NÁVAZNOST METOD KLASICKÉ A MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY vytvořilo CMBG FN Brno zpracovala Mgr. Navaříková [USEMAP] TYPY CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ, kterých se týká vyšetření metodami klasické i molekulární cytogenetiky - VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT – prenatální a postnatální vyšetření konstituční karyotyp - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT (u onkologických onemocnění) vyšetření z kostní dřeně a tkáně solidních tumorů karyotypu maligních klonů [USEMAP] NÁVAZNOST METOD KLASICKÉ A MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY - metodami molekulární cytogenetiky upřesňujeme a potvrzujeme patologické nálezy detekované metodami klasické cytogenetiky - metody molekulární cytogenetiky odhalí velmi malé změny v karyotypu, které nelze detekovat metodami klasické cytogenetiky (nízká rozlišovací schopnost klasických metod) při vyšetřování - vrozených chromosomových abnormalit - získaných chromosomových změn u onkologických pacientů [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY • vykapání suspenze na podložní sklíčka přednáška 090 [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G -pruhování chromosomů • G - pruhování chromosomů přednáška 022 přednáška 065 1 – inkubace preparátu v roztoku trypsinu (natrávení proteinů na povrchu chromosomů) 2 – barvení barvivem Giemsa- Romanowski [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení •chromosomy s G-pruhy hodnotíme ve světelném mikroskopu •zdroj světla - viditelná část spektra (halogenová žárovka) • (stanovení karyotypu) kongo4 přednáška 038 [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení zvětšení 1000x [USEMAP] přednáška 059 METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení •světelný mikroskop •s CCD kamerou •napojený na počítač přednáška 054 přednáška 056 ke třídění chromosomů a sestavení karyotypu lze využít počítačové analýzy obrazu [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení norm mužský obrázek karyotypu = utříděný a zhodnocený soubor chromosomů jedné buňky •karyotyp = soubor chromosomů v somatických buňkách pacienta, který po zhodnocení minimálně 10 mitóz získaných z vyšetřované tkáně charakterizujeme zápisem a doplňujeme karyogramem (obrázkem vytvořeným z nasnímaných chromosomů z jedné mitózy, které jsou utříděné do párů a skupin). Zápis karyotypu pacienta souhrnně vyjadřuje karyotyp všech zhodnocených mitóz v jeho vyšetřované tkáni. V zápisu označujeme počet chromosomů, pohlavní chromosomy a případné patologické změny (zápis karyotypu pacienta, jehož karyogram je vpravo, je 46,XY) •normální lidský karyotyp se skládá ze 46 chromosomů, z toho je 22 párů autosomů (nepohlavních chromosomů) a 2 gonosomy (pohlavní chromosomy) [USEMAP] NÁVAZNOST METOD KLASICKÉ A MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY vyšetření karyotypu a chromosomových aberací metody klasické cytogenetiky – základní vyšetřovací metody v případě postnatálního vyšetření metody molekulární cytogenetiky – speciální metody s vyšší rozlišovací schopností, některé detekují pouze specifické úseky genetického materiálu, jiné vyšetří celý genetický materiál metoda FISH (fluorescenční in situ hybridizace - základní vyšetřovací metoda molekulární cytogenetiky) pracuje s metafázními chromosomy nebo interfázními jádry, potvrzuje a upřesňuje nálezy klasické cytogenetiky [USEMAP] NÁVAZNOST METOD KLASICKÉ A MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY vyšetření karyotypu a chromosomových aberací •molekulárně cytogenetickými technikami nelze nahradit klasické karyotypování, metody se vzájemně doplňují. •při klasickém karyotypování analyzujeme karyotyp jednotlivých buněk jako celek v zorném poli světelného mikroskopu. Tímto vyšetřením odhalíme početní nebo větší strukturní chromosomové přestavby nejen nebalancované, ale i balancované. •následně potvrdíme přítomnost těchto změn metodami molekulární cytogenetiky, které je na místě použít v případě, když máme podezření na konkrétní chromosomovou abnormalitu. Metoda FISH je založena na použití sond na konkrétní oblasti genetického materiálu, proto je třeba vědět, kterou oblast budeme vyšetřovat. Metoda FISH odhalí i menší strukturní změny, které jsou pod rozlišovací schopností metod klasické cytogenetické analýzy. • [USEMAP] NÁVAZNOST METOD KLASICKÉ A MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY • vykapání suspenze na podložní sklíčka pro některá molekulárně cytogenetická vyšetření - FISH přednáška 090 [USEMAP] METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY Princip vazby fluorescenčně značené sondy na chromosomy nebo interfázní jádra na podložním sklíčku sonda značená sonda vazba značené sondy na cílovou DNA (chromosom) [USEMAP] METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY hodnocení •Chromosomy fluorescenčně značené hodnotíme ve fluorescenčním •mikroskopu, zdroj světla - např. rtuťová výbojka – krátkovlnná část spektra; •fluorescenční mikroskop je také součástí systému analýzy obrazu zdroj krátkovlnného vysokoenergetického záření speciální filtry [USEMAP] 1045-03 darkyne METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (preparáty k hodnocení) CEP8 Zemna tel 11 Na chromosomy v mitózách a na chromatin v interfázních jádrech jsou vázány fluorescenčně značené sondy (WCP – celochromosomové sondy, tel – subtelomerické, CEP – centromerické sondy) Vyšetření 1: Vyšetření 2: Vyšetření 3: [USEMAP] VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (VCA) - příklady potvrzení přítomnosti balancované translokace v karyotypu metodou FISH Hitra 1151-06wcp 46,XY,t(5;19)(q15;p12) G-pruhování chromosomů metoda FISH základní vyšetření, při kterém je translokace detekována potvrzení a upřesnění nalezené přestavby (cílené vyšetření konkrétních chromosomů) [USEMAP] VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (VCA) potvrzení přítomnosti delece v karyotypu metodou MLPA • 46,XX,del(5)(p14.1) syndrom Cri du Chat Křížová G-pruhování chromosomů – základní vyšetření [USEMAP] VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (VCA) potvrzení přítomnosti delece v karyotypu metodou MLPA metoda MLPA (metoda molekulární cytogenetiky) – potvrzení nálezu [USEMAP] VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (VCA) strukturní změny – nebalancované aberace mikrodelece (detekce delece menší než je rozlišovací schopnost vyšetření chromosomů s G–pruhy – pomocí metod molekulární cytogenetiky) cílené vyšetření metodami molekulární cytogenetiky – vyšší rozlišovací schopnost (FISH) základní vyšetření metodami klasické cytogenetiky - G-pruhování chromosomů 46,XX normální karyotyp 46,XX !!! nalezena mikrodelece na 22. chromosomu v oblasti 22q11-13 (Di George syndrom – VSV) [USEMAP] • 45,X[1]/46,XX[9] •Při nálezu alespoň 1 patologické mitózy (G – pruhování) •vyšetřujeme metodou FISH z interfázních jader (200 jader). VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (VCA) MOZAICISMUS - gonosomy 46,XX 45,X 3% hraniční patologický nález [USEMAP] VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (VCA) MOZAICISMUS - gonosomy Mozaika X • • vyšetření % zastoupení jednotlivých linií buněk v periferní krvi • pacientky metodou FISH z interfázních jader • (3% zastoupení buněčné linie 45,X) 1 signál (přítomen 1 chromosom X v jádře buňky) 2 signály (přítomny 2 chromosomy X v jádře T-lymfocytu) použita sonda na centromeru chromosomu X [USEMAP] kalab-CYTO kalab-SKY ONKOCYTOGENETIKA komplexní karyotyp 56,XY,der(X)t(X;5),+der(1),add(2),+3,der(4)t(4;?),+6?,+8, +10,der(11),+der(11)t(11;21)?,+der(11),+der(12)t(7;12) qdp(12p),+17,der(18) smíšený germinální tumor analýza složitých a mnohočetných přestaveb u onkologických pacientů s komplexním karyotypem 1) G-pruhování chromosomů 2) SKY [USEMAP] VYUŽITÍ CYTOGENETICKÝCH METOD Vyšetření konstitučního karyotypu – cílem je ověřit, jestli příčina zdravotních potíží pacienta souvisí se změnami v konstitučním karyotypu. Případnou nalezenou změnu co nejpřesněji vyšetřujeme dostupnými metodami a ověřujeme její možný vliv na fenotyp a další zdravotní potíže pacienta srovnáním s literárními údaji. Vrozené chromosomové abnormality přetrvávají v buňkách pacienta po celý život. •Klasická cytogenetika - G-pruhování chromosomů •Molekulární cytogenetika – FISH a metody na principu FISH (M-FISH, mBAND), array-CGH, MLPA •Metody molekulární diagnostiky Vyšetření % aberantních buněk – cílem je vyšetřit míru působení mutagenních faktorů prostředí na člověka. V případě zjištění zvýšené až vysoké expozice mutagenním faktorům existuje možnost léčby (snížení % aberantních buněk na normu). •Klasická cytogenetika – při rutinním vyšetření pouze konvenční barvení chromosomů Vyšetření karyotypu maligních klonů – cílem je zpřesnit diagnózu onemocnění, stanovit prognózu, monitorovat úspěšnost léčby. •Klasická cytogenetika - G-pruhování chromosomů •Molekulární cytogenetika – FISH a metody na principu FISH (M-FISH, mBAND), array-CGH, MLPA •Metody molekulární diagnostiky [USEMAP] •Z 2. fyziologické gravidity, prenatálně UZ i bch screening 1. trimestru v normě, ve 33. t.g. se dle UZ plod jevil menší. •Porod císařským řezem ve 35. t.g. kvůli oční indikaci matky,p.h. 1850g/44 cm, obvod hlavy 30 cm, AS 6-7-7 •Po porodu prematuritas, hypotrophia, adaptace v inkubátoru *Kazuistika 1 – dívka narozená 2010 [USEMAP] Fenotyp probandky •Mikrocefalie, níže posazené ušní boltce •Lehce sešikmené oční štěrbiny • • Na HKK krátký malíček, úzké dlaně, atypické křížení prstů • Na DKK úzké plosky, delší 2. prst, pedes plani • •Nižší svalový tonus trupový i končetinový, centrální hypotonie • •Lehká mentální retardace •Retardace expresivní složky řeči, komunikuje převážně jednoduchými větami, odpovídá na otázky jednoslovně, řeč obtížněji srozumitelná. •Pasivní slovní zásoba převažuje nad aktivní. •Retardace jemné i hrubé motoriky, menší obratnost • •Vadné držení těla se zhoršením při zrychlení růstu, skolióza, nosí korzet, •Chůze s narušenou stabilitou •Pohybová stereotypie – třepe ručkama • •Z rozhodnutí rodičů chodí do logopedické třídy běžné MŠ s asistentem [USEMAP] Vyšetření karyotypu probandky 46,XX,der(12) karyotyp rodičů normální [USEMAP] „C“ barvení Nalezen heterochromatinový pruh na der(12) – centromera? der(12) [USEMAP] Potvrzena - translokace chromosomů 12 a 18 - trisomie části chromosomu 18 včetně centromery - delece koncové oblasti p ramen chromosomu 12 Vyšetření FISH Typ DNA sondy: StarFISH WCP 18 SO Probe, Vysis ToTel 12p SG, 12q SO, CEP 18 aqua ISCN: ish der(12)t(12;18)(wcp18+,D18Z1+,tel 12p-, tel 12q+)[10] [USEMAP] delece12p13.31-p13.33 velikost 5,23Mb duplikace18p11.21-p11.32 velikost 14,83 Mb DNA mikročip: SurePrint G3 Human CGH Microarray 4X180K (výrobce Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) array-CGH nálezu delece části krátkých ramének chromosomu 12 a duplikace krátkých ramének chromosomu 18 v karyotypu pacientky delece koncového úseku 12p duplikace 18p [USEMAP] 46,XX,der(12)t(12;18)(18pter 18p11.?1::12p13.?3 12qter)dn 12 der(12) 18 Konec chromosomu nad šipkou je tvořen nadbytečným genetickým materiálem z chromosomu 18 Postižené chromosomy detekované pomocí G-pruhování chromosomů Pod šipkou se jedná o genetický materiál chromosomu 12, ale chybí koncová část krátkých ramének chromosomu Normální chromosom 12 Chromosom 12 s nadbytečným genetickým materiálem Normální chromosomy 18 [USEMAP] ISCN zápis karyotypu 46,XX,der(12)t(12;18)(p13.?3;p11.?1)dn.ish der(12)t(12;18) (wcp18+,D18Z1+,tel 12p-,tel12q+).arr[GRCh37] 12p13.33p13.31 (194249_5421087)x1,18p11.32q11.21(118760_14951330)x3 [USEMAP] Geny v duplikované oblasti chr. 18 •OMIM geny v oblasti duplikace 18p11.21-p11.32: 54 • •OMIM geny v oblasti duplikace 18p11.21-p11.32 spojené s patologickými fenotypy: 10 • SMCHD1, LPIN2, TGIF, LAMA1, NDUFV2, APCDD1, PIEZ02, GNAL, • AFG3L2, MC2R • [USEMAP] Databáze DECIPHER - Pacienti se stejnou či podobnou duplikací 18p11.21-p11.32 1) Pacient č. 283077 s podobnou duplikací (14,59 Mb) jako u naší probandky. Fenotyp pacienta: středně závažná mentální retardace. Není uveden fenotyp rodičů, způsob dědičnosti chromosomové abnormality ani její kauzalita. 2) Pacient č. 250261 s podobnou duplikací (14 Mb) jako u naší probandky. Současně byla u tohoto pacienta detekována duplikace 22q13.33 (457 Kb). Fenotyp pacienta: syndaktylie 2-3 prstu, abnormální tvar nostril, zúžení aorty, defekt síňového septa, problémy s příjmem potravy v dětství, nízce posazené uši, abnormality křížové oblasti páteře (sacral dimple), malá postava [USEMAP] Geny v deletované oblasti chr. 12 •OMIM geny v oblasti delece 12p13.31-p13.33: 37 • •OMIM geny v oblasti delece 12p13.31-p13.33 spojené s patologickými fenotypy: 8 • WNK1, CACNA2D4, CACNA1C, CCND2, FGF23, NDUFA9, KCNA1, KCNA5 • •Databáze DECIPHER [USEMAP] •Uvažuje se o variabilním a nejasném fenotypu •Mikrocefalie •Faciální dysmorfie – malá mandibula, dentální anomálie, plazí jazyk, dlouhé uši, anomálie prstů •Vývojová a růstová retardace •Mentální retardace • Monosomie 12pter – údaje z literatury [USEMAP] •Kontakt pro dotazy: Navarikova.Marta@fnbrno.cz