praktikum č. 3 AGLUTINACE PRECIPITACE IMUNOELEKTROFORÉZA IMUNOFLUORESCENCE ELISA, RIA, LIA WESTERN BLOT ZÁKLADNÍ DĚLENÍ IMUNOLOGICKÝCH LABORATORNÍCH VYŠETŘENÍ • Serologická vyšetření – základním materiálem pro vyšetření • SÉRUM • Buněčná vyšetření – základním materiálem pro vyšetření • PERIFERNÍ ŽILNÍ KREV • Další zdroje materiálu pro imunologické vyšetření – mozkomošní mok, lymfatické uzliny, bioptické vzorky orgánů, kostní dřeň, bronchoalveolární laváž ODBĚR MATERIÁLU K IMUNOLOGICKÉMU VYŠETŘENÍ 4. uchování séra k dalšímu použití • 2 týdny při teplotě 4 °C • měsíce při teplotě –20 °C • roky při teplotě –80 °C 1. odběr venózní srážlivé krve 2. centrifugace 3. přenesení séra do jiné zkumavky SEROLOGICKÁ VYŠETŘENÍ – proces získávání séra ODBĚR MATERIÁLU K IMUNOLOGICKÉMU VYŠETŘENÍ Krev odebranou pro buněčná vyšetření není většinou možno skladovat delší dobu. Vyšetření je nutné provést do několika desítek minut (vyšetření fagocytárních funkcí) až několika hodin (vyšetření počtu a funkce lymfocytů). BUNĚČNÁ VYŠETŘENÍ – proces získávání buněk protisrážlivé činidlo EDTA protisrážlivé činidlo heparin INAKTIVACE SÉRA Zahřátí séra na 56 °C po dobu 30 minut. Dochází k funkční inaktivaci proteinů komplementové kaskády, proto již nelze vyšetřit aktivitu komplementové kaskády. Dochází také k inaktivaci viru HIV. Je ale možné měřit koncentraci většiny sérových bílkovin včetně složek komplementové kaskády. REAKCE ANTIGENU S PROTILÁTKOU IN VITRO • EPITOP o oblast antigenu, která reaguje s vazebným místem příslušné protilátky • PARATOP o vazebné místo protilátky (oblast N-terminálních částí variabilních částí lehkého a těžkého řetězce) • AFINITA o síla vazby mezi epitopem a paratopem • AVIDITA o síla interakce polyvalentní protilátky s polyvalentním antigenem PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ FÁZE SEROLOGICKÉ REAKCE Primární fáze serologické reakce • pokud je zkoumaná protilátka v séru přítomna, dochází k vazbě protilátky na antigen • není patrná pouhým okem Sekundární fáze serologické reakce • uplatňuje se multivalence antigenu a polyvalence protilátek • vzniká prostorový komplex velkého počtu molekul antigenu a protilátek o vysoké molekulové hmotnosti PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ FÁZE SEROLOGICKÉ REAKCE … vzniklé komplexy jsou • viditelné pouhým okem (AGLUTINACE, PRECIPITACE) • mění roztok pravý na nepravý (koloidní) (TURBIDIMETRIE, NEFELOMETRIE) _________________________________________ • pokud uspořádání reakce umožňuje průběh jen primární fáze reakce nebo průběh sekundární fáze jen ve velmi omezeném rozsahu, je nutné vizualizovat reakci imunochemicky následnou detekcí (IMUNOESEJE) ANTIGLOBULINOVÉ PROTILÁTKY sekundární antisérum • xenogenní protilátky (např. králičí nebo myší ), získané hyperimunizací, purifikované afinitní chromatografií, případně značené (fluorochromy, enzymy a podobně) • váží se na konzervované struktury imunoglobulinových molekul, nikoliv jejich vazebné místo! Příklady sekundárních antisér: • RaHuIgG (rabbit anti-human IgG) reaguje s lidskými IgG různých specifit (proti Rh, proti antigenům mikrobů …) CITLIVOST METOD K PRŮKAZU PROTILÁTEK precipitace 30 g/ml aglutinace 1 g/ml radioimunoassay a ELISA 1 pg/ml INTERPRETACE LABORATORNÍCH TESTŮ • SPECIFICITA o pravděpodobnost, že test bude negativní u zdravých osob • SENZITIVITA o pravděpodobnost, že test bude pozitivní u nemocných POLYKLONÁLNÍ a MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY • POLYKLONÁLNÍ PROTILÁTKY o Směs imunoglobulinových molekul, jejichž vazebná místa nesou specificitu vůči různým epitopům na celé molekule antigenu o Získávají se obvykle imunizací zvířat • MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY o Produkt jednoho klonu B-lymfocytů, vykazují jedinečnou specificitu proti jednomu epitopu na molekule antigenu o Získávají se obvykle metodikami in vitro KOMPLETNÍ A INKOMPLETNÍ PROTILÁTKY • Tzv. INKOMPLETNÍ PROTILÁTKY o přestože dojde k jejich vazbě na antigen, nedojde k sekundární fázi reakce a tím k vizualizaci serologické reakce Příčiny o na straně antigenu o nízká antigenicita (málo epitopů, jejich špatná dostupnost) o velké elektrické odpudivé síly mezi částice o na straně protilátky o ne všechny protilátky se uplatňují v aglutinačních reakcích stejně (IgM x IgG) PŘEHLED METOD PRO STANOVENÍ ANTIGENU NEBO PROTILÁTKY • vizualizace pomocí sekundární fáze reakce o AGLUTINACE (přímá, nepřímá) o PRECIPITACE (jednoduchá, v kombinaci s elektroforézou, imunofixace) • vizualizace pomocí následné detekce o IMUNOFLUORESCENCE o IMUNOANALÝZA (RIA, EIA, řada modifikací) o IMUNOBLOT, IMUNODOT a g l u t i n a c e princip reakce antigen KORPUSKULÁRNÍ POVAHY • snadná vizualizace proběhlé reakce o díky velikosti antigenu o díky průběhu reakce v tekutině Vazbou dvoj a vícevazebných protilátek na povrch antigenu dojde k překonání odpudivých, způsobených negativním nábojem na povrchu částic (zeta potenciál), a vytvoří se mezi nimi můstky … … vzniká AGLUTINÁT a g l u t i n a c e faktory ovlivňující kvalitu aglutinační reakce • dostatek protilátek o příliš velké ředění protilátek → aglutinace neproběhne • přítomnost protilátek proti různým epitopům o rozdíl v aglutinaci mezi monoklonálními a polyklonálními protilátkami • vzdálenost mezi jednotlivými antigenními částicemi o odpudivé elektrické síly na povrchu částic klesají se čtvercem vzdálenosti a g l u t i n a c e přímá a nepřímá přímá aglutinace antigeny se nacházejí přímo na zkoumané částici průkaz krevních skupin, přímý Coombsův test, určování izolovaných bakteriálních kmenů (zejména ze skupiny enterobaktérií), Widalova reakce, Weil-Felixova reakce, průkaz některých zoonóz, … nepřímá aglutinace zkoumaný antigen je navázán na povrchu vhodných makromolekulárních částic latex-fixační test, nepřímý Coombsův test, rychlé testy pro ambulantní vyšetření (ASLO), … a g l u t i n a c e určování krevních skupin ANTIGENY NA POVRCHU ERYTROCYTŮ polysacharidové skupinový systém AB0 (antigen A, antigen B) skupinový systém Lewis, P a Ii glykoproteinové skupinový systém Rh (antigen D) skupinový systém MNSs, Lutheran, Kell, Duffy, Diego a g l u t i n a c e určování krevních skupin skupinový systém ABO isohemaglutininy anti-A Antigen B isohemaglutininy anti-B Antigen A isohemaglutininy anti-A isohemaglutininy anti-B Antigen A Antigen B a g l u t i n a c e skupinový systém Rh COOMBSŮV TEST Průkaz inkompletních protilátek proti antigenům Rh PŘÍMÝ Coombsův test Průkaz in vivo navázaných antierytrocytárních protilátek NEPŘÍMÝ Coombsův test Průkaz cirkulujících antierytrocytárních protilátek Coombsovo antisérum protilátky proti lidským sérovým globulinům (polyspecifické antisérum obsahující protilátky proti IgG, komplementu, těžkým i lehkým řetězcům imunoglobulinů) a g l u t i n a c e latexová aglutinace aglutinační reakce, při které je antigen (při průkazu protilátek) nebo protilátky (při průkazu antigenu) navázán na povrch latexových částic příkladem je latex-fixační test k průkazu revmatoidního faktoru (RF) • RF je autoprotilátka namířená proti Fc části IgG • částice latexové suspenze jsou navázány modifikované lidské imunoglobuliny (agregované IgG) • v případě přítomnosti IgM protilátek proti Fc části lidského IgG v séru pacienta jsou takto připravené částice tímto sérem aglutinovány p r e c i p i t a c e princip reakce antigen NEKORPUSKULÁRNÍ POVAHY o nízké molekulové hmotnosti Antigen o nízké molekulové hmotnosti je rozpustný v kapalině a tvoří pravý roztok a při optimálním poměru antigenu a protilátky dochází ke vzniku makroskopicky zřetelné prostorové mřížky tvořené imunokomplexy. … vzniká PRECIPITÁT PRECIPITACE PROBÍHÁ … • v kapalinách (nefelometrie, turbidimetrie) • v gelech (vstřícná a radiální imunodifuze) … vzniká precipitační linie v místě ekvimolární koncentrace antigenu a protilátky … antigen a protilátka difundují gelem na podkladě koncentračního gradientu p r e c i p i t a c e … v gelech p r e c i p i t a c e … v kapalinách NEFELOMETRIE měření rozptylu viditelného světla TURBIDIMETRIE měření úbytku prošlého světla viditelné světlo rozptyl světla úbytek světla E L I S A enzyme-linked immunosorbent assay princip reakce ke zjištění koncentrace antigenu nebo protilátky k detekci reakce mezi antigenem a protilátkou se používá enzym (konjugát zvířecí protilátky proti lidské protilátce IgG, IgA nebo IgM značené enzymem) Použití v klinické praxi: • v současnosti zřejmě nejvíce používaná laboratorní metoda v imunologických a klinických laboratořích • průkaz protilátek (antibakteriálních, antivirových, autoprotilátek) nebo antigenů • vysoká citlivost testu umožňuje průkaz analytů o nízké koncentraci • ELISA není vhodná k detekci analytů o vyšší koncentraci (např. koncentrace sérových imunoglobulinů) – vzhledem k nutnosti vysokého ředění vzorků možnost velké chyby stanovení! E L I S A enzyme-linked immunosorbent assay princip reakce ke zjištění koncentrace antigenu nebo protilátky • vazba antigenu na pevnou fázi (jamka mikrotitrační destičky) • inkubace a následné promytí destičky • aplikace séra s předpokládaným výskytem protilátek proti vyšetřovanému antigenu (dojde k vazbě protilátky na antigen) • inkubace a následné promytí destičky • aplikace konjugátu zvířecí (myší, králičí, …) protilátky proti lidskému IgG, IgA nebo IgM konjugované s enzymem • inkubace a následné promytí destičky • aplikace substrátu (bezbarvý substrát → enzym → barevný produkt) • inkubace • zastavení probíhající enzymatické reakce • změření absorbance jamek spektrofotometricky (intenzita výsledného zbarvení je v určitém rozmezí koncentrací přímo úměrná množství navázané protilátky) E L I S A enzyme-linked immunosorbent assay princip reakce navázaný antigen na dně jamky mikrotitrační destičky IgG, IgA a IgM protilátky proti navázanému antigenu konjugát protilátky namířené proti IgG značený enzymem přeměna bezbarvého substrátu na barevný produkt nenavázané protilátky ze séra pacienta namířené proti jinému antigenu, než který je na dně destičky stanovení IgG protilátek namířených proti antigenu na dně mikrotitrační destičky (pokud bychom chtěli stanovit IgA protilátky (resp. IgM protilátky), musíme použít konjugát anti-IgA (resp. anti-IgM) i m u n o f l u o r e s c e n c e princip reakce zjištění přítomnosti antigenu nebo autoprotilátky k detekci přítomnosti antigenu nebo protilátky se používá fluorochrom (konjugát zvířecí protilátky proti antigenu nebo proti lidské protilátce ve třídě IgG, IgA nebo IgM značené flourochromem) PŘÍMÁ IMUNOFLOURESCENCE • detekce přítomnosti antigenu nebo protilátky ve tkáních pomocí protilátek značených flourochromem • diagnostika puchýřnatých chorob, SLE, porfyrií, vaskulitid, glomerulonefritid a podobně NEPŘÍMÁ IMUNOFLOURESCENCE • detekce přítomnosti specifických protilátek v séru tak, že protilátky přítomné v séru pacienta jsou po vazbě na antigen dárcovské tkáně označené zvířecí protilátkou proti lidským IgG, IgA a IgM imunoglobulinům značenou flourochromem • detekce přítomnosti autoprotilátek e l e k t r o f o r é z a princip metodiky • nabité částice se pohybují v elektrickém poli • rychlost pohybu částic je závislá na velikosti celkového povrchového náboje, velikosti a tvaru molekuly a její koncentraci v roztoku NATIVNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA BÍLKOVIN • bez denaturačních činidel • proteiny migrují gelem podle svého celkového náboje, velikosti a tvaru (citlivost elektroforézy je dána charakterem pórů gelu) • elektroforéza sérových bílkovin (rozdělení proteinů plazmy na 5-6 frakcí) • Využití elektroforézy v klinické praxi: • analýza a dělení směsí bílkovin, charakterizace povrchů organizmů (bakterií, virů a podobně), diagnostika monogenních chorob a podobně i m u n o e l e k t r o f o r é z a princip metodiky 1. fáze • rozdělení séra elektroforézou na gelu 2. fáze • do gelové vrstvy se podélně na kraji vykrojí úzký žlábek • do žlábku se napipetuje polyspecifické antisérum • po inkubaci dojde k reakci mezi antigenem jednotlivých elektroforeticky rozdělených složek a antisérem → vytvoří se precipitační linie, která se zvýrazní obarvením • každý oblouček (1 protein) a má charakteristický tvar a umístění na imunoelektroforegramu • Využití v klinické praxi: • zjišťování některých gama patií a poruch v biosyntéze imunoglobulinů kombinace elektroforetického a imunodifuzního dělení i m u n o f i x a c e princip metodiky 1. fáze • rozdělení séra pacienta elektroforézou na gelu do 6 drah 2. fáze • do drah se napipetuje monospecifické antisérum (anti- IgG, IgA, IgM, kappa, lambda). • antiséra difundují do gelu a v místě reakce s příslušným antigenem vytváří imunokomplexy ve formě precipitátu • Využití v klinické praxi: • imunofixace bílkovin séra - určena k typizaci paraproteinu • imunofixace bílkovin moče - určena k identifikaci paraproteinu, lehkých řetěců kappa a lambda v moči (Bence-Jonesova bílkovina) elektroforetická separace proteinů v gelu a jejich následná imunoprecipitace s monospecifickými antiséry W e s t e r n b l o t i m u n o b l o t princip metodiky 1. fáze • rozdělení séra elektroforézou na gelu 2. fáze • přenos rozdělených antigenů na vhodnou matrici • imobilizace antigenů a zablokování nespecifických vazebných míst • vizualizace antigenů radiograficky, barevnou reakcí, fluorescenčně (specifické protilátky → immunoblotting) • Využití v klinické praxi: • testy na HIV pozitivitu, definitivní test pro BSE, konfirmační test pro hepatitidu B, diagnostika boreliových infekcí elektroforetické dělení bílkovin a jejich následní přenesení na povrch membrány a typizace specifickými protilátkami