Poruchy hemostázy Primární a sekundární hemostáza Primární (agregace a aktivace destiček) - Tvorba hemostatické zátky z trombocytů a jejich aktivace - Součástí je uvolnění vazokonstrikčních molekul - Význam zejm. při zástavě krvácení z kapilár, arteriol a venul • Sekundární (koagulace) - Série reakcí koagulačních faktorů, které končí vznikem fibrinu - Význam zejm. pro velké cévy a pro zabránění protrahovaného krvácení - In vitro lze primární a sekundární hemostázu vyšetřovat odděleně - In vivo probíhají v těsné vazbě Funkce trombocytů během hemostázy Adheze k poškozenému endotelu Skladování a uvolňování ADP a proteinů Agregace s jinými trombocyty Povrch pro koagulační reakce Aktivace trombocytu - postreceptorová kaskáda • Nejčastěji aktivace fosfolipázy C -> štěpení PIP2 na IP3 a DAG • Uvolnění Ca2+ z endoplasmatického retikula • Některé receptory (P2X) jsou spřaženy s membránovými kanály pro Ca • ^Ca2+v cytoplasmě • Ca2+ pochází z endoplasmatického retikula i extracelulárního prostoru Inhibice aktivace trombocytu Indukována l^cAMP nebo l^cGMP Ty aktivují specifické proteinkinázy (PKA a PKG) PKA podporuje přesun Ca2+ z cytoplasmy do mikrosomů a do extracelulárního prostoru PKA i PKG také inhibují uvolnění Ca2+ z endoplasmatického retikula (mediované IP3) cAMP a cGMP jsou tvořeny cyklázami a odbourávány fosfodiesterázami Aktivátory a inhibitory adenylylcyklázy • Aktivátory (tj. antiagregační) - Prostaglandiny D2, 12 - Adenosin • Inhibitory (tj. proagregační) - Prostaglandin E2 - Katecholaminy (cestou a2 receptorů) - ADP Aktivovaný trombocyt Zvýšení koncentrace Ca2+ vede ke změně tvaru a degranulaci trombocytů V granulech jsou uskladněny trombogenní molekuly, jako ADP nebo trombin Dále je pomocí obou izoforem cyklooxygenázy syntetizován TXA2 (destičkový aktivátor a silný vasokonstriktor) Ca2+ také působí změnu konformace glykoproteinu llb/llla (nejčetnější receptor na povrchu destiček) do aktivovaného stavu Aktivovaný trombocyt na povrchu vystavuje negativně nabitý fosfatidylserin, a tím spouští koagulační kaskádu BREAK IN BLOODVESSEL coagulation rxns collagen thrombin — fibrinogen fibrin TXA2 f ADP ADP TXA2 thrombin g|ycoprotein llb/llla VWF growth factors etc Nespecfické: doba krvácení (in vivo) Počet trombocytů v |il krve Měření průchodu světla (LTA) vs. měření impedance Měří se buď maximální rychlost agregace destiček, nebo integrál křivky za 1 minutu (čím víc, tím rychlejší agregace) po přidání činidla - kyselina arachidonová - ADP - agonista trombinového receptoru - agonista Gplb - kolagen • Může být spuštěna v zásadě 2 mechanismy: 1) Tkáňový faktor („vnější dráha") 2) Kontakt s negativně nabitým povrchem („vnitřní dráha") tyto dráhy jsou dobře definovány in vitro, ale ne in vivo (mají tedy spíše diagnostický než fyziologický význam) Reaktantya katalyzátory koagulačních reakcí Většina koagulačních reakcí má následující složky složky: 1) Aktivovaný enzym - serinová proteáza (Na, Vila, IXa, Xa, Xla, protein C, plasmin, tPA) 2) Kofaktor - přikládá k sobě enzym se substrátem (TF, Va, Vlila, protein S, TM, fibrin) 3) Ca2+ 4) Záporně nabitý povrch (urychluje reakci zvýšením koncentrace reaktantů) 5) Substrát (jiný faktor) Výjimkou je trombin - pro většinu reakcí nepotřebuje kofaktor Koagulační kaskáda in vitro Contact activation (intrinsic) pathway Damaged surface 1 Tissue factor (extrinsic) pathway .. TFPI XII Xlla IX X Prothrombin (ID „ Vila VIII Tissue factor <-Trauma Xa I........................Antithrombin X Va Thrombin (Ha) Common pathway Fibrinogen (I) Fibrín (Iq) Active Protein C A Protein 5 XHIa XIII Protein C + thrombomodulin Cross-linked fibrin clot Ale: kontaktní systém není pro koagulaci nezbytný (ovšem koagulační faktory vnitřní cesty počínaje XI ano) Faktor XII má ambivalentní funkci -zároveň aktivací plasminu podporuje fibrinolýzu Kontaktní systém (HMWK, faktor XII) se také uplatňuje během zánětu Koagulační faktory jsou obvykle serinové proteázy nebo jejich kofaktory Současný model in vivo (iniciace kaskády) TF + Vila I IXa + Vlila Antithrombin Tissue factor -pathway inhibitor (TFPI) H Xa + Va Y Protein system ■ IIa (Thrombin) Fibrinogen ľ Fibrin Role faktoru VIII, IX a XI (amplifikační/propagační fáze) Hemostatic and Fibrinolytic Pathways x x Xla/Plp|elcts IX a ľ fr/VI hi f F PI Villa lAPCß) t Platelet activation \ Fibrin TAFt plúStFlílI ri2-a/ttipiíi.vNin hťpariti-iwfíirtor tí rAi-í Fibrinogen Tkáňový faktor (TF, faktor III) • Membránový protein vyskytující se na membránách všech buněk mimo endotelu a cirkulujících krvinek • Za fyziologických podmínek se tak TF nedostává do kontaktu s ■ koagulační kaskádou • Při poškození cévní výstelky (trauma, bakteriální toxiny...) dochází ke kontaktu faktoru TF s faktorem VII a spuštění koagulační kaskády • Ke spuštění je nutný aktivovaný faktor Vila (v malém množství v cirkulaci), který v komplexu s TF katalyzuje aktivaci dalších komplexů TF-VII • Tromboplastin = TF + fosfolipidy; parciální tromboplastin = jen fosfolipidy K-dependentní faktory a vazba Ca2+ Faktory II, VII, IX, X a protein C mají na svém N konci zbytek kyseliny gama-karboxyglutamové (Gla) Ten vzniká z glutamátu působením vitaminu K Gla domény působí jako cheláty a vážou Ca2+ Vážou se tak na záporně nabité fosfolipidové membrány a mění konformaci proteinů f\f\f\. i0 prolUromtiin -ooc COO- Prolhrombrn vWF zodpovídá za adhezi trombocytů Vedle toho je i plasmatickým nosičem faktoru VIII, který je bez něho rychle degradován subendůi helium ADAMTS 13 - proteáza štěpící multimery vWF I FIBRIN ř FIBRINOGEN CXI« XIHa N i «SEfc*. r-THROMBIN - / PAR-1 & -4 GPV PROTEOLYSIS-AUAMT513 I INHIBITION FIBRINOGEN — FIBRIN FXIU — FXIIIa FV -» FVa FVIII FVIIIa FX1 — FXIa TAFI TAFIa ANTICOAGULANT ACTIONS / Villa PC APC ATI II —► TAT HCII 'III \ Jř \ Fllal^ I © FEEDBACK LOOPS <-4 I VASCULAR DAMA i[ TF EXPOSURE ON Legenda: TAFI - thrombin activatable fibrinolysis inhibitor PC - protein C APC - aktivovaný PC ATIII -antitrombin III TAT - komplex trombin-ATIII HCII - heparin kofaktor II MONONUCLEAR CELL COLLAGEN MB CLOT i-f&i ACTIVATED PLATELETS THROMBOMODULIN Hlavní funkcí faktoru XI je pozitivní zpětná vazba při produkci trombinu (koagulace se udržuje i poté, co dojde TF - fáze propagace) Polymerizace fibrínu Trombin umožňuje polymerizaci cirkulujícího fibrinogenu do fibrinových vláken odštěpením terminálních fibrinopeptidů A a B (vzniklé monomery fibrinu pak za přítomnosti Ca2+ spontánně polymerizují ve fibrinové vlákno) Ke tvorbě příčných můstků je třeba aktivovaného faktoru XIII (aktivován trombinem) Thrombin ^-^9 Fibrinogen FpA + FpB Soluble Fibrin Polymer — e E - E ## E E — E —#}©— E - ce koagulace TFPI produkován endotelem tvoří komplex faktorem Xa, ten je tak inhibován komplex reaguje s komplexem TF-Vlla, což zastaví tvorbu faktoru IXa a Xa touto cestou (pokračuje smyčka přes faktor XI) Protein C s kofaktorem proteinem S váže se na faktory Va a Vlila, které štěpí a deaktivuje protein C je aktivován za přispění trombomodulinu (TM, produkován endotelem) protein S je v plazmě volný nebo vázaný na transportní protein C4B poměr mezi volným a vázaným proteinem S (normálně cca 40%) je citlivým regulátorem koagulace Antitrombin III inaktivuje všechny serinové proteázy koagulační kaskády jeho účinek je výrazně zesílen polysacharidy heparanem a heparinem (endogenním nebo exogenním) Heparin a příbuzné molekuly jsou inhibovány destičkovým faktorem 4 (PF4), uvolňovaným z aktivovaných trombocytů 53 Zajišťována plazminem - serinová proteáza - V cirkulaci ve formě neaktivního. plazminogenu - Po konverzi na plazmin štěpí fibrin na degradační produkty fibrínu (FDP) - Diagnosticky jsou z nich nejdůležitější D-dimery Plazminogen je aktivován tkáňovým aktivátorem plazminogenu (tPA) - secernován endotelem, anebo urokinázou (UK, uPA) - secernována epitelem Plazmin je přítomen v krevní sraženině ve vazbě na fibrin Molekula plazminu Plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) - inhibuje tPA a2-antiplazmin - štěpí volný plazmin - ale ne vázaný na fibrin Během fibrinolýzy se uplatňuje plazmin vázaný v krevní sraženině a tPA z blízkých endoteliálních buněk V případě úniku plazminu nebo tPA do cirkulace jsou tyto rychle inaktivovány PAI-1 a a2-antiplazminem - Fibrinolýza tak zůstává omezena na sraženinu t-PA u-PA scu-PA Products Vyšetření koagulační kaskády PT - protrombinový čas [s] - do dekalcifikované plasmy je přidán TF (faktor III) a Ca - měří funkci vnější cesty (monitorace účinku warfarinu) - je znám také jako Quickův test aPTT - aktivovaný parciální tromboplastinový čas [s] — přídavkem Ca, kaolinu a kefalinu (fosfolipid) je aktivován faktor XII - měří funkci vnitřní cesty (monitorace účinku heparinu) • TT - trombinový čas [s] — přídavkem trombinu a Ca je aktivován fibrinogen — měří konverzi fibrinogenu na fibrin Pozn.: PT se někdy vyjadřuje jako tzv. international normalized ratio (INR), bezrozměrné, norma je 1 a PTX PT, Extrinsic VIII APTT r Final i Common *C Pathway V X II Fibrinogen i Fibrin clot 1) preparace v. jugularis - aplikace 2ml hypotonického roztoku 2) laparotomie - ligatura v. cava caud. 3) torakotomie - punkce srdeční komory - odběr 4) excise podvázaného segmentu 1) preparace v. jugularis - aplikace 2ml hypotonického roztoku 2) laparotomie - ligatura v. cava caud 3) torakotomie - punkce srdeční komory - odběr 4) excise podvázaného segmentu 1) váha trombu 2) aPTT Poruchy hemostázy • Hypokoagulační stavy — Poruchy primárni hemostázy — Poruchy sekundárni hemostázy (koagulopatie) — Smíšené poruchy • Hyperkoagulační stavy (trombofilie) • Kombinované (TTP, DIC) ■ Poruchy primární hemostázy • Buď poruchy na úrovni cévní stěny (vaskulopatie), nebo trombocytů (trombocytopatie/trombocytopenie) • Hlavní klinickou manifestací jsou petechie • Typicky prodloužený čas krvácení (ale málo specifické) • Často také epistaxe, hematurie, menorrhagie, krvácení z dásní či do GIT Vaskulopatie vrozené • telengiectasia hereditaria (m. Rendu-Osler) - AD, oslabení úseků stěny cév -> teleangiektázie (kůže, sliznice, plíce, urogenitální trakt) • Ehlers-Danlos a Marfanův syndrom - defekt struktury pojiva (kolagen) • m. Kasabach-Merrit ■ - Cévní malformace se stagnací krve -? DIC získané • senilní purpura • bakteriální toxiny (spála, spalničky) • karence vit. C (scorbut) • imunokomplexy (Henoch-Schónleinova purpura) Trombocytopenie Normální koncentrace trombocytů je cca 150 000-450 OOO/iil Klinicky manifestní je trombocytopenie až pod cca 50 000/|il Pod 20 000/|il spontánní krvácení Příčiny: 1) Porucha produkce (aplázie, myelodysplázie -> myelofibróza) 2) Zvýšená konzumpce (TTP/HUS, DIC) 3) Destrukce imunitním systémem (ITP, systémové autoimunitní choroby, lékově navozená trombocytopenie) 4) Porucha distribuce (hypersplenismus) Trombotická trombocytopenická purpura (TTP) • Součást spektra trombotických mikroangiopatií (spolu s hemolyticko uremickým syndromem, HELLP syndromem v těhotenství a polékovým HUS) • Společným rysem jsou trombotické okluze malých cév s následnou trombocytopenií a hemolytickou anémií • Patogeneze nejasná • U klasické TTP se předpokládá vliv velkých multimerů vWF, které mohou spustit agregaci bez předchozí vazby na kolagen • Multimery vWF jsou normálně štěpeny proteázou ADAMTS13 • Pacienti s klasickou formou TTP mají proti ADAMTS13 autoprotilátky Trombocytopatie Vrozené: porucha adheze a agregace • Bernard-Soulierův syndrom (porucha receptoru GP Ib) • Glanzmannova trombastenie (porucha receptoru GP llb-llla) porucha degranulace • Heřmanského-Pudlákův syndrom • Chédiak-Higashiho syndrom Získané: paraproteinémie (Ig mohou inhibovat vazbu fibrinogenu na trombocyty) selhání ledvin (akumulace kys. guanidinjantarové a fenolů) dysfunkce při myeloproliferaci lékově navozená trombocytopatie (což je obvykle účel léčby) • Nedostatek nebo špatná funkce vWF v plazmě • Porucha primární i sekundární hemostázy • Několik typů: - Typ 1 - nedostatek cirkulujícího vWF - Typ 2 - porucha funkce vWF • různé podtypy • u typu 2N chybí vazebné místo pro fVIII, tedy manifestace jako hemofílie - Typ 3 - chybění vWF a faktoru VIII - Pseudo-vW nemoc - porucha GP Ib -> zrychlené odstraňování cirkulujícího vWF Poruchy sekundární hemostázy Poruchy koagulačního systému Typicky krvácení do tělních dutin, orgánů, retroperitoneal kloubů, svalů Příznaky: kloubní deformity, útlak nervů hematomem Množství a redundance jednotlivých faktorů řebných pro normální hodnoty koagulačních testů Table 6.2, ffíire factor deficiencies Factor Plasmo Level Needed Half-Life Therapy Concentration for Hemostasia (hours) 1 2OM00 mg/dl 100 mg/dl 120 Cryoprecipi tale II ] 0 mg/dl 25% 50-80 Plasma V 1 mg/dl 20-25% 24 Plasma, platelets VII 0,05 mg/dl 15% 6 Plasma, rVIIA VIII 0.01 mg/dl 100% 12 Concentrate, desmopressin IX 0.3 mg/dl 100% 24 Concentrate X 1 mg/dl 1 0-20% 25-fiO Plasma, estrogens M 0.5 mg/dl 40-60% 40-80 Plasma XIII 1-2 mg/dl 1-3% 150 Plasma Alpha^ 5-7 mg/d! 30% (?) 48 Aniifibrinolylic an li ptasflřiín agents Plasminogen 0.005 mg/dl Aniifibrinolylic activator 1 agents DeLoughery et al., 2004 Vrozené koagulopatie hemofílie A (Xq-chromozom vázaná) - defekt fVIII • fVIII je kofaktor při aktivaci fX na fXa v reakci kata lyžované fIXa • snížení koncentrace až na 25% normálu nepůsobí symptomatickou koagulační poruchu, snížení na 25-1% mírná forma, <1% těžká forma • >150 bodových mutací v fVIII genu - velká fenotypová variabilita!!! • prevalence v mužské populaci 1:5000 až 1:10000 hemofílie B (Xq-chromozom vázaná) - defekt fIX • prevalence lOx menší než hemofílie A • >300 bodových mutací v fIX genu (85% bodové, 3% krátké delece a 12% rozsáhlé delece) defekty ostatních faktorů • vzácné, většinou autosomálně recesivní, klinicky manifestní poruchy jen při těžkém deficitu - hemofílie C (defekt fXI) - Aškenazy a iráčtí Židé, autosomálně recesivní, dvě kauzální mutace » Na rozdíl od hemofílie A a B, není jasná korelace mezi závažností a koncentrací cirkulujícího fXI - dysfibrinogenémie (defekt fl) - defekt a2-antiplazminu - atd... Hémophilie A : historique Prince Albert de Saxe-Koburg Reine Victoria dAngleterre {1319-1901) _I c Empereur d'Allemagne Frederic III T Edouard Louis IV Victoria VII Grand-due ďAngleterre de Hessen Leopold Alice Alfred Arthur d'Albanie (mortä 31 ans) CT Empereur Prince Guiifaume II Henri de Prusse Irene Frederic Alexandra de Hessen (mort a 23 ans) de Hessen er Tsar Nicolas I Helene de Waldeck __J Beatrice Henri de Battenberg Alice Waldemer Sigismund Henri [mort ä (rnort ä 4 ans) 46 ans) r Alexandre Leopold Morits de Teck (mortä (mortä Athlone 23 ans) 23 ans par _i accident) O* Victoire AlphonseXIII Eugenie d'Espagne de Battenberg i—r O' Fille Garcon Conductrice Hémophile Tsaréviteh Alexei (assassineä Tage de 13 ans) .....----- M Rupprecht (mort ä 21 ans suite ä un accident de la route) Alphonse Jaime (mort ä 31 ans aprěs un accident de voiture) Juan Gonzales (mort ä 20 ans apres un accident de voiture) Juan Carlos d'Espagne Získané koagulopatie • Nejčastěji jaterní selhání (koag. faktory se tvoří v játrech -navíc i trombocytopenie při nedostatku trombopoetinu) • Antikoagulační terapie (predávkovaní zvi. často u warfarinu -inhibuje redukci vit. K) Diseminovaná intravaskulární koagulopatie (DIC) • Kombinace nadměrné a nedostatečné koagulace Jedná se o klinickou manifestaci nepřiměřené aktivace trombinu Na počátku je obvykle systémová expozice TF 2 fáze: 1) Tvorba mikrotrombů (s lokální ischémií) 2) Vyčerpání koagulačních faktorů a orgánové krvácení Hyperkoagulace a trombóza Patologická aktivace hemostázy v cévním řečišti nebo v srdečních dutinách (X hemostatická zátka) Může vést k okluzi postižené části cévního řečiště a/nebo embolizaci a okluzi na vzdálených místech Pokud trombus vznikne v žilním systému (nejčastěji), embolizuje do plic TM TM EPCR S.l^£™ Aoj, oj^Q o TM Venous Thrombosis Valve, TM O 'ľ' O "i JHHHBHaaaaiÍBP TÖTQ TO c--~> toottocmumauBci ratramtotmotm EPCR - endothelial protein C receptor Červený vs. bílý trombus Červený spíše sekundární hemostáza bohatý na fibrín a erytrocyty stagnace krve - žíly, srdeční dutiny, emboly prevence: hlavně antikoagulancia Bílý spíše primární hemostáza bohatý na destičky (ale i relativně dost fibrinu) arteriální tromby prevence: hlavně antiagregancia Smíšený tepenná aneurysmata Arterial thrombi Venous thrombi Pulmonary emboli Fibrin fibers Fibrin sponge Fibrin bundles □ Platelets Microvesicles □ White blood cells C3 Biconcave RBCs I I Intermediate RBCs H Polyhedrocytes ■ Balloon - like RBCs i i Echinocytes I I Space Fate of thrombus Stavy vedoucí ke vzniku trombu 1) porucha toku krve - např. stagnace při imobilizaci, fibrilace síní, srdeční selhání 2) porucha cévní výstelky - např. ruptúra aterosklerotického plátu, umělé povrchy, poškození endotelu - 4/trombomodulin 3) trombofilní stavy Rudolf Virchow (1821-1902), německý patolog a politik Trombofilní stavy Vrozené • Porucha proteinu C (paradoxně hyperkoagulace v úvodu léčby warfarinem - K-dependentní!) • Porucha proteinu S • Rezistence faktoru V k proteinu C (Leidenská mutace - nejčastější vroz. trombofilní stav) • Porucha antitrombinu III • Dysfibrinogenémie • Hyperhomocysteinémie (?) • Antifosfolipidový syndrom Získané • Malignity • Pooperační stavy • Hyperestrogenní stavy (gravidita, perorální kontraceptiva) • Srdeční selhání • Hyperviskozita (např. při polycytemia vera • Lokálně vše, co vede ke stagnaci krve nebo porušení endotelu Mechanismy • endoteliální produkce vWF • nI/ protein S • ^ koagulační faktory • Současně 1HPA a TAFI (význam nejasný) • U kombinovaných přípravků závisí charakter změn i na progesteronové složce Důsledky • í1> riziko venózní trombózy • Supraaditivní riziko u Leidenské mutace (zřejmě význam interakce protein S - protein C - faktor V) • Malý vliv na arteriální trombózu Antifosfolipidový syndrom zvýšené riziko trombózy asociované s prodloužením aPTT přítomnost protilátek proti fosfolipidům opakované potraty nejasná patogeneze možné mechanismy: • indukce exprese TF u monocytů L • aktivace destiček přes receptor Gp Ib • endoteliální dysfunkce (4, TFPI, ^ PAI-I) • snížení aktivity proteinu C • ztráta funkce (32Gp I (inhibuje tvorbu fXla trombinem) Hyperhomocysteinemie homocystein je meziprodukt přeměny methioninu v methioninovém cyklu - je buď dále metabolizován na cystein - nebo remetylován zpět na methionin (ve folátovém cyklu) Důvodem poruchy metabolizmu homocysteinu a následné HHcy mohou být genetické a nutriční faktory - mutace v genech kódujících enzymy - snížený příjem vitaminu B6, B12 a kyseliny listové HHcy je nezávislým rizikovým faktorem aterosklerózy a trombembolizmu, poruch fertility a některých vývojových a neurologických abnormalit (rozštěpové vady páteře) Protein Tetrahydro folate (THF} 5,10-methylene THF MTHFR '5-methyl THF t Folic Acid Methionine ■ S-adenosyľ methionine 'CH;. S-adenosyl-homocysteine Homocysteine Adenosine B6 CS -Serine Cystathione Cysteine Sulphate Formy: Ale: mechanismem zřejmě endoteliální dysfunkce, ne hyperkoagulační stav Snížení homocysteinu nevede ke snížení rizika trombózy (A) monogenní homocystinurie deficit cystathionin-p-syntázy vede v homozygotním stavu ke značné elevaci plazmatických hladin Hc poměrně vzácné onemocnění (B) tzv. mírná hyperhomocysteinemie Běžný polymorfizmus v genu pro metylentetrahydrofolátreduktázu (MTHFR) Léčba nedostatečné hemostázy • trombocyty • etamsylát (stimuluje aktivaci destiček) • terlipressin - (derivát ADH -vasokonstrikce) • mražená plazma • koagulační faktory • vitamin K • antifibrinolytika Extrinsic Tenase FV1I Tissue Factor t FVIIa Prothrombmase Rivaroxaban Apixaban Fondaparinux / — — FXa intrinsic Tenase Contact activation I FXIIa FXII I FXIa <- F XI ^ FfX FVa .............. FV t ;y. VKAs (via AT) Prothrombin' + Thrombin ,........ Dabigatran Heparinoids (via AT) Fibrinogen 1 FXI 11 Fibnn FXI Ha Fibrinolytika Urokináza, streptokináza (působí v celém oběhu) tPA (působí pouze v trombu) Retepláza (modifikované tPA)