 20.0 min 22.5 25.0 1500- 1000- < E 500 0- 10.0 25.0 Komplement • Soustava cca 30 sérových a membránových bílkovin; hlavní složky: 9 sérových bílkovin označovaných C1-C9 • Ústřední složkou je C3: fragment C3b se pevně (kovalentně!) váže na mikrobiální povrch • Komplex C5b-C9: „MAC" = membráne attack complex - perforuje membrány některých mikroorganismů (mikroorganismy však mohou být vůči lytickému působení komplementu chráněny buněčnou stěnou) Funkce komplementu • Opsonizace (C3b) • Chemotaxe (C3a, C5a) • Osmotická lýza (MAC: C5b-C9) • AKTIVACE KOMPLEMENTU: - klasická cesta: vazba protilátky (nebo pentraxinů - CRP; nebo mannosu vázající lektin /"lektinová cesta"/) na povrch (např. baktérie) —> odhalení vazebného místa pro Cl —> navázané Cl získá proteolytickou aktivitu - štěpí proteiny C4 a C2 —> vzniká „klasická" C3-konvertasa (C4bC2a), ta štěpí C3 na C3a a C3b —> vzniká C5-konvertasa (C4bC3bC2a) - alternativní cesta: C3 se v malé míře samovolně štěpí na C3b a C3a; v C3b se odhalí reaktivní thioesterová skupina, která reaguje s hydroxy- a aminoskupinami v blízkém okolí (na povrchu nějaké částice); k C3b se připojí faktor B, ten je pak štěpen faktorem D na Ba a Bb; komplex C3bBb stabilizovaný faktorem P (properdin) působí jako alternativní C3-konvertasa Komplement - diagnostické využití • Cl-INH = inhibitor Cl-esterasy: vrozený deficit je příčinou hereditárního angioneurotického edému (Quinckeho edém) • C3, C4: omezený význam v diagnostice imunokomplexových onemocnění (SLE, glomerulonefritis) Beta-2-mikroglobulin • M.r. 12 000 • Součást HLA antigénu L třídy, exprimován zejména hojně na povrchu lymfocytů • Dříve používáno stanovení v moči v diagnostice tubulárních proteinurií (ALE: nestabilní v kyselé moči) • Stanovení v séru: biomarker u malignit vycházejících z lymfocytární řady Fibrinogen • Na elektroforeogramu plazmy migruje v beta-gama interzóně • Koagulační faktor (faktor I) • M.r. 340 000 • Dimer ze tří polypeptidových řetězců • Funkce: regulovaná přeměna na fibrin • Referenční meze: 2,5 - 3,6 g/L (u starších jedinců až 4,8 g/L) • Metody stanovení: a) klasická metoda založená na trombinem katalyzované přeměně fibrinogenu na fibrin, b) reakce se specifickou protilátkou (elektroforéza není vhodná - nedokonalá separace fibrinogenu mezi frakcemi p- a y- globulínu) Gama-globuliny: IMUNOGLOBULINY • IgG, IgA, IgM, IgD, IgE • Těžké řetězce gamma, alfa, mí, delta, epsílon (y, a, ji, ô, £) • Lehké řetězce kappa (k), lambda (>^) • Molekula Ig tvořena 2 těžkými a 2 lehkými řetězci (vždy stejné) Imunoglobuliny - základní charakteristiky izotyp Biol. poločas (dny) lokalizace funkce Kone. v séru (g/L) IgG 21 Sérum, intersticiální tekutina Opsonizace; neutralizace; aktivace komplementu; přestup placentou; sekundární protilátková reakce 7-16 IgA 6 Sérum, slzy, sliny, povrch sliznic, kolo strum, mateřské mléko Ochrana sliznic, opsonizace 0,8-4,0 IgM 6 Sérum, membrána B lymfocytů Aktivace komplementu; primární protilátková reakce; receptor pro Ag na B lymfocytech 0,5-2,4 IgD 3 Sérum, membrána B lymfocytů Receptor pro Ag na B lymfocytech 0,1 IgE 2 Sérum, intersticiální tekutina Ochrana proti parazitům 0,0003 Imunoglobuliny • Snížené koncentrace: hypoimunoglobulinémie - primární (hereditární) defekty - sekundárně: těžký nefrotický syndrom, snížená syntéza při nádorových onemocněních, těžké infekce, cytostatická léčba; zvýšené odbourávání (hyperthyreosa, myotonická dystrofie, některá autoimunitní onemocnění) • Zvýšené koncentrace: hyperimunoglobulinémie - polvklonální: kompetentní odpověď imunitního systému na infekci - Monoklonální („paraproteinémie"): a) MGUS: monoklonální gamapatie nejasného významu b) maligní: plazmocytom (mnohočetný myelom, Kahlerova nemoc): IgG>IgA>fLC>IgM»nemoc těžkých řetězců, IgD, kryoglobulinémie Pozn.: IgM = „Waldenstrômova makroglobulinémie" Nemaligní onemocnění vzácně spojená s výskytem M-proteinu (zprav. MGUS) • Při imunitní reakci (po očkování nebo při akutní infekci) může být protilátková reakce proti určitému antigennímu epitopu velmi silná, takže se přechodně objeví i malé množství monoklonálních protilátek. Při adekvátní regulaci imunitní reakce zůstává pouze několik dlouhožijících plazmatických buněk, které se nedělí a secernují trvale určité množství protilátek. Paraproteiny - typizace A) imunoelektroforéza (dnes se již téměř nepoužívá) B) imunofixace - antiséra anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-kappa, anti-lambda (dle potřeby lze použít i anti-IgD, anti-IgE, anti-free kappa, anti-free lambda) po elektroforéze „fixují" paraprotein dané třídy v gelu, ostatní proteiny se odmyjí a gel se poté obarví HYDRAGEL IF 2/4 ELP G A M K L ELP G A M K L 3 4 — m ■ ■ - i — — — m = ■ ■ ■ 2 ELP G A M K L ELP G A M K L IMUNOFIXACE Určete, zda je přítomen paraprotein. Určete typ těžkého a lehkého řetězce. IMUNOFIXACE Někdy na sebe paraprotein (zejm. IgM) váže jiné bílkoviny (Ig) a nedaří se ho určit. Řešením je přidání malého množství merkaptoethanolu nebo dithiothreitolu. Vlevo: vzorek bez DTT; vpravo: vzorek s přídavkem 10 mmol/l DTT Izoelektrická fokusace (IEF): paraprotein se rozdělí na několik pásů („spektrotyp") - u IgG v těsné blízkosti Mnohem nižší detekční limit než elfo x nákladnější, komplikovanější hodnocení (snadné jen u IgG), obtížně použitelné pro IgM paraproteiny; rutinně se nepoužívá Zleva dovrava: detekce značenými vrotilátkami anti-IzG. anti-IzGic. anti-IzGA Sáv i % Í£l I 53 % I Paraproteiny - typizace M gradient v zóně kappa nebo lambda bez korelátu v zónách IgG, IgA, IgM (IgD, IgE) =^> volné lehké řetězce (v moči: „Bence- Jonesova bílkovina") HYDRAGEL IF 2/4 ELP G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L ELP G A M K L Kryoglobuliny • imunoglobuliny reverzibilně precipitující při teplotách nižších než je teplota lidského těla. • Dělíme je do 3 typů: • - I. typ: izolované monoklonální kryoglobuliny (paraproteiny IgM /nejčastěji IgM kappa/, vzácnej i IgG, IgA nebo monoklonální lehké řetězce) • - II. typ: smíšené kryoglobuliny (kombinace paraproteinu s polyklonálním imunoglobulinem, obvykle paraprotein IgM /nejčastěji IgM kappa/ s protilátkovou aktivitou proti polyklonálním IgG) • - III. typ: polyklonální imunoglobuliny, kdy je kryoglobulin tvořen imunoglobuliny jedné nebo více tříd tvořícími antigen-protilátkový komplex • Kryoglobulinémie ovlivňuje řadu laboratorních vyšetření (mj. zpomaluje sedimentaci), na všechna vyšetření by měl být vzorek séra nebo plazmy předehříván; někdy se doporučuje před elektroforézou inkubace séra s merkaptoethanolem nebo dithiothreitolem. • Ještě vzácnější než kryoglobuliny jsou tzv. pyroglobuliny - monoklonální imunoglobuliny ireverzibilné precipitující při teplotě 56°C. Kryoprecipitát po trojím promytí chladným ve vzorku séra a plazmy fyziologickým roztokem Henry Bence Jones (1813-1873) První publikovaný popis bílkoviny v moči precipitující při zahřátí na 40-60°C (po dosažení teploty 75°C se precipitát rozpustí) - „hy drátovaný deutoxid bílkoviny" u pacienta s myelomem (1846) Dnes víme, že jde o volné lehké řetězce (Edelman a Gally 1962) Volné lehké řetězce (FLC = Free Light Chains) • Kappa - gen na 2. chromosomu • Lambda - gen na 22. chromosomu • (těžký řetězec: gen na 14. chromosomu) • Fyziologicky produkovány v mírném nadbytku nad těžkými řetězci • M.r. 23 000 • Poločas v séru 2-4 hodiny (free kappa - přev. monomery), 3-6 hodin (free lambda - dimery) Stanovení: ELISA, RIA (home-made), nyní komerčně dostupné kity pro nefelometrické a turbidimetrické stanovení -protilátky vázané na latexových částicích: a) Polyklonální (Freelite™ firmy The Binding Site) b) Směs dvou monoklonálních (N Latex FLC kappa a lambda firmy Siemens) Volné lehké řetězce • Referenční meze (Freelite™): • sérum: free kappa 3,3-19,4 mg/L, free lambda 5,7 - 26,3 mg/L; poměr ÍK/Tk 0,26-1,65 • Moč: free kappa 5,4 ± 4,95 mg/L, free lambda 3,17 + 3,3 mg/L; průměrný poměr ÍK/fk 0,46-4,0 (první ranní moč) • Klinický význam stanovení v séru - marker maligního myelomu, vhodný ke sledování pacientů (drahé =^> nevhodný jako screeningový test) • Stanovení v moči není doporučováno (řada možných interferencí) ! Referenční meze FLCk, FLCl a poměru FLCk/FLCI při použití souprav dvou hlavních výrobců Souprava firma Použitá protilátka FLCk (mg/L)* FLCX (mg/L)* Poměr FLCk/FLCX** Freelite™ The Binding Site | Polyklonální ovčí 3,3-19,4 5,7-26,3 0,26-1,65 N Latex FLC™ Siemens Healthineers Monoklonální myší (směs) 6,7 - 22,4 8,3-27,0 0,31-1,65 * 95% referenční interval (percentil 2,5 - 97,5); ** minimum - maximum Monoklonální IgG kappa a free kappa v séru a intrathekální syntéza v likvoru detekovaná metodou izoelektrické fokusace Zleva doprava: IsG (IEF/IF, Sebia), IgGK, IgGk, free k, free X (IEF/AIB) 9 9' Reaktanty akutní fáze Definice: Sekreční proteiny jaterních buněk, jejichž tvorba a uvolnění do cirkulace jsou regulovány prozánětovými cytokiny (Maruna P. Proteiny akutní fáze. Maxdorf, Praha 2004. ISBN 80-85912-05-8) • „pozitivní" (koncentrace v séru/plazmě při zánětu stoupá): CRP, SAA, AAG, ar antitrypsin, otr antichymotrypsin, haptoglobin, ceruloplazmin, fibrinogen • „negativní" (koncentrace v séru/plazmě při zánětu klesá): transferin, prealbumin (transthyretin), albumin C-reaktivní protein (CRP) • M.r. 110-140 000 • Pět identických polypeptidových podjednotek o M.r. 21 000 (každá podjednotka může vázat Ca2+) • Patří mezi tzv. pentraxiny • Referenční meze: < 5 mg/L • U bakteriálních zánětů zvýšení až na stovky mg/L (vzestup už po 6 hodinách, max. za 48 hod.) • U virových zánětů normální nebo mírně zvýšené koncentrace • Korelace s aktivitou některých auto imunitních onemocnění (revmatoidní arthritis, M. Crohn) • STANOVENI: turbidimetricky pomocí protilátky navázané na latexové částice • FUNKCE: • Schopnost aktivovat komplement • Vazba na různé ligandy (např. polysacharidový obal pneumokoků C, cholinové fosfatidy, některé proteiny z rozpadlých buněk) • Opsonizace fragmentů nukleových kyselin a histonů =^> jejich rychlejší odstranění =^> zábrana tvorby autoprotilátek proti jaderným strukturám Další markery bakteriálního zánětu (ke stanovení nutné použít vysoce citlivé imunoanalytické metody se značeným reaktantem - ELISA, CLIA apod.) Prokalcitonin Biologická funkce neznámá Vzestup u systémových bakteriálních infekcí Referenční meze: < 0,5 ug/L Hodnoty u těžkých bakteriálních infekcí: 10-100 ug/L LBP = lipopolysacharid vázající protein Tvorba v játrech vlivem IL-1(3 a IL-6; váže lipopolysacharid (LPS) gramnegativních baktérií Vzestup během několika hodin u těžkých lokalizovaných i systémových bakteriálních infekcí Interleukin-6 Tvorba v monocytech, makrofázích, endotelových buňkách Stimuluje jaterní buňky k produkci reaktantů akutní fáze (je iniciátorem vzestupu CRP) Vzestup za 2-4 hodiny, koncentrace úměrná tíži zánětu Méně specifický Nejvyšší hodnoty u těžkých traumat a u sepse Akutni zänetlivä odpoved' zprostf edkovanä uvolnenim prozänetlivych cytokinü Slaats J et al. PLoSPathog 2016;12:el005973 Fever and hyperalgesia Release of acute phase proteins CRP a ferritin u bakteriálních a virových zánětů Slaats J et al. PLoSPathog 2016;12:el005973 SIRS (systemic inflammatory response syndrome) a sepse SIRS (Chakraborty RK, Burns B, StatPearls Publishing 2021) • Přehnaná obranná odpověď organismu • na poškozující stresor (infekce, trauma, operační zákroky aj.) • Zahrnuje uvolnění reaktantů akutní fáze, které jsou přímými mediátory • rozsáhlých autonomních, endokrinních, hematologických a imunologických • změn u postižené osoby • Navzdory svému obrannému účelu může dysregulovaná cytokinová bouře způsobit masivní zánětlivou kaskádu vedoucí k orgánové dysfunkci a dokonce i smrti Sepse v Život ohrožující orgánová dysfunkce způsobená dysregulovanou odpovědí hostitele na infekci (Singer M et al. JAMA 2016) SIRS se (suspektním) zdrojem infekce (Chakraborty RK, Burns B 2021) tj. prakticky všichni pacienti se sepsí mají SIRS, ale ne všichni pacienti se SIRS mají sepsi Biomarkery sepse Biomarker Obvyklá zkratka Referenční rozmezí Příklady navržených cut-off hodnot Přibližný biologický poločas C-reaktivní CRP <5 mg/L 50 mg/L 19 hod. protein Prokalcitonin PCT <0.5 |ig/L 2 ng/L, 10 ug/L 20 - 30 hod. Interleukin 6 ^^^^^^ <7 ng/L 50 ng/L <1 hod. Presepsin PSEP 60-365 ng/L 500 ng/L 4-5 hod. 729 ng/L 1000 ng/L Diagnostika sepse: Presepsin • Solubilní N-terminální fragment molekuly CD 14 • M.h. 13 kDa • Membránový CD 14 na monocytech a makrofázích rozeznává antigény baktérií, virů a plísní (zejm. lipoproteiny) • Po fagocytóze mikroorganismu a aktivaci signální dráhy TLR je CD 14 odloučen z membrány monocytů do cirkulace • Cut-off pro rozlišení SIRS a sepse: 327 ng/L (údaj výrobce) nebo 729 ng/L (Romualdo et al. 2014) • Zvýšené koncentrace u pacientů starších 70 let i bez přítomnosti zánětlivého onemocnění a při výrazně snížené glomerulární filtraci Proteinurie • Glomerulární kapilární stěna (zejm. glomerulární bazálni membrána) efektivně brání průniku bílkovin do moči; většina plazmatických bílkovin se za fyziologického pH chová jako polyanionty, jejichž filtraci brání negativní náboj bazálni membrány glomerulů • Většina profiltrovaného albuminu (99%) je resorbována v tubulech -fyziologicky se močí vyloučí <30 mg albuminu/24 h • Nízkomolekulární bílkoviny jsou volně filtrovány v glomerulech, ale jsou účinně resorbovány a katabolizovány v proximálním tubulu - i jejich koncentrace v moči jsou minimální • Fyziologická proteinurie je <150 mg/24 h, její nej významnější součástí je uromodulin (Tammův-Horsfallův protein) secernovaný tubulárními buňkami Henleho kličky (30-50 mg/24 h) Proteinurie Doporučená stanovení: Albumin: uvádět v mg/L a jako ACR (poměr albumin/kreatinin v g/mol) Celková bílkovina: uvádět v g/L a jako PCR (poměr protein/kreatinin v g/mol) Orientační semikvantitativní stanovení proteinu testovacími proužky v moči (mez detekce cca 150 mg/L) Je preferován „náhodný" (nejlépe první ranní) vzorek moči před 24-hodinovým sběrem Korekce na kreatinin (poměr bílkovina/kreatinin, albumin/kreatinin) Kategorie CKD podle albuminurie a porovnání s proteinurií Albuminurie (mg/24h) <30 30-300 >300 ACR (g/mol kreatininu) 3-30 >30 Proteinurie (mg/24 h) <150 150-500 >500 PCR (g/mol kreatininu) <15 15-50 >50 Doporučení České nefrologické společnosti a CSKB k diagnostice chronického onemocnění ledvin (CKD) 2021 Mikroalbuminurie = vylučování malých množství albuminu močí (žádný „mikroalbumin" neexistuje!) — dnes víceméně historický, ale stále používaný termín • 20-200 mg/L • Kvantitativní nefelometrické nebo turbidimetrické stanovení • Často známkou počínající diabetické nefropatie nebo poškození ledvin při hypertenzi (vysokém krevním tlaku) Diferenciální diagnostika proteinurií podle Doporučení České nefrologické společnosti a ČSKB k diagnostice chronického onemocnění ledvin (CKD) 2021, a z - sekce Doporučení Proteinurie príčina charakteristika tunkcni (pri tezsi práci/cvičení, ortostatická) Hemodynamická/glomerulární PU <1 g/24 h, přechodná prerenální Zvýšená plazmatická koncentrace nízkomolekulárních bílkovin, jejichž filtrace překročí resorpční kapacitu proximálního tubulu Např. volné lehké řetězce u monoklonálních gamapatií, myoglobin u rhabdomyolýzy, hemoglobin u akutní hemolýzy glomerulární Poškození glomerulární filtrační bariéry Selektivní (převaha albuminu) Ne selektivní (albumin i imunoglobuliny) tubulární Porucha zpětné re sorpce profiltrovaných nízkomolekulárních bílkovin v proximálním tubulu Přítomnost nízkomolekulárních bílkovin (alfal-mikroglobulin, beta2-mikroglobulin) postrenální Sekrece bílkovin do moči ve vývodných močových cestách (krvácení, zánět) Přítomnost alfa2-makroglobulinu a IgM Hlavní bílkoviny používané v diagnostice proteinurií (PU) bílkovina M.h. (kD) Diagnostický význam; příčina Rozhodovací meze mg/L mg/g Kr, (mg/mmol Kr) o^-mikroglobulin 33 Tubulární PU; nedostatečná tubulární zpětná re sorpce < 12 < 14 (<1,58) albumin 67 Glomerulární PU; zvýšená filtrace <20 <30 (<3,40) transferrin 76 Jako albumin <1,2 <1,9 (<0,21) IgG 150 Neselektivní glomerulární PU; kvocient IgG/albumin > 0,03 < 10 < 10 (<1,13) a2-makroglobulin 725 Postrenální PU; krvácení, exsudace; kvocient a2/albumin >0,02 <7 <7 (<0,79) Celková bílkovina < 100 <70 (<7,91) Typy proteinuric A - SDS gely (Sebia) - rozdělení bílkovin podle mol.hmotnosti B - Hodnocení za použití markerových (indikátorových) bílkovin Maachi M et al. Clin Chem 2004:50:1834-7 A B2M to« RBP ► m ■ A1M M"» Free light chains _wH ALB fc-TRF ► IfiQ- ► Haptoglobin ► A2M ► 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 B Multiple of upper reference limit IgG TRF ALB A1M RBP 5.4x 149x 171x 2.4x 0 5 0 10< ) 1SC 200 Multiple of upper relerence limit |s.5x 21x 39X 0 10 20 3( 40 Bílkoviny mozkomíšního moku (likvoru, CSF) Bílkovina m.h. (kDa) Hydrodynamický poloměr (nm) Orientační referenční rozmezí (dospělí) Význam stanovení Celková bílkovina n/a n/a 0,15-0,45 g/L Orientační zhodnocení funkce hemato-likvorové bariéry Albumin 67 3,5 100-300 mg/L Poměr koncentrací v likvoru a séru vypovídá o funkci hemato-likvorové bariéry (ani za patologických okolností není albumin syntezován v CNS - veškerý albumin v likvoru je plazmatického původu) 150 1 5'3 1 10-40 mg/L Odhad (výpočtem) či průkaz (elektroforeticky) IgM 970 13 <1,1 mg/L mtratnekami syntézy u zanetlivýcn onemocněni CNS 160 <5,0 mg/L B TP (beta-trace protein) 31 2,4 10-20 mg/L Koncentrace >1,3 mg/L v biologické tekutině (sekretu z nosu, ucha, z drénu po operaci aj.) nebo poměr koncentrací sekreťsérum >2,0 svědčí pro přítomnost likvoru v tekutině, tj. pro únik likvoru (likvorheu) Prealbumin 1 3'3 1 12-27 mg/L Běžně se nestanovuje Transferin 80 3,7 7-22 mg/L Celkový TRF se běžně nestanovuje; detekce asialofrakce TRF v biologické tekutině svědčí pro přítomnost likvoru (likvorheu) Bílkoviny mozkomíšního moku • Plazmatického původu (difúze přes hemato-likvorovou bariéru - cca 80%): stanovíme koncentraci v likvoru a séru a vypočteme KVOCIENT : . n — \.Proť\csp i VProí - l[Proť\serum • Podíl kvocientu zkoumaného proteinu a kvocientu albuminu označujeme jako INDEX zkoumaného proteinu, např. . IgG index = Q'9G/QMb • Zvýšené hodnoty indexu mohou nasvědčovat intrathekální syntéze • V praxi nej častej i po sužuj eme intrathekální syntézu imunoglobulinů u zánětlivých onemocnění CNS • Syntezované v CNS (intrathekálně -cca 20%): zpravidla stanovujeme koncentraci pouze v likvoru; původ může být: - gliální (S 100B, GFAP) neuronální/axonální (NSE, bílkoviny neurofilament, Tau protein) leptomeningeální (BTP, cystatin C) • Některé se využívají v diagnostice vybraných neurologických onemocnění (celkový a /hyper/fosforylovaný tau protein, Ap42 u Alzheimerovy nemoci, bílkoviny neurofilament u amyotrofické laterální sklerózy aj.) Koncentrace bílkovin v likvoru závisí i na místu odběru: - koncentrace CB a plazmatických bílkovin je vyšší v lumbálním likvoru oproti komorovému likoru - koncentrace bílkovin syntezovaných v buňkách mozku je vyšší v komorovém než v lumbálním likvoru - referenční meze publikované v literatuře platí pro lumbální likvor - horní hranice referenčního rozmezí QAlb je v komorovém likvoru odhadnuta na 40%, v likvoru z cerebelomedulární cisterny na 65% hodnoty pro lumbální likvor Původ bílkoviny Příklady V:L gradient S t Q-alb koncentrace Neurony, glie Tau-protein, NSE, S-100B > 1 se nemění Lepto-meningy Beta-trace protein, cystatin C 1:11 1:3,5 lineárně stoupá Částečně z plazmy Transthyretin, ACE, s-ICAM 1,1:1 (TT) Plazmatické Alb, IgG, IgM, IgA, 1:2,5 (Alb) nelineárně stoupá Koncepce hemato-likvorové bariéry a výpočty intrathekální syntézy imunoglobulinů prof. Hansotto Reiber (nar. 1940) www.horeiber.de • H. Reiber, K. Felgenhauer: Protein transfer at the blood-CSF barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clin Chim Acta 1987, 163:319-328 - historický průlom • Patologická změna „průtoku likvoru" (CSF flow rate) postačuje ke kvantitativnímu vysvětlení dynamiky plazmatických proteinů v likvoru (žádné zvýšení propustnosti kapilár -„no leakage") Q-lg jako funkce Q-Alb - "leakage" model Hyperbolická závislost Q-lg na Q-Alb 60 0 20 40 60 80 100 Q-Alb x 10A3 Závislost Q(Lim)-lg na Q-Alb 90 Q-Alb x 10A3 Hemato-encefalická a hemato-likvorová bariéra (ReiberH, Peter JB, J Neurol Sci 2001; 184: 101-22) Hemato-encefalická bariéra (Blood-brain barrier) • refers to the morphological basis for restriction of protein diffusion from blood into the brain tissue, in particular by the brain capillary walls Hemato-likvorová bariéra (Blood-CSF barrier) (pro bílkoviny) a functional term that includes all processes that influence the final protein concentration in lumbar CSF, including blood-brain barrier, protein diffusion into the CSF along its flow path and, in particular, the CSF flow rate Evaluated by albumin quotient, QAlb = AlbuminCSF/AlbuminSerum Referenční rozmezí QAlb závisí na věku: 3 ^ r , age (in years) '.Alb 10ó < 5 + 15 (Reiber H, Peter JB, JNeurol Sci 2001; 184: 101-22) age (in years) QAlb • 103 < 8 + 25 (Hegen H. et al. Clin Chem Lab Med 2016; 54: 285-92) Detekce intrathekální syntézy imunoglobulinů: „quantity versus quality" • Výpočet intrathekální (i.th.) syntézy: vychází ze změřených koncentrací albuminu (produkován pouze játry =^> veškerý albumin v likvoru je krevního původu) a Ig v likvoru a séru srovnání s referenční populací -statistický princip • Oligoklonální Ig: též vychází ze změřených koncentrací Ig v likvoru a séru (na gel jsou aplikována stejná množství Ig ve vzorcích likvoru a párového séra) srovnání obrazu v likvoru a párovém séru téhož pacienta =^> zákonitě lepší výsledky! bezvýhradně akceptováno pouze pro IgG • Co potřebujeme vědět pro výpočet intrathekální syntézy Ig: • Koncentrace albuminu v likvoru a séru • Koncentrace IgG (IgM, IgA, volných lehkých řetězců) v likvoru a séru • Albuminový kvocient: V Alb — [Alb]CSP/[Alb] Sérum • Ig kvocient (např. IgG - podobně pro IgM, IgA, ...) Qigc = UgG]CSF/[IgG] Sérum V nepřítomnosti intrathekální syntézy platí následující nerovnost: QAib>QIgG>QIgA>QIgM obrácení některé z těchto nerovností svědčí pro ith. syntézu - i v případě krevní příměsi Výpočet intrathekální syntézy Ig Reiberova hyperbolická funkce Závislost Q-IgG na Q-Alb - parametry Reiberovy hyperbolické funkce pro Q-mean, Q-lim (+3SD) a Q-lower lim (-3SD) Q-Alb Qig = ^(QA,b)2+b2-c b -»-Q(Lim)-lgG ^Q(mean)-lgG --Q(lower lim)-lgG 100 QumigG = 0.93^1 (QAibf +6*lQŕ -1.7*10" Význam jednotlivých symbolů • Na obr. je 1 ze 4 větví kompletní hyperbolické funkce: y= a/b * (x2+b2)°'5-c • a/b: směrnice asymptoty • c: transformace y- ové souřadnice (průsečík asymptoty s osou y není identický s průsečíkem os xay) x Alternativní vztahy Ig index = /q Extendovaný Ig index (Óhman et al. 1989, 1993): ext. Ig index = /n a I V Alb IgG: a = 1,12 (E-IgG index < 1,24) IgA: a = 1,15 (E-IgA index < 1,0) IgM: a = 1,9 (E-IgM index < 15) Auer M etal. Quantitation of intrathecal immunoglobulin synthesis - a new empirical formula. Eur J Neurol 2016, 23: 713-721. Q lim Ig = a Q Alb a b IgG* 0,882 1,035 IgA* 0,819 1,076 IgM* 1,845 1,340 fKLC** 0,9358 0,6687 fKLC*** 3.1276 0.8001 fLLC*** 2.1138 0.8650 (*Auer et al. 2016; ** Presslauer et al. 2014; *** Hegen et al. 2018) Qiim !gG> !gM a IgA jako funkce Q Alb - aneb jak odhadujeme intrathekální syntézu pomocí různých výpočtových vztahů Q lim IgG jako funkce Q Alb Q Hm IgM jako funkce Q Alb -IgG index 0.7 -Qlim IgG(Ô) Qlim IgG(H) -QlimlgG(R) -Qlim IgM(H) -Qlim IgM(R.) Q lim IgAjako funkce Q Alb 25 0 5 10 15 20 25 30 Q Albumin x 1000 -IgA index 0.34-Qlim IgA(Ó) Qlim IgA(H)-Qlim IgA(R.) Vlastní výpočet intrathekální syntézy Ig Igioc - {Qlg - Qlimlg)- i9sérum [mg/L] ^/f = i -(^^;-ioo(%) Qig neboli: IgIF= • 100 (%) l9CS¥ • Podle intrathekální frakce IgXIF posuzujeme dominanci intrathekální Ig syntézy v jednotlivých třídách (např. ith. IgM = 80%, ith. IgG = 25%: IgMIF > IgGIF) • Pro sledování průběhu onemocnění u konkrétního pacienta je naopak preferován Igloc Typy intrathekální protilátkové odpovědi (DGLN, Editor Dr. M. Wiek: Ausgewählte Methoden der Liquordiagnostik und Klinischen Neurochemie; 4. vydání, Mnichov 2020: str. 24-25) Typ reakce Onemocnění Žádná ith. syntéza IgG, IgA, IgM Časná fáze bakteriálních meningitid a virových meningoencefalitid Syndrom Guillain-Barré Dominance IgG - Roztroušená skleróza (IgM v 50%, IgA ve 20%) - Neurosyfilis (IgG + IgM, někdy dominance IgM; velmi vzácně IgA) - HIV encefalitida (jen IgG) - Infekce pomalými viry - Encefalitida asociovaná s protilátkami proti NMDA-receptoru Dominance IgA - Neurotuberkulóza (IgA izolovaně nebo spolu s méně výraznou ith. syntézou IgG) - Mozkový absces - Někdy u HSV a VZV meningoencefalitidy Dominance IgM - Lymeská neuroborrelióza (IgM > IgA > IgG) - Meningoencefalitida při příušnicích (IgM + IgA + IgG) - Klíšťová meningoencefalitida - Někdy u lymfomů s postižením CNS (monoklonální IgM) - Neurotrypanosomiáza (IgM + IgA + IgG, IgM v 95% případů) IgG + IgA + IgM 1 - Oportunní infekce při imunodeficitech (CMV, toxoplazmóza, mykotické infekce) - Neurocysticerkóza a jiné parazitózy Průkaz intrathekální syntézy Ig srovnáním elektroforetického profilu Ig v likvoru a séru (detekce oligoklonálních imunoglobulinů) • 1. SEPARACE - Nativní elektroforéza - Izoelektrická fokusace (doporučená separační metoda) - elektroforetické dělení bílkovin v gradientu pH- bílkoviny se rozdělí podle svých izoelektrických bodů • 2. DETEKCE Nespecifická detekce - barvení na bílkovinu (Coomassie blue /nutnost zahušťování CSF/, stříbření /nativní CSF/) Specifická detekce IgG pomocí anti-IgG protilátky (doporučeno) a) fixace anti-IgG protilátkou v gelu, odmytí nezreagovaných proteinů a následně „nespecifické" obarvení precipitátu b) Fixace enzymaticky (HRP) značenou anti-IgG protilátkou v gelu, odmytí nezreagovaných proteinů a chromogenní detekce (komerčně dostupný kit firmy Se bia) c) („imuno")blotting (komerčně dostupný kit firmy Helena Biosciences) d) afinitní imunoblotting (ALB) Oligoklonální IgG - typy IEF nálezu: IEF/IF (Sebia) typ 1 - typ 2 - typ 3 - typ 4 - typ 5 dvojice likvor (vlevo), sérum (vpravo) Klasifikace nálezů - 5 typů Typ 1 Typ 2 Typ 3 Typ 4 Typ 5 CSF S CSF S CSF S CSF S CSF S • Typ 1: jen „polyklonální" IgG v likvoru i séru • Typ 2: >2 IgG pásy v likvoru, jen „polyklonální" IgG v séru • Typ 3: IgG pásy shodné v likvoru i séru + IgG pásy přítomné pouze v likvoru • Typ 4: IgG pásy shodné v likvoru i séru • Typ 5: monoklonální IgG v likvoru i séru