HEMOSTÁZA (zástava krvácení) = soubor mechanismů, které na jedné straně brání vzniku krvácení, na straně druhé staví krvácení již vzniklé • Reakce cév v místě poranění •Reakce tkáně v místě poranění – zvýšený tlak tkáně • Činnost krevních destiček • Srážení krve HEMOSTÁZA jako součást homeostázy Dokonalá rovnováha několika systémů: • endotel cévní stěny • kolagen ležící pod endotelem • tonus cév • počet a kvalita krevních destiček • srážlivé a fibrinolytické systémy • charakter proudění v cévě brání jak krvácení, tak intravaskulárnímu srážení krve REAKCE CÉV Vasokonstrikce. Stupeň vasokonstrikce závisí na stupni poškození cévy. Serotonin a tromboxan A2 z destičkových granul. Adrenalin. Trombin – stimulace endotelu a sekrece endotelinu-1. KREVNÍ DESTIČKY (TROMBOCYTY) Bezjaderné, bezbarvé, granulované, nejmenší formované elementy krevní. Vznik: megakaryocyty kostní dřeně pod vlivem kolonie stimulujících faktorů – interleukinů (IL-1, IL-3, IL-6) a granulocyty a makrofágy stimulujícího faktoru (GM-CSF) Počet: 200 000 – 500 000 v ml, z toho třetina ve slezině a dvě třetiny v cirkulaci Žádné věkové ani pohlavní rozdíly v počtu. Trombocytoza – po splenektomii. Velikost: 2 – 4 mm průměr, 0,5 – 1 mm tloušťka, 4 – 8 fl objem Tvar: hladké, okrouhlé disky Tvar udržován cytoskeletem - prstenec mikrotubulů kolem periferie, silně invaginovaná membrána, kanalikulární systém spojený s extracelulárním prostorem. Membrána: obsahuje receptory pro přilnutí na vhodné povrchy, např. kolagen, von Willebrandův faktor, fibrinogen Cytoplasma: obsahuje aktin, myosin, glykogen, lysozomy a Granula: denzní granula (neproteinové substance – serotonin, ADP, adenonukleotidy) a a granula (proteinový obsah: faktory srážení, destičkový růstový faktor – PDGF) Glykokalyx: 10 – 50 nm, směs bílkovin a mukopolysacharidů (faktory systému srážení, ionty, AMK, histamin, léky…) Stavba trombocytů Funkce destiček • Ochrana organismu před ztrátou krve • Udržování integrity cévní stěny a hojení poranění cév (destičkový růstový faktor z a-granul) • Zánětlivé reakce, změny permeability kapilár, odstraňování cizorodých látek, virů, bakterií, odvržení transplantátu… • Nosič pro různé látky absorbované na povrch destiček Trombocyty a imunita Trombocyty a zánět Trombocyty a nádorové buňky https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2019.01805/full ZÁSTAVA KRVÁCENÍ I. Adheze - Negativní náboj na povrchu trombocytů a endotelu (proteoglykany, heparan sulfát) - Obnažení cévní stěny – kolagen a proteiny extracelulární matrix - Receptory pro kolagen a další na trombocytu (integriny) - von Willebrandův faktor (endotel, megakaryocyty, trombocyty) a jeho sekrece pod vlivem cytokinů a hypoxie - vazba na GP Ib/Ia - Kolagen – Gp Ia/Iia - Fibronektin, laminin – Gp Ic/IIa Aktivace a změna tvaru, degranulace - Vazba ligandů (kolagen, ADP, trombin) na příslušné receptory - Iniciace signálních kaskád a buněčné odpovědi – aktivace trombocytů - Následná degranulace trombocytů (exocytóza) - Denzní granula - ATP, ADP, serotonin, Ca2+ − a granula – vWF, faktor V, fibrinogen - Aktivace COX a uvolnění tromboxanu A2 - Změny cytoskeletu a tvaru trombocytů ADP Ca++ Serotonin Vasokonstrikce Noradrenalin Denzní granula Alfa granula Fibrinogen PDGF aterosklerosavWF V XIII vWF Kolagen Endotel Tromboxan A2 AA COX-1 PGH2 Aspirin Vasokonstrikce Aktivace Inhibice Ticlopidine Ib/IX Agregace - Amplifikace odpovědi po vazbě ligandů – nábor dalších trombocytů - ADP (P2Y12 receptory), serotonin, tromboxan A2 - Uvolněný vWF se váže na příslušné receptory – nábor dalších trombocytů a „vazba“ mezi trombocyty - Konformační změna receptoru Gp IIb/IIIa – vazba fibrinogenu - Formace trombu - Závěrečná fáze - obnažení a uvolnění fosfolipidů (serotonin, TXA2) a za přítomnosti vápenatých iontů (uvolněných z trombocytů) dochází k aktivaci koagulační kaskády Inhibice Fibrinogen Receptor IIb/IIIa Abciximab vWF AGREGACE Trombocyty - souhrn ZÁSTAVA KRVÁCENÍ II. V klasickém pojetí se tvorba červeného trombu sestává ze dvou systémů - Vnitřní systém – vnější systém aktivace faktoru X. Vnitřní – kontakt krve s negativně nabitým povrchem – povrch trombocytů Vnější – kontakt s poškozenými buněčnými membránami – membránově vázaný tkáňový faktor Následuje aktivace faktorů – kaskáda dějů – často zymogeny, aktivované faktory – serinové proteázy = kontrolovaná proteolýza Finálními kroky jsou aktivace společného systému, vznik trombinu a polymerního fibrinu. Protrombin (faktor X) – trombin - sled enzymových reakcí - anionické fosfolipidy (membrány trombocytů), vápenaté ionty Fibrinogen – fibrin monomer – fibrin polymer (stabilizace, faktor III, Ca2+). Prokoagulační faktory Proteiny koagulační kaskády mají typickou doménovou strukturu. - Signální peptid - Propeptid - EGF-like doména - Kringle (smyčka) doména - Katalytická doména Propeptidová doména je bohatá na zbytky kyseliny glutamové – gkarboxylace (vitamín K) a vazba vápenatých iontů Vnitřní cesta Faktor XIIa konvertuje prekalikrein na kalikrein, který zpětně katalyzuje a urychluje konverzi neaktivního faktoru XII na XIIa – příklad pozitivní zpětné vazby. - Faktory IXa, Xa a trombin proteolyticky štěpí faktor VIII za vzniku VIIIa, který je kofaktorem další reakce. - VIIIa spolu s IXa, vápenatými ionty (z destiček) a negativně nabitými fosfolipidy vytváří trimolekulární komplex tenázu. - Tenáza konvertuje faktor X na Xa. Vnější cesta - Zahájena faktory mimo cévní systém - Exprese tkáňového faktoru mimo cévy - Ten je receptorem pro plasmatický protein – faktor VII - Aktivace – vznik VIIa - Spolu s vápenatými ionty vznik trimolekulárního komplexu, který se podobá tenáze - Proteolytická aktivace faktoru X Společná cesta - Zahájena faktorem Xa - Následná aktivace faktoru Va - Tvorba trimolekulárního komplexu (Xa, Va, vápenaté ionty spolu s PL) = protrombináza - Konverze protrombinu na trombin - Konverze fibrinogenu na fibrin Trombin - Trombin katalyzuje konverzi proteolýzu fibrinogenu (vznik fibrinopeptidů A a B) – a, b, g - Monomery fibrinu spontálně polymerizují a tvoří gel – zachycení krevních elementů - Aktivace faktoru XIII a vznik polymerní sítě - Trombin katalyzuje vznik dalšího trombinu a Va a VIIIa – pozitivní zpětná vazba - Parakrinní působení trombinu – endoteliální buňky uvolňují NO, prostaglandin I2, ADP, vWF, TPA – trombocyty (PAR-1) – spojení trombocytů s koagulační kaskádou Moderní pojetí – proč ne tradiční model 1. Iniciační fáze • = vnější cesta, expozice TF a následná kaskáda 2. Amplifikační fáze • Akumulace trombinu (pomalá) • Nábor dalších trombocytů v místě poranění cévy • Vznik Va a amplifikace protrombinázové aktivity 3. Propagační fáze • Na povrchu prokoagulačních fosfolipidů – trombocytů • Kaskáda se vznikem trombinu, fibrinu a jeho polymerizace – zesíťování 4. stabilizace trombu Moderní pojetí – buněčný model Tenázový komplex Protrombinázový komplex Protrombinázový komplex Význam vápenatých iontů a fosfolipidů Tkáňový faktor Regulation of TF activity. A: induced exposure of phosphatidylserine (PS). Under resting conditions, TF-exposing cells maintain a nonsymmetrical membrane composition, resulting in low PS contents in the outer membrane leaflet and high contents in the inner leaflet. This asymmetry is maintained through ATP-dependent inward transport of PS by flippases and outward transport of non-PS by floppases. Upon stimulation, calcium transients will inhibit flippase and stimulate the nonselective lipid transporter scramblase, resulting in PS exposure and the creation of a negatively charged surface that functions to bind coagulation factors. B: TF disulfide regulation. TF is kept on the cell surface in an inactive state through PDI- and/or nitric oxide (NO)-dependent reduction of the TF allosteric disulfide. Oxidation of the allosteric disulfide restores TF coagulant function. C: intravascular cells, such as activated monocytes, PDI-dependently shed TF-positive MPs. D: asTF on cellular surfaces or MPs may synergize with normally spliced TF to enhance TF procoagulant activity - Zdroje TF? Trombin a trombocyty Trombin a trombocyty Trombin trombinem aktivovaný inhibitor fibrinolýzy (TAFI) Inhibitor tkáňového faktoru (TFPI) Antitrombin (AT) Aktivovaný protein C (aPC) ŘÍZENÍ HEMOKOAGULACE Hemokoagulace vyvažována protisrážlivými mechanismy: Nehumorální řízení: Souvislý neporušený endotel. Proud krve: omezení zvětšování koagula, zředění a odplavení faktorů srážení krve. Humorální řízení: Vzájemné negativní působení tromboxanu A2 a prostacyklinu. Fibrin: silně váže trombin – „antitrombin“ Antitrombin III: cirkulující inhibitor proteáz (aktivních forem faktorů IX, X, XI, XII), vazba na proteázy koagulačního systému usnadněna heparinem pocházejícím ze žírných buněk (kofaktor heparinu) Trombmodulin: trombin vážící protein, produkován endoteliálními buňkami Trombin + Trombmodulin = aktivátor proteinu C Protein C: inaktivace faktorů V a VIII inhibice inhibitoru aktivátoru tkáňového plasminogenu (=více plasminu – rozklad fibrinu) Protein S: kofaktor proteinu C Plasmin (fibrinolysin): aktivní složka fibrinolytického systému. Prekurzor: plasminogen, katalýza trombinem a tkáňovým aktivátorem plasminu (TPA) – využití v terapii infarktu myokardu!!! Streptokináza. Inhibitor tkáňového faktoru (TFPI): plazmatický protein asociovaný s membránou endoteliálních buněk, komplex s VIIa a vápenatými ionty – inhibice proteázové aktivity VIIa („antitrombotický povrch cév“) - PGI2 – vazodilatace – buňky endotelu - Tok krve, inhibice aktivace trombocytů - Oxid dusnatý – endoteliální buňky, inhibice adheze a agregace trombocytů Parakrinní antikoagulační faktory Protistážlivé mechanismy a endotel - přehled Fibrinolytické faktory - t-PA – serinová proteáza, hydrolýza plazminogenu a vznik plazminu (endotel) - Katecholaminy a bradykinin zvyšují hladiny cirkulujícího t-PA - u-PA – serinová proteáza urokinázového typu (plasma) - u-PAR – receptor pro u-PA (vazba) - Plasminogen – plasmin (játra) - PAI-1 – inhibitor aktivátoru plasminogenu, plasma a trombocyty - PAI-2 – jen těhotenství (placenta) – zvýšený risk trombózy během těhotenství? - α2-antiplasmin – játra, ledviny - vazba plasminu (1:1) a jeho inaktivace A simplified representation of the fibrinolytic system. Solid arrows denote stimulation and activation, and dotted arrows denote inhibition. α2ap α2antiplasmin; PAI-1 plasminogen activator inhibitor; TAFI thrombin activatable fibrinolysis inhibitor; t-PA tissue-type plasminogen activator; u-PA urokinase plasminogen activator endotel Plasma – plasminogen-bound zymogen activated by trombin-trombmodulin complex (liver) Plasma (liver) Plasma ANTIKOAGULACE Defibrinace: odstranění fibrinu (preparáty z hadích jedů) – in vitro Dekalcifikace: vyvázání nebo odstranění vápenatých iontů (citrát sodný, šťavelan draselný nebo amonný) – in vitro Heparin: přirozené antikoagulans, žírné buňky, účinné pouze za přítomnosti antitrombinu III, také in vivo Kumarinové deriváty (dikumarol, warfarin): inhibice účinků vitamínu K v játrech – poruchy faktorů II, VII, IX, X, proteinu C, proteinu S (usnadňuje aktivaci Va a VIIIa pomocí proteinu C) Hirudin: obsolentní, slinné žlázy pijavek (Hirudo medicinalis) Vyšetření krevní srážlivosti - aPTT - Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aPTT), 28 – 40 s - Quick – rychlost přeměny protrombinu na trombin 12 – 15 s; International Normalized Ratio 0,8 -1,2 - TT – trombinový čas 17 – 24 s - Pozn. FDP (fibrinové degradační produkty) a D-dimery = markery koagulace s následnou fibrinolýzou - Dekalcifikovaná plasma - kaolin-kefalinový komplex + přebytek vápenatých iontů - Kefalin nutný pro aktivaci faktoru X - („náhražka destičkových fosfolipidů“) - Dekalcifikovaná plasma - Tkáňový tromboplastin + přebytek vápenatých iontů - Dekalcifikovaná plasma - Trombin + přebytek vápenatých iontů STREPTOKINÁZA - Beta-hemolytický streptokok - Konverze plasminogenu na aktivní plasmin; - Terapie tromboembolických stavů ONTOGENEZE HEMOSTÁZY • vWF, trombomodulin, tkáňový faktor, TFPI – mRNA detekovatelná již 4 týdny po oplození • Syntéza koagulačních faktorů započíná 5. týden • Srážecí a fibrinolytická aktivita detekovatelná 10. týden • Difúzní exprese tkáňového faktoru, který se podílí na řízení buněčné proliferace a diferenciace • Animální modely: – Absence TF, TFPI a protrombinu je pro embryo letální – Absence FVIII, TPA, PAI-1 a plasminogenu není letální a nemá vliv na vývoj embrya • Velmi rychlé generování trombinu (i u předčasně narozených dětí) – kombinace zvýšeného množství cirkulujícího TF a sníženého TFPI a antitrombinu, zvýšená exprese TF na monocytech a endoteliálních buňkách • Snížená koncentrace koagulačních faktorů u plodu (zvyšuje se po porodu) s výjimkou WF, faktoru VIII a fibrinogenu • Snížená koncentrace vitamín-K dependentních proteinů (10% plazmatická koncentrace vitamínu K matky) – zvýšené riziko krvácení • Fibrinogen plodu má více negativní náboj, jiná je i struktura vWF • Po porodu se zvyšuje koncentrace koagulačních faktorů, některé dosahují normální struktury a hladin dospělých již po třech týdnech (fibrinogen, vWF), jiné až v průběhu puberty (protrombin, protein C) • U novorozenců zvýšená adheze trombocytů (vlivem struktury vWF) • V případě nutnosti suplementace koagulačních faktorů – větší Vd, větší dávky PORUCHY HEMOSTÁZY Krvácivé stavy = chorobné stavy, u kterých vznikají krvácivé projevy buď spontánně nebo po neúměrně malém podnětu. •Vasogenní poruchy krevního srážení •Trombocytární krvácení: 1)trombocytopenie 2)trombocytopatie •Koagulopatie – chybění nebo nedostatek plazmatických koagulačních faktorů: 1)Poruchy syntézy: dědičné (hemofilie), získané (karence vitamínu K, terapie deriváty kumarinu) 2)Poruchy přeměny: •konsumpční koagulopatie a hyperfibrinolýza •mnohočetné transfuze •imunokoagulopatie •terapie heparinem •paraproteinemie