ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay David Zeman ELISA — historie první neizotopová varianta imunoanalýzy • E. Engvallová, P. Perlmann (Švédsko) 1971: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 8: 871-874. Vo%n.: stejné jako R. Yalowová a S. A.. Person v pňftaděKLA (1959) si prináp nedali patentovat (významné historické memento, ^ejména pro dnešní dobu!) • S. Avraemas, B. Guilbert (Francie) 1971: A method for quantitative determination of cellular immunoglobulins by enzyme-labeled antibodies. Eur] Immunol 1: 394-396. ELISA — charakteristika, varianty • Heterogenní imunoanalytická metoda Jeden z imunoreaktantů je zakotvený na pevnou fázi (immunosorbent), zpravidla stěny jamek mikrotitrační destičky (96 jamek — řádky A-H, sloupce 1-12) • Jeden z imunoreaktantů je značený enzymem (Enzyme-linked) • V posledním reakčním kroku je přidán substrát pro příslušný enzym • Koncentrace analytu je úměrná množství vzniklého produktu, který poskytuje signál • Sendvičová (nejčastěji, nejnižší detekční limit; typicky přímá úměra mezi koncentrací analytu a signálem) • Kompetitivní (přímá/nepřímá; typicky nepřímá úměra mezi koncentrací analytu a signálem) Schéma pracovního postupu sendvičové (vlevo) a kompetitivní (vpravo) ELISA potah destičky protilátkou/ arttigenem (0.25 -10 mg/L) inkubace 12-24 hod při 2 - 8°C promyv (l-2krát) blokováni volných vazebných míst 30 min - 2 hod promyv (3-4krát) aplikace standardů a vzorků (inkubace 30-180 min) promyv (3-4krát) MERENI promícháni aplikace zastavovacího roztoku aplikace substrátu (inkubace 10-30 min) promyv (3-5krát) aplikace značené protilátky (inkubace 30 - 60 min) potah destičky protilátkou/ antigenem (0.25 -10 mg/L) inkubace 12-24 hod při 2-S'C * — promyv (1-2krát) blokování volných vazebných míst 30 min - 2 hod promyv (3-4krát) aplikace standardů a vzorků, aplikace značeného antigenu/protilátky (inkubace 30-180 min) promyv (3-5krát) MERENI promíchání aplikace zastavovacího roztoku aplikace substrátu (inkubace 10-30 min) BLISA — mikrotitrační destička po ukončení reakce přidáním stop roztokd Příklad: experimentální detekce protilátek proti natalizumabu — „bridging assay" (2 různé koncentrace) Potah destičky: natalizumab (humanizovaná IgG4 protilátka proti oc4-podjednotce integrinů oc4|31 a oc4|37) v karbonát-bikarbonátovém pufru, pH 9,6 Aplikace vzorků pacientských sér jednak nativních, jednak předinkubovaných s natalizumabem Aplikace biotinylováného natalizumabu Aplikace streptavidinu s navázanou HRP Substrát: TMB, stop: 1M H2S04 Vzorky obsahující protilátky proti natalizumabu vykazují pozitivitu (BI, B2 a B7, B8; D3, D4 a D9, D10; F5, F6 a Fll, F12); předinkubované vzorky jsou negativní Amplifikace signálu: systém biotin-(strept)avidin • Protilátka značená biotinem (M.h. 244 Da) lze snadno konjugovat s proteiny v místě jejich volných aminoskupin); na jednu molekulu protilátky se může vázat několik molekul biotinu —► amplifikace signálu • Konjugát avidin (M.h. 68 kDa)-HRP nebo streptavidin-HRP • Interakce (nekovalentní) avidinu s biotinem je velmi silná (Kd = 10"15 mol/L) • 1 molekula avidinu (streptavidinu) obsahuje 4 vazebná místa pro molekulu biotinu • Vaječný avidin je glykoprotein o pí 10,5 — cave nespecifické elektrostatické interakce • Streptavidin (ze Streptomyces avidinii) —piv neutrální oblasti, neobsahuje sacharid • Neutrální avidin — částečné odstranění sacharidů a snížení pí — redukce nespecifických vazeb • Bližší informace viz katalogy produktů, např. firma Vector Laboratories, www.vectorlabs.com Roztoky pro ELISA testy Použití roztoku Název roztoku složení Potah destičky PBS pH 7,4 NaCl 8,0 g; KH2P04 0,2 g; Na2HP04 1,1 g; KCl 0,2 g; H20 ad 1 L Na-karbonátový pufr, pH 9,6 Na2C031,6 g; NaHC03 2,4 g; H20 ad 1 L 0,1 M bikarbonátový pufr, pH 9,6 NaHC03 8,4 g; H20 ad 1 L Promývání PBS/Tween 20 0,05%, pH 7,4 Tween 20 0,5 mL; PBS ad 1 L Fyziologický roztok/Tween 20 0,1%, pH 7,5 NaCl 9,0 g; Tween 20 1,0 mL; H20 ad 1 L Blokování volných vazebných PBS/BSA 2%, pH 7,4 BS A 2g; PBS ad 100 mL míst PBS/kasem0,l%, pH 7,4 Kasem 0,1 g; PBS ad 100 mL PBS/sušené mléko 2%, pH 7,4 Sušené mléko 2 g; PBS ad 100 mL Enzymy a substráty Enzym M.h. (kDa) pH optimum substrát Detekční limit pro enzym (mol/L) Detekční limit pro enzymem značený IgG (fA,g/L) Křenová 44 5 - 7 H202/ABTS (c) 1013 16,0 peroxidasa (HRP) EC 1.11.1.7 H202/oPD (c) 1014 2,0 H202/TMB (c) 2-1015 0,3 H202/HPPA (f) 1015 0,3 Alkalická 86 (druhová 9-10 pNPP (c) 2-1013 43,0 fosfatasa (ALP) EC 3.1.3.1 odlišnost - 58 /garnát/ až 140 /skot/ MUP (f) 2-1013 0,5 ß-galaktosidasa 465,4 6-8 oNPG (c) 350,0 EC 3.2.1.23 (homotetramer) MUG (f) 1,0 Gluko s aoxidas a EC 1.1.3.4 160 4-7 S peroxidasou spřažená reakce; přídavek glukosy, peroxidasy a substrát pro peroxidasu (c) = chromogenní, (f) = fluorogenní substrát. ABTS = 2,2'-azino-di(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonát; HPPA = kyselina 3-(p-hydroxyfenyl)propionová; MUG = 4-methylumbelliferyl-ß-D-galaktopyranosid; MUP = 4-methylumbelliferylfosfát, oNPG = ö-nitrofenyl-ß-D-galaktopyranosid; oPD = o fenylendiamin, pNPP = />-nitrofenylfosfát; TMB = 3,3',5,5'tetramethylbenzidin Substrát - zastavovací roztok - měření Substrát Stop roztok Vlnová délka měření ABTS IM kyselina citrónová + 0,05% NaN3 405 nm oPD 2,5M H2S04 490 nm TMB 2,0M H2S04 370 nm (bez stop roztoku) 450 nm (po zastavení reakce) pNPP 3M NaOH 405 nm oNPG IM Na2C03 405 nm Nelineární kalibrace • Závislost koncentrace stanovované látky na signálu získaném v ELISA testu (zpravidla optické denzitě) NENÍ lineární • V každé analytické sérii je nutné zařadit několik standardů (nejméně 4) • Existuje několik modelů kalibrační závislosti: point-to-point: jednotlivé body kalibrační křivky jsou propojeny úsečkami 4-parametrová (popř. 5-parametrová) — sigmoida kvadratická funkce kubická funkce Nelineární kalibrace - kvadratický polynom, kubický polynom a 4-parametrová logistická funkce • OD = a + b • conc + c • conc2 • OD = a + b - conc + c • conc2 + d • conc3 • OD = r ,a~* , + d [l+(conc/č)b\ V polynomech jsou a, b, cz. ^/koeficienty. Ve 4-parametrovém modelu je a dolní asymptota, b směrnice v inflexním bodě, c koncentrace v inflexním bodě a d horní asymptota. OD je optická denzita, concyt koncentrace analytu. Zjednodušené schéma ELISA testů pro detekci volných lehkých řetězců typu kappa (flcLC): nepňmá kompetitivní (vlevo); sendvičová (vpravo) Primární MAb s navázaným Ag ze vzorku L Antigen (BJk) Primární anti-fkLC MAb Y_ I Sek. Anti-Mo Ig Ab I Sek Anti-Hu (f+b)KLC Ab" J L biotin streptavidin HRP Příklad kalibrace (nepřímá kompetitivní ELISA pro stanovení fkLC) • Kalibrátor č. 1 o koncentraci 2,56 mg/L a dále ředění dvojkovou řadou až k 0,01 mg/L • 9- (lO-)bodová sigmoidní kalibrační křivka 2a použití rovnice A ... absorbance při 492 nm (proti referenční vlnové délce 620 nm) C a D ... dolní a horní asymptota kalibrační křivky a... posun lineární části kalibrační křivky v systému souřadnic P ... směrnice lineární části kalibrační křivky X ... log koncentrace fkLC (|lg/L) (popř. 0,005 mg/L) A = C + [(D-C)/(l+e -2(«+ß*x) )] Koncentrace počítány z rovnice kalibrační křivky po vyjádření x pomocí programu Microsoft Excel Kalibrační křivky a křížové reakce v nepřímém kompetitivním a sendvičovém ELISA testu Nepřímá kompetitivní ELISA: kalibrace fKLC (modře); křížová reakce: IVIgG (fialově) E c CM 0.0 2.0 4.0 6.0 log c (ng/ml) 8.0 Sendvičová ELISA: kalibrace fKLC (modře), křížová reakce: IVIgG (fialově) 6.0 log c (pg/ml) 10.0 Srovnání variant použité nepřímé kompetitivní ELISA metody Srovnání mezi preinkubací s MAb (plná modrá křivka) a převrstvením vzorku MAb (čárkovaná červená křivka) 1.0 -i-1 0.0 -I-1-1-1-1 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 log c (ng/ml) Srovnání standardní metody (plná modrá křivka) a metody s biotin-streptavidinovou amplifikací (čárkovaná červená křivka) o.o -I-1-1-h- 0.0 1.0 2.0 3.0 log c (ng/ml) Koncentrace fkLC získané standardní ELISA metodou a metodou s biotin-streptavidinovou amplifikací vil vzorcích CSF, séra a moči 16 - -2 □_ o Regresní přímka: y = 1,0552x-0,1464 RA 2=0,9911 4 6 8 10 Standardní metoda (mg/l) 12 14 Analytické charakteristiky metody: 150 a detekční limit (n = 14) Průměr (mg/l) SD (mg/l) Rozmezí (mg/l) 150 0,133 0,024 0,095-0,169 Detekční limit = D - 0,1*(D-C) 0,024 0,008 0,012 - 0,041 Vazebná křivka MRZ reakce detekce specifických IgG protilátek proti virům spalniček (measles), zarděnek (rubella) a varicella zoster v likvoru a séru s výpočtem intrathekální syntézy — význam pro podporu diagnózy roztroušené sklerózy MRZ reakce - kit firmy Virotech, kalibrační křivka modifikovaná přídavkem 5. kalibrátoru - s použitím původní čtyřbodové křivky řada vzorků neměřitelně nízkých, zejm. u anti-measles IgG OD 4xředěného nejnižšího kalibrátoru > 10 x(OD blanku + 3 SD) - ověřeno opakovaně pro všechny používané kity (measles, rubella, VZV, EBV) - arb.j. znásobeny x 10 (vzhledem k logaritmické ose koncentrací) ,..\M-14-5.14.DAT Plate ID: M-14.5.14 od 2.500 2.000 1.500 1.000 0.500 0000 -0.500 1 ooc Printed on 5/14/2014 at 12:13:50 PM _ Measles OD Versus Concentration 3 162 10 000 31.623 100.000 316.228 1000 000 Concentration (arb.j ) Fit1 3162.278 ELISA - instrumentace promyvacka ELISA reader iMark (Bio-Rad) Automatizace: ELISA analyzátor D SX (Dynex)