ONKOGENETIKA „Původ, evoluce a léčba nádorů“ Doc. Mgr. Martin Trbušek, Ph.D. Interní hematologická a onkologická klinika, FN Brno Lékařská fakulta MU RAKOVINA: definice a základní klasifikace RAKOVINA představuje abnormální růst buněk ve tkáni s následným šířením po těle při vytváření metastáz Základní dělení je odvozeno od buňky (resp. tkáně) původu: Karcinomy jsou odvozeny z epiteliální tkáně – např. nádory prsu, plic, střeva nebo pankreatu Sarkomy mají svůj původ v mezenchymálních buňkách (pojivová tkáň) – např. nádory kostí (osteosarkomy) Nádory krevních buněk a hematopoietického systému – leukémie a lymfomy Nádory zárodečných buněk – např. ovariální karcinom nebo seminom Somatic mutation theory (SMT) vs. Tissue organization field theory (TOFT) Sonnenschein and Soto, Progress Biophys Mol Biol, 2016 Šmardová and Koptíková, Klinická onkologie 2016 Původ nádorů: koncepční teorie SMT: Základní nastavení buňky je klidové stádium a rakovina představuje „únik“ z tohoto stavu. Maligní buňka vykazuje – díky svým genetickým změnám - selektivní výhodu růstu oproti zdravému protějšku. TOFT: Základní nastavení buňky je nekonečná proliferace (blbost?....možná ne……) Jsou to naše tkáně, kdo drží buňky pod kontrolou (v klidu) a jejich dezorganizace vede k „obnově“ buněčného dělení Dědičné nádory (včetně zárodečných nádorových syndromů) 5-10% všech případů rakoviny Např. syndrom Li-Fraumeni asociovaný s mutacemi v TP53 nebo xeroderma pigmentosum zahrnující mutace v genech pro opravu DNA Sporadické nádory – zbytek, původ v somatické tkáni Genetické defekty jsou příčinou v obou případech; Navíc, 15-20% nádorových onemocnění zahrnuje infekční agens např. vysoce rizikové HPVs u karcinomu děložního čípku Původ rakoviny: role přímé dědičnosti (Specifická) etiologie dětských leukémií Greaves, Nat Rev Cancer 2016 https://media.springernature.com/m685/nature-assets/nrc/journal/v6/n3/images/nrc1816-f1.jpg Analýza „Guthriho kartiček“ nebo pupečníkové krve …u jednovaječných dvojčat Příspěvek leukémií a lymfomů k SMT Greaves , Nat Rev Cancer 2016 Leukémie a lymfomy představují ˂ 10% všech nádorových onemocnění L a L: typické aberace umožňují molekulární klasifikaci •Nádory krve mají povětšinou své jasné „spolupachatele“ •Typické translokace •Chronická myeloidní leukémie; t(9;22) BCR-ABL •Lymfom z buněk plášťové zóny; t(11;14) Cyclin D1/IgH •Folikulární lymfom; t(14;18) Bcl-2/IgH •Burkittův lymfom; t(8;14) c-Myc/IgH • •… nebo jiné charakteristické aberace •Chronická lymfocytární leukémie; del 13q, del 11q, del 17p, +12 • Základní „schopnosti“ nádorových buněk Hanahann and Weinberg, Cell, 2001 Další definované znaky nádorových buněk Hanahann and Weinberg, Cell, 2011 Role nádorových kmenových buněk (CSC) při vzniku tumoru a jeho progresi Lidské tělo obsahuje ~1014 buněk ~1011 buněk je každý den obnoveno (SC) Pouze část nádorových buněk (CSC) je schopna vytvořit autonomní nádor, tedy „nekonečně“ proliferovat Adopted from Batlle and Clevers Nature Med, 2017 Buněčný původ nádorů vs. terapie Nádory pocházejí z kmenových nebo progenitorových buněk, jejichž vývoj je pozměněn směrem od terminální diferenciace k jejich prosté sebeobnově Tento fenomén výrazně narušuje úspěšnost terapie skrze přítomnost tzv. minimální zbytkové choroby, která je příčinou následného relapsu s proliferací rezistentních klonů. mutTP53 mutTP53 wtTP53 wtTP53 BEFORE THERAPY IN RELAPSE • Klonální evoluce a „úzké hrdlo“ terapie: •případ AML Ding et al.,Nature 2012 Genové mutace jako základní rys rakoviny Výsledek obrázku pro sanger sequencing gel Klasická PAGE Značení 35S Výsledek obrázku pro frederick sanger Frederick Sanger University of Cambridge Stratton et al., Nature 2009 (Dech beroucí) technologický pokrok v sekvenování DNA Simon et al., Nat Rev Drug Discovery 2013 Současnost: „uživatelsky-orientované“ NGS Genom Exom Amplikon Transkriptom •SNV = single nucleotide variants (mutace/SNP) •CNV = copy number variation (inzerce/delece) •strukturní aberace (translokace/inverze) •genová exprese (mRNA) •epigenetika (metylované oblasti) •interakce DNA-protein •analýza technologie CRISPR • • Využití NGS mimo přímé sekvenování Celogenomová analýza (WGS) nádorů z různých tkání „Driver“ mutace vs. „Passenger“ mutace „Driver“ geny: ~125 71 TS/54 ONC PRINCIPY DARWINOVSKÉ SELEKCE Vysoce variabilní počet mutací Celogenomové sekv. od ~ $10.000 (výzkum od $4.000) Využívá se nejčastěji k identifikaci nových nebo vzácných mutací, chromozomálních přestaveb, pro nalezení nových potenciálně terapeutických cílů Exomové sekvenování •WES = whole exome sequencing •Sekvenování kódujících oblastí = exom (asi 1 % genomu) •Efektivnějsí než WGS: rychlost, cena, vyšší pokrytí Celoexomové sekvenování a mutace: příklad CLL Nejčastěji mutované geny: SF3B1, ATM, TP53 Landau et al., Nature 2015 Cílené sekvenování •Targeted sequencing •Princip: PCR amplifikace nebo využití cílených sond •Identifikace mutačních variant pod detekčním limitem Sangerova sekv. • (až 1% při vysokém pokrytí – tzv. ultra-deep NGS) •Výhodné pro sledování klonální evoluce nádorů •Výhody oproti WGS / WES: rychlost, cena, méně prostoru pro skladování dat •Pro sekvenování velkého počtu vzorků (screening) nebo validaci genetických variant v populaci Count Coverage Frequency Gene_function RefGene Exon_number cDNA Codon 1752 1752 100 exonic ATM exon40 c.5948A>G p.N1983S 2261 2452 92,21 exonic ATM exon22 c.3161C>G p.P1054R 690 2962 23,3 exonic ATM exon50 c.7311C>A p.Y2437X 100 1203 8,31 exonic ATM exon24 c.3433_3435del p.1145_1145del 74 1433 5,16 exonic ATM exon30 c.4578C>T p.P1526P 46 1281 3,59 exonic ATM exon43 c.6258T>A p.Y2086X 243 8231 2,95 splicing ATM exon19 c.2921+1G>A p.P962Q 19 699 2,72 exonic ATM exon25 c.3705_3709del p.P1235fs 25 1087 2,3 exonic ATM exon5 c.480delT p.S160fs 24 1046 2,29 exonic ATM exon5 c.483G>C p.Q161H 67 3357 2 exonic ATM exon26 c.3837G>A p.W1279X 73 5626 1,3 exonic ATM exon26 c.3952_3960del p.1318_1320del 64 5151 1,24 exonic ATM exon49 c.7181C>T p.S2394L 11 904 1,22 exonic ATM exon63 c.9022C>T p.R3008C 42 3514 1,2 exonic ATM exon10 c.1402_1403del p.K468fs Cílené NGS: intraklonální heterogenita nádorové populace Další modifikace nádorového genomu •Epigenetické umlčení tumor-supresorových genů (metylace promotorů) •Globální (celogenomová) hypometylace Výsledek obrázku pro bisulfite sequencing Bisulfitová konverze + NGS: •konverze C ®U, Met-C se nemění •přesná identifikace jednotlivých metylovaných bazí 12 biochemických drah narušených u nádorových buněk Interpretace WGS 99.9% všech identifikovaných změn neposkytuje žádnou selekční výhodu Mutabilita lidského genomu je normální. Nicméně normální je také to, že se tělo dokáže zbavit narušených buněk pomocí kontinuálně probíhající apoptózy…. Celogenomové sekv. od ~ $10.000 (výzkum od $4.000) Využívá se nejčastěji k identifikaci nových nebo vzácných mutací, chromozomálních přestaveb, pro nalezení nových potenciálně terapeutických cílů Model vzniku a progrese nádorů Bartkova et al., Nature 2005 Interference s replikací DNA rezultuje v indukci apoptózy nádorových buněk Štěpené proteiny PARP a Kaspáza-3 dokládají přítomnost pokročilé apoptózy, vzniklé jako následek inhibice proteinu Chk1; buňky: MEC-1, CLL s TP53-mutací C:\Users\3755\Downloads\MEC-1 48h EN1, ATRi vše.jpg •Fyzická destrukce buňky • • • • • • • •Eliminace „odpadu“ (recyklace) Apoptóza: „optimální buněčná smrt“ v protinádorové terapii Kerr et al., Br J Cancer 1972 Objevení proteinu p53: milník onkologického výzkumu David P. Lane Imperial Cancer Research Fund, London Arnold J. Levine Princeton University, New Jersey Lloyd John Old Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York Oznámeno v roce 1979, interakce s T-antigenem viru SV40 http://www.a-star.edu.sg/portals/2/people/David_Lane.jpg http://www.sns.ias.edu/~alevine/PR-Levine.jpg https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/3/3d/Lloyd_J._Old%2C_M.D.%2C_c._1995.jpg/220px -Lloyd_J._Old%2C_M.D.%2C_c._1995.jpg Výzkum p53 z historické perspektivy Eliyahu D et al. Participation of p53 cellular tumour antigen in transformation of normal embryonic cells. Nature 1984; 312: 646-9. Parada LF et al. Cooperation between gene encoding p53 tumour antigen and ras in cellular transformation. Nature 1984; 312: 649-51. Jenkins JR et al. Cellular immortalization by a cDNA clone encoding the transformation-associated phosphoprotein p53. Nature 1984; 312: 651-4. Onkogen nebo nádorový-supresor? Dopad narušení genu TP53 na rozvoj nádorů Donehower et al., Nature 1992 Adopted from: IARC TP53 database •Sloni mají velmi nízkou incidenci rakoviny (paradox „Peto“) • •A to (mimo jiné) díky ~20 kopiím genu TP53 poškození DNA hypoxie úbytek ribonukleotidů zkrácení telomer atd. Kontrolní body buněčného cyklu p21WAF 14-3-3s Gadd 45 Apoptóza PUMA NOXA Bax KILLER/DR5 p53AIP1 Fas/Apo1/ CD95 PIGs Senescence p21WAF Inhibice patologické angiogeneze Tsp1 BAI1 Maspin GD-AIF p14ARF ? p53 MDM2 ATM ATR DNA PK aktivace onkogenů Oprava DNA Gadd45 p53R2 ubiquitinace a degradace p53 ? posttranslační modifikace p53 a MDM2 aktivace a stabilizace p53 Podrobněji k dráze p53: poškozeni (…) - signalizováno dalšími proteiny - modifikace p53, aktivace a stabilizace. Aktivovaný p53¨- aktivace transkripce genů zahrnutých v… i represe a protein-protein interakce Přísná regulace hladiny p53 v normální buňce - přes MDM2. p53 - tr. faktor, funguje jako tetramer, 393 aminokyselin, 50 kDa • • • • • • •DNA Rakovina z pohledu buněčného cyklu G1 → S → G2 → M G1/S S G2/M Univerzální inaktivace Ztráta p53, Rb, p16 a jiné. Kontrolní body (checkpoints) Schopnost pokračovat v buněčném dělení Analýza genu TP53 u pacientů s CLL ve FN Brno Del(17p): I-FISH Mutace TP53: kvasinková funkční analýza FASAY Wt Mut 17p- Defekty TP53 narušují léčebnou odpověď Malcikova J et al., Blood 2009 Test buněčné viability in vitro Ošetření FLU 48 h Poškození DNA navozuje p53-závislou odpověď Real time PCR, ošetření 24 h Herndon et al., Leukemia 2017 akumulace 2H2O v leukemických buňkách lokalizovaných v LU Defekty TP53 podporují buněčnou proliferaci Mutace p53 asociují s horším přežitím pacientů s CLL A: wt-p53/mut-IgVH MS: not reached B: mut-p53/mut-IgVH MS: not reached C: wt-p53/unmut-IgVH MS: 69 months D: mut-p53/unmut IgVH MS: 23 months (A)vs. (B) P=0.016 (B)vs. (D) P=0.018 (C)vs. (D) P<0.001 (A) vs.(C) P<0.001 Note: survival assessed from time of p53 defect identification / investigation showing wt-p53 Individuální mutace p53 se liší ve svém dopadu Fig. A: all mutations Fig. B: mutation + del(17p) A: wt-p53 MS: 69 months B: nonmissense p53 mutations MS: 36 months C: p53 missense out of DBMs MS: 41 months D: p53 missense in DBMs MS: 12 months (D) vs. (C) P=0.009 (D) vs. (B) P=0.002 Trbusek et al., J Clin Oncol 2011 Prognostický význam mutací TP53 dle typu nádoru Adopted from: Robles AI, Harris CC: Clinical outcomes and correlates of TP53 mutations and cancer. Cold Spring Harb Perspect Biol 2010; 2: a001016 Aktivace p53: přerušení interakce s MDM2 Adopted from: IARC TP53 database Dopad defektů ATM na aktivaci p53 Liché sloupce: kontrola Sudé sloupce: IR (5Gy) 1,2 – wt 3,4 – sole 11q- 5,6 – ATM-mut-1 7,8 – ATM-mut-2 Navrkalova et al., Haematologica 2013 Onkogeny: stimulace buněčné proliferace CLL pacienti WB c-Myc Typicky TFs Kooperace ONK/TS Léčba rakoviny •Chirurgie (primární místo, lokalizované matastázy) •Lokální radioterapie • Systémové terapie •(Kombinovaná) chemoterapie; celotělové ozáření • •Transplantace kmenových buněk (hematopoi. i solidní nádory) • •Imunoterapie , včetně „CAR T-lymfocytů“ • •„Diferenciační“ terapie (např. ATRA u A-PML) • •Použití monoklonálních protilátek • •Cílená terapie (nízkomolekulární inhibitory) Pokroky v léčbě nádorů •Uspokojivé výsledky • •Chronická myeloidní leukémie • •Některé dětské leukémie (e.g. ALL, ETV6-RUNX1-positive) • •Hodgkinův lymfom • •Testikulární nádor u mladých mužů Příznivé genetické aspekty: Ø„Hallmark“ abnormalita, nízká genomická instabilita ØNízký tlak na inaktivaci tumor-supresorového genu TP53 Pokroky v léčbě nádorů •Neuspokojivé výsledky • •Maligní melanom (metastatická varianta, OS ˂10% po 5 letech) • •TP53-mut chronická lymfocytární leukémie (medián OS ~3 roky) • •Cervikální karcinom (vysoce-rizikové HPVs, přímá inaktivace p53) Nepříznivé genetické aspekty: ØGenetická heterogenita nádorové populace ØInaktivace genů reagujících na terapeutickou intervenci v rámci dráhy „DNA-damage response“ (DDR) Ideální cíl (s využitím NGS): personalizovaná léčba Guan et al., Chin J Cancer 2012 Integrace omických dat: U daného pacienta je osekvenován nádorový a zdravý genom. Genetická informace je analyzována a interpretována multidisciplinárními experty. Pacientovi je navržena léčba „šitá na míru“. Z analýzy profi tuje také pacientova rodina, protože se zjistí i hereditární riziko vzniku nádorového onemocnění a mohou být provedena příslušná opatření Terapie využívající monoklonální protilátky Výsledek obrázku pro ofatumumab mechanism of action •Cílí na povrchový epitop nád. buňky (specificita vs.efektivita) •1. mAb v klinice: rituximab, 1997 • •Dostupné také pro solidní nádory (např. trastuzumab u c. prsu) •Komplexní mechanismy účinku (CDC, ADCC, apoptóza) Eliminace nádorových buněk pomocí malých molekul Adopted from: Vogelstein B et al. Cancer Genome Landscapes. Science 2013;339:1546-58. Co lze ovlivnit prostřednictvím nízkomolekulárních látek: ØKinázy: “snadná“ inhibice enzymatické aktivity Většina klinicky schválených molekul blokuje kinázy ØOnkogeny: pouze malá část z nich vykazuje enzymatickou aktivitu Většina onkogenů má mnohočetné interakce ØNádorové supresory: jejich náhrada je velmi obtížná Možností je zacílit komplementární dráhu a defekt prohloubit (ztráta BRCA → závislost na aktivitě PARP-1). Olaparib. Ø Syntetická letalita v rámci „DNA-damage response“ Adopted from: Fang B, J Med Chem 2014 Specifické cílení (inhibice) může vést k diametrálně odlišným výsledkům Mutace V600E v proteinu BRAF je přítomna u maligního melanomu (MM) stejně jako u metastatického kolorektálního karcinomu (CRC) Nicméně, specifický inhibitor BRAF-signalizace (Vemurafenib) je vysoce účinný u MM, ale nikoli u CRC Důvodem je aktivace dráhy PI3K/AKT u CRC, která eliminuje efekt inhibice Současné možnosti cílené léčby Souhrn •Rakovina je „onemocnění genů“, bez ohledu na přítomnost či absenci dědičné predispozice •Genetické pozadí různých typů nádorů vykazuje některé společné znaky, ale celková variabilita je obrovská a vyžaduje „the cancer-specific approach“ • •Hlavní překážkou efektivní terapie představují u mnoha nádorových onemocnění defekty v genu TP53 (nebo obecně p53 dráhy) •Technologické pokroky v analýze nádorových buněk jsou enormní (např. NGS), nicméně interpretace dat je někdy (často?) obtížná a nejasná •Molekulární terapie pravděpodobně směřuje k „pacient-specifickému koktailu“ několika léků s doplňujícími se mechanismy účinky (žádná „jedna pilulka“ na obzoru…..) DÍKY ZA POZORNOST! m.trbusek@volny.cz