DIAGNOSTIKA RNA DNA PŘÍMÁ NEPŘÍMÁ analýza mikrosatelitů SCORING •Restrikční analýza PCR produktu •Hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy •detekce variant pomocí sond •ARMS •MLPA •Triplet Primed PCR • SCANNING •analýza teploty tání (SYBR Green) •sekvenování EXPRESE SESTŘIH „SEKV. EXONŮ“ DIAGNOSTIKA RNA DNA PŘÍMÁ NEPŘÍMÁ analýza mikrosatelitů SCORING •Restrikční analýza PCR produktu •Hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy •detekce variant pomocí sond •ARMS •MLPA •Triplet Primed PCR • SCANNING •analýza teploty tání (SYBR Green) •sekvenování EXPRESE SESTŘIH „SEKV. EXONŮ“ velikostní separace molekul DNA •princip – podobný klasické ELFO (místo gelu polymer + užití fluorescenčního značení) •příprava fluor. značených fragmentů → kapilární ELFO (příprava fragmentů je nejvariabilnější částí) FRAGMENTAČNÍ ANALÝZA FRAGMENTAČNÍ ANALÝZA •umožňuje analyzovat produkty předcházejících reakcí • společně s produkty v kapiláře analyzován i hmotnostní standard → umožňuje určit velikost (počet bp) • produkty i hm. standard musí být fluorescenčně značeny • různé fluorescenční značky – nutné vybrat kombinace s nepřekrývajícími se spektry https://www.cogentech.it/DNA-sequencing-technical-details.php HMOTNOSTNÍ STANDARD •obsahuje fluorescenčně značené fragmenty o definované délce (bp) Electropherogram of the GeneScan™ – 600 LIZ® Size Standard https://www.cogentech.it/DNA-sequencing-technical-details.php FRAGMENTAČNÍ ANALÝZA velikost fragmentů PCR produktů je určena vzhledem k fragmentům hm. standardu → zjištěná velikost je relativní •odpovídá daným podmínkám analýzy → nelze srovnávat mezi sebou u různých strojů, podmínek •pokud zachováme podmínky – stroj, kapilára, standard aj. – výsledky by měly být srovnatelné •plochu/výšku píků lze srovnávat pouze, pokud jsou značeny stejnou značkou (intenzita značek se může lišit!) Example category image description METODA MLPA MLPA = Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification •založena na kvantitativní multiplexní PCR •princip – amplifikace sond závislá na ligaci •účel – detekce relativního počtu kopií specifických sekvencí (nejčastěji v porovnání se standardním kontrolním vzorkem) → identifikace genomických změn, především rozsáhlejších delecí/duplikací v rámci genů nebo chromozomů •další aplikace – stanovení SNP, metylace v promotorové oblasti METODA MLPA MLPA SONDY 1. DENATURACE/HYBRIDIZACE 2. LIGACE nahybridizované části sondy jsou spojeny ligázou 3. AMPLIFIKACE •ligované sondy jsou amplifikovány pomocí univerzálního páru primerů !amplifikují se sondy, ne zkoumaná DNA! 4. FRAGMENTAČNÍ ANALÝZA •fluorescenčně značené produkty jsou separovány kapilární elektroforézou dle své délky (počtu nt) ANALÝZA VÝSLEDKŮ •výška výsledného vrcholu daného amplikonu odpovídá relativnímu počtu kopií cílové sekvence •výsledky je možné hodnotit okometricky nebo pomocí SW Coffalyser.Net •dávány do poměru sondy reference a testovaného vzorku 1 = standardní počet kopií 0,5 = heterozygotní delece 1,5 = heterozygotní duplikace (u genů na autozomech) VÝHODY MLPA multiplex – detekuje změny počtu kopii až 50 specifických sekvencí v jedné PCR reakci •dokáže odlišit sekvence lišící se v jediném nukleotidu •vyžaduje minimum DNA (20 ng (3000 buněk)) •identicky protokol pro různé aplikace •všechny potřebné reagence jsou součástí kitu •nezbytné vybavení bývá běžnou součástí všech molekulárně biologických laboratoří NEVÝHODY MLPA detekuje jenom změny v relativním množství – neodliší například diploidní a triploidní buňky •vysoka citlivost na kontaminaci reakce •nutnost mít minimálně 50% buněk nesoucích danou přestavbu •časově náročná a obtížná výroba vlastních sond (komerčně však dostupná řada sond) •SNP v místě ligace můžou vest k falešným výsledkům (výsledek ověřit jinou metodou nebo pomocí sekvenace vyloučit přítomnost SNP) DUCHENNOVA SVALOVÁ DYSTROFIE (DMD) progredující svalová slabost – kosterní– srdeční a dýchací svaly •vyskytuje se s frekvencí 1:3000 narozených chlapců •klinický obraz •zpočátku bezpříznakové onemocnění – vývoj probíhá několik měsíců standardně •kolem 2.-6. roku – nástup příznaků (problémy s chůzí, vstáváním aj.) •postupný rozvoj myopatie dolních končetin (pozorujeme tzv. Gowersovo znamení; „kachní chůze“) •kolem 12. roku – upoutání na invalidní vozík •postižení dalších skupin kosterního svalstva •postižení svalu srdečního (→ srdeční selhání), postižení plicních svalů (→ umělá plicní ventilace) •kolem 30. roku – smrt DUCHENNOVA SVALOVÁ DYSTROFIE (DMD) příčina – defekty v genu pro svalový protein dystrofin (gen DMD) •dystrofin = strukturní svalový protein – zprostředkovává interakci mezi buněčným cytoskeletem (aktinem) a ECM GEN DMD rozsáhlý gen – 79 exonů •lokalizace Xp21 → X-vázaná recesivní choroba •většina defektů DMD genu = copy number variation •frekvence delecí/duplikací v DMD genu u DMD/BMD pacientů je odhadována 60-70 % pro delece a 5-10 % pro duplikace → prvním krokem ve vyšetřovacím algoritmu molekulárně genetické diagnostiky je metoda MLPA •delece/duplikace exonů mohou být out of frame nebo in frame •DMD – delece/ duplikace měnící čtecí rámec, nonsense mutace •BMD – delece/duplikace zachovávající čtecí rámec Beckerova svalová dystrofie (BMD) – mírnější forma Geny na chromozomu X ŽENA 2 kopie → stejné jako u autozomů MUŽ = HEMIZYGOT 1 kopie → poměry se mění 1 = standardní počet kopií 0 = delece 2= duplikace ARMS ARMS = amplification refractory mutation system •PCR s alelově specifickými primery •princip – Mismatch PCR primeru na 3´konci znemožňuje PCR → pokud primer nehybridizuje na svém 3' konci dokonale – nedochází k amplifikaci PRINCIP ARMS HODNOCENÍ ARMS CYSTICKÁ FIBRÓZA – Elucigene® CF-EU 2v1 komerčně vyráběný kit •detekuje 50 nejčastějších mutací v CFTR genu •multiplexní alelově specifická PCR následovaná fragmentační analýzou •2 mixy •mixA – MT + WT primery pro F508del (→ kontrola úspěšnosti PCR v případě přítomnosti MT produktů) •mixB – WT (bez F508del) •oba mixy obsahují 2 páry primerů pro STR markery → kontrola kontaminace cizí DNA WT - F508del (+STR) MT + WT pro F508del (+STR) WT - F508del (+STR) MT + WT pro F508del (+STR) DIAGNOSTIKA RNA DNA PŘÍMÁ NEPŘÍMÁ analýza mikrosatelitů SCORING •Restrikční analýza PCR produktu •Hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy •detekce variant pomocí sond •ARMS •MLPA •Triplet Primed PCR • SCANNING •analýza teploty tání (SYBR Green) •sekvenování EXPRESE SESTŘIH „SEKV. EXONŮ“ Expanze trinukleotidových repetic TR trinucleotide repeat TREs trinucleotide repaet expansion TRED trinucleotide repeat expansion diseases expanze nový typ mutace, popsán 1991 mutace F:\Myotonic.gif C:\WINDOWS\Plocha\Expanze a delece trinukleotidů při replikaci_soubory\sch1.gif Expanze a delece trinukleotidů při replikaci PREMUTACE „ČASOVANÁ BOMBA V GENOMU“ repetice – nestabilní v meióze → počet může narůstat •k velkým expanzím dochází pouze při maternálním /paternálním přenosu •mechanismus vzniku – „sklouznutí“ polymerázy → repetice mohou vytvářet sekundární struktury (např. vlásenka) → poté reparační systém vlásenku odstraní → oblast repetic se rozšíří → v dalším kole replikace polymeráza přisyntetizuje podle prodlouženého templátu další repetici F:\Obrázky\MD4.bmp Klinická anticipace spojená s expanzivním prodlužováním trinukleotidových repetic • asymptomatický prarodič • (MD1 : 5 - 50 CTG repetic) • • • rodič s mírným klinickým projevem (MD1: 100 CTG repetic) potomek s těžkým průběhem choroby (MD: 1500 CTG repetic) F:\Obrázky\MD3.bmp F:\Obrázky\MD1.bmp Přehled a základní charakteristika některých chorob asociovaných s expanzí trinukleotidů Choroba Dědičnost Frekvence Popis Lokus Gen Protein Pozice expanze Sekvence trinukleotidu Počet opakování Původ nestability normální patologické Fragilní X (FRAX-A) XD 1/2500 mentální retardace Xq27.3 FMR-1 (FRAXA) RNA binding 5´UTR CGG 5 až 54 200 až 4000 M Hungtigtonova chorea AD 1/5000 až 15000 demence 4p16.3 IT15 huntigtin ORF CAG 11 až 34 35 až 121 P Myotonická dystrofie 1 AD 1/8000 svalová slabost 14q13.3 DMPK proteinkináza 3´UTR CTG 5 až 35 50 až 2000 M Kenedyho choroba XR 1/50 000 atrofie svalů Xq11 AR androgen. receptor ORF CAG 12 až 34 40 až 62 P Spinicelebrální ataxie 1 AD postižení míšních provazců a mozečku 6p22 SCA1 ataxin 1 ORF CAG 6 až 39 40 až 80 P C:\WINDOWS\Plocha\scanmdy.jpg P1 P2 P4 P3 Triplet Primed PCR PCR P1/P2 P1 P2 (CTG)n alely < cca 100 (CTG) M 1 2 3 4 5 6 7 Strategie molekulárně genetického vyšetření TRED detekce 2 alel genu heterozygot s expandující alelou TP PCR PCR P1/P2 DNA pacienta ( susp. TRED) vyloučení diagnózy zdravý homozygot detekce 1 alely genu vyloučení diagnózy potvrzení diagnózy TP PCR PCR ( P1/P2) C:\WINDOWS\Plocha\scanmdy.jpg * * C:\WINDOWS\Plocha\scanmdy.jpg C:\WINDOWS\Plocha\scanmdy.jpg C:\WINDOWS\Plocha\scanmdy.jpg