Enzymy Struktura, funkce, vlastnosti Popis enzymové reakce Enzymy v diagnostice Vybrané klinicky významné enzymy MUDr. RNDr. Michal Řiháček, Ph.D. Ústav laboratorní medicíny Fakultní nemocnice Brno Enzymy •bílkoviny s katalytickou aktivitou •s různou specificitou jsou schopny urychlit přeměnu substrátů (reaktantů) na produkty •v přítomnosti enzymu je snížená aktivační energie reakce (v daném směru), čímž dochází k urychlení řádově 106-1014x •enzymy je možné regulovat a fungují za specifických podmínek Enzymy vs. anorganické katalyzátory •ALT (EC 2.6.1.2) •struktura: 500 aa, 54 kDa •teplota: 37 °C (stabilní několik hodin při 50 °C) •pH optimum: 7,0-9,0 •tlak: fyziologické hodnoty •kofaktor: pyridoxal-5-fosfát • • Palladium struktura: prvek, 106 Da teplota: 300-600 °C pH optimum: široké rozmezí tlak: vysoký http://www.thesgc.org/sites/default/files/structure_images/3IHJ_400x400.png Palladium Catalyst http://images.gasgoo.com/MiMwMDRfMDA0IzYyNzA0NDEwMA--/auto-part-catalytic-converters-palladium.jpg Struktura enzymů alanin aminotransferasa 2 http://www.thesgc.org/sites/default/files/structure_images/3IHJ_400x400.png primární struktura (jednotlivé aa) sekundární struktura (uspořádání α-helix) terciární (3D) struktura bílkovinná část enzymu = apoenzym (neaktivní) kofaktor nebílkovinná složka pyridoxal-5-fosfát v případě ALT holoenzym (aktivní) apoenzym + kofaktor Struktura enzymů (VOET) holoenzym (aktivní) http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e6/Spombe_Pop2p_protein_structure_rainbow.png http://www.thesgc.org/sites/default/files/structure_images/3IHJ_400x400.png apoenzym (neaktivní) kofaktor http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/01/Pyridoxal-phosphate-3D-balls.png bílkovinná složka nízkomolekulární aktivující složka Zn2+ http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/7e/Heme_B_3D_ball.png ionty kovů Zn2+ koenzym http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/7e/Heme_B_3D_ball.png prostetická skupina kosubstrát http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/01/Pyridoxal-phosphate-3D-balls.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/01/Pyridoxal-phosphate-3D-balls.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/7e/Heme_B_3D_ball.png např. „zinkový prst “ traskr. faktorů např. hem v cytochromech např. pyridoxal-5-fosfát u ALT např. hem, pyridoxal-5-fosfát Názvosloví enzymů •Triviální •Systematické Názvosloví a dělení enzymů •6 hlavních tříd enzymů reakce systematický název enzymu • •OXIDOREDUKTASY A- + B ↔ A + B- donor:akceptor-oxidoreduktasa • •TRANSFERASY A-B + C ↔ A + B-C donor:akceptor-skupina transferasa • •HYDROLASY A-B + H2O ↔ A-H + B-OH substrát-skupinahydrolasa • •LYASY (SYNTHASY) A-B + X-Y ↔ X-A-B-Y substrát-skupinalyasa • •ISOMERASY X-A-B-Y ↔ Y-A-B-X -racemasa, -epimerasa, -isomerasa, -mutasa • •LIGASY (SYNTHETASY) A + B ↔ A-B substrát-substrátligasa (tvořící nukleotid) Názvosloví enzymů - příklady •6 hlavních tříd enzymů reakce a systematický název enzymu • D-glukosa-6-fosfát:NADP+-oxidoreduktasa (EC 1.1.1.49, G-6-P-DH) •OXIDOREDUKTASY D-glukosa-6-fosfát + NADP+ ↔ 6-fosfo-D-glukono-1,5-lakton + NADPH+H+ • L-aspartát:2-oxoglutarát aminotransferasa (EC 2.6.1.1, AST) •TRANSFERASY L-aspartát + 2-oxoglutarát ↔ oxalacetát + L-glutamát • • α-D-galaktosid-α-D-galaktosyl hydrolasa (EC 3.2.1.22, α-galaktosidasa) •HYDROLASY α-D-galactosid → α-D-galactosa + zbytek sloučeniny (gangliosyl, glykoprotein…) • • (S)-malát-hydrolyasa (EC 4.2.1.2, fumarasa) •LYASY (SYNTHASY) (S)-malát ↔ fumarát + H2O • • EC 4.2.1.2 triosafosfát isomerasa •ISOMERASY dihydroxyacetonfosfát ↔ glyceraldehyd-3-fosfát • • ϒ-L-glutamyl-L-cystein:glycin ligasa (tvořící ADP) (glutathion synthasa EC 6.3.2.3) •LIGASY (SYNTHETASY) ATP + ϒ-L-glutamyl-L-cystein + glycin→ ADP + fosfát + glutathion •Favismus •X-vázané onem. • •Marker poškoz. •buněk (játra…) • •Fabryho nemoc •střádavá choroba • •Velmi vzácná •porucha (100/w) • •Závažná acidurie •(CNS symptom.) • •Anémie a CNS postižení • Kofaktory •nízkomolekulární neproteinové sloučeniny •podílejí se na funkční specifičnosti enzymů •obecná zápis rovnice enzymatické reakce • • •modifikovaný kofaktor vznikající při enzymatické reakci se v jiné (nebo zpětné) reakci může zpětně změnit na kofaktor • • KOFAKTOR + SUBSTRÁT + PRODUKT KOFAKTORMODIF ENZYM Příklad reaktivace kofaktoru: anaerobní glykolýza GLYCERALDEHYD-3-FOSFÁT 2,3-BISFOSFOGLYCERÁT NAD+ NADH+H+ GLYCERALDEHYD-3-FOSFÁT DEHYDROGENASA PYRUVÁT LAKTÁT LAKTÁT DEHYDROGENASA PI • • • • • •modifikovaný (redukovaný) kofaktor NADH+H+ je nutné obnovit některou ze „spřažených reakcí“ •při nedostatku O2 se tak děje anaerobní glykolýzou a hromadí se laktát, reakce zpětně oxiduje NADH+H+ za vzniku redukovaného laktátu z pyruvátu • • Oxidoreduktasy •Oxidoreduktasy katalyzují redoxní přeměny (přenos e-, 2H, zabudování O do substrátu). V reakci dochází k redukci nebo oxidaci substrátu za současné oxidace/redukce kofaktoru. •SKUPINY • •PŘENOS ELEKTRONU OXIDASY cytochrom-c-oxidasa •PŘENOS DVOU ATOMŮ H DEHYDROGENASY laktátdehydrogenasa •ZABUDOVÁNÍ ATOMU O OXIGENASY cyklooxygenasa • • •Donory 2H a donory 2e- lze dle chemicky označit jako redukční činidla (redukují substrát a •sami se oxidují). • •Akceptory 2H a 2e- lze dle chemicky označit jako oxidační činidla (oxidují substrát a sami se •redukují). • • Kofaktory oxidoreduktas a jejich prekursory Vitamin Kofaktor Funkce niacin (vitamin PP/B3) NAD+ akceptor 2H niacin (vitamin PP/B3) NADPH+H+ donor 2H riboflavin (vitamin B2) FAD, FMN akceptor 2H (CC, DŘ) tetrahydrobiopterin donor 2H (Phe→Tyr) molybdopterin přenos e- (XO) lipoát akceptor 2H (Pyr→AcCoA) ubichinon přenos 2e- a 2H+ (CC, DŘ) hem cytochromů přenos e- (CC, DŘ) nehemové železo/síra přenos e- (CC, DŘ) glutathion donor 2H (H2O2→H2O) FMN Oxidačně redukční děje v dýchacím řetězci buněk ubichinon Cyt c ATP syntáza NADH + H + NAD + FADH2 FAD H + H + + H + H + H + H + H + H + H + H + H + H + e- e- e- e- e- e- e- e- e- e- e- e- e- e- e- e- H + H + H + H + H + H + H + H + H + H + + ADP Pi + ATP O2 + H2O mezimembránový prostor cytoplasma matrix mitochondrie NAD+-dependentní dehydrogenasy Metabolická dráha Dehydrogenasa Reakce citrátový cyklus isocitrátdehydrogenasa isocitrát → 2-oxoglutarát 2-oxoglutarátdehydrogenasa 2-oxoglutarát → sukcinyl-CoA malátdehydrogenasa malát → oxalacetát glykolýza glyceraldehyd-3-P-dehydrogenasa glyceraldehyd-3-P → 1,3-BPG laktátdehydrogenasa laktát → pyruvát oxidace ethanolu alkoholdehydrogenasa ethanol → acetaldehyd acetaldehyddehydrogenasa acetaldehyd → kyselina octová Transferasy •Transferasy katalyzují přenos skupin z jednoho substrátu na druhý. Tyto skupiny mohou být malé (-CH3, -NH2, -Glc) i velké (nukleotidy). Významnou podskupinou transferas jsou kinasy. •SKUPINY • •PŘENOS –CH3 METHYLTRANSFERASY thiopurin-S-methyltransferasa •PŘENOS –NH2 AMINOTRANSFERASY AST, ALT •PŘENOS –P KINASY hexokinasa •tvorba polymerů POLYMERASY DNA polymerasa • •Transferasy hrají důležitou roli jak v intermediárním metabolismu (aminotransferasy, methyltransferasy), tak v signálních drahách (kinasy). Kofaktory transferas Vitamín Kofaktor Přenášená skupina ----- ATP –PO32– ----- PAPS –SO32– listová kyselina tetrahydrofolát (H4F) jednouhlíkaté skupiny biotin karboxybiotin CO2 thiamin thiamindifosfát (TDP) „aktivní aldehyd“ pyridoxin pyridoxalfosfát –NH2 pantothenová kyselina CoA-SH acyl ----- dihydrolipoát acyl [methionin] SAM –CH3 kyanokobalamin methylkobalamin –CH3 Transferasy http://www.bmb.leeds.ac.uk/illingworth/bioc1010/image004.gif http://www.nature.com/nrm/journal/v4/n7/images/nrm1154-f2.jpg •kinasové dráhy •pyridoxalfosfát a transaminasy Hydrolasy •Hydrolasy štěpí vazby vzniklé kondenzací za pomocí molekul vody. Hydrolasa Typ štěpené vazby glukosidasa glykosidová galaktosidasa glykosidová hyaluronidasa glykosidová arylsulfatasa sulfoesterová lysozym glykosidová pepsin, trypsin peptidová kathepsin peptidová kolagenasa peptidová elastasa peptidová ribonukleasa fosfodiesterová lipasa esterová fosfatasa fosfoesterová ceramidasa amidová •α-glukosidasa •proteasa R R N H 2 O N H 2 O O H O O H N H 2 Hydrolasy •Hydrolasy jsou jednoduché enzymy tvořené pouze bílkovinou. Tzn. nemají kofaktory. http://www.liv.ac.uk/~agmclen/Medpracs/practical_3/graphics/cleavage.gif http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/3e/Peptidase_actions.png http://oregonstate.edu/instruct/bb450/fall14/stryer7/16/figure_16_29.jpg http://www.web-books.com/MoBio/Free/images/Ch2E4.gif Ostatní skupiny •LYASY •Nehydrolytické štěpení různých typů vazeb, vytváření vazeb C-C, C-O, C-N. Ze substrátu odštěpují nebo do něj vnášejí malou molekulu jako je CO2, H2O a jiné. Vyskytují se například v citrátovém cyklu. •A-B + X-Y ↔ X-A-B-Y • • •ISOMERASY •Katalyzují intramolekulové přesmyky atomů. Výskyt v glykolýze, přeměny sacharidů v nukleotidech. • • • https://www.uic.edu/classes/phar/phar332/Clinical_Cases/carbo%20metab%20cases/galepmr1.gif https://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb1/part2/images/pglucisom.gif Ostatní skupiny •LIGASY (SYNTHETASY) •Katalyzují vznik energeticky náročných vazeb za současného rozkladu makroergní sloučeniny (nejčastěji ATP). Příkladem je významná reakce katalyzovaná pyruvátkarboxylasou, která je úvodní reakcí glukoneogeneze a resyntézy glukózy. • • • • • • • • • • • •Kofaktory této reakce jsou biotin a acetyl-CoA. • • http://guweb2.gonzaga.edu/faculty/cronk/biochem/images/pyruvate_carboxylase_rxn.gif Mechanismus enzymové reakce •vazba na enzym (aktivní místo enzymu) •vytvoření prostoru pro vazbu substrátu •rce. s různými počty substrátů (jedno-, dvou-) • •metaloenzymy • Interakce enzym-substrát • • Reakce dle počtu substrátů • • + SUBSTRÁT ENZYM ENZYM ENZYM ENZYM SUBSTRÁT PRODUKT PRODUKT + + SUBSTRÁT ENZYM KOFAKTOR PRODUKT + KOFAKTOR MODIF ENZYM SUBSTRÁT KOFAKTOR + ENZYM ENZYM PRODUKT KOFAKTOR MODIF + Aktivní místo enzymu • • Metaloenzymy • • BIOGENNÍ Makrobiogenní: H, C, O, N, P, S, Na, K, Mg, Ca, Cl Mikrobiogenní: Zn, Mn, Cu, Mo, Co, I STOPOVÉ Stopové prvky: F, B, Br, Se, As, Ci, Al, Li, Ti, V, Ni, Au OPAKOVÁNÍ – ROZDĚLENÍ PRVKŮ Makrobiogenní prvky jsou základními stavebními kameny živé hmoty (prvky) a podílejí se nejvýznamněji na homeostáze (ionty). Mikrobiogenní prvky a stopové prvky podmiňují zejména funkci biokatalyzátorů. Metaloenzymy • • MOLYBDEN Součástí některých oxidoreduktas. Např.: xanthinoxidasa, aldehydoxidasa. xanthin oxidasa (E.C. 1.17.3.2) Puriny -> hypoxanthin -> xanthin -> kys. močová XanthineOxidase-1FIQ.png FAD FeS clustery molybden jako součást molybdopterinu salicylát http://faculty.virginia.edu/metals/Images/mopterin.jpg Metaloenzymy • • ZINEK alkoholdehydrogenasa, karbonátdehydrogenasa, karboxypeptidáza, superoxiddismutasa MĚĎ ceruloplazmin (ferroxidasa, Fe2+-> Fe3+), cytochrom-c-oxidasa, monoaminooxidasy (MAO) MANGAN hydroxylasy, dekarboxylasy, transferasy ŽELEZO cytochromy Popis enzymatické reakce Kinetika enzymové reakce •kinetika se zabývá průběhem enzymatické reakce •veličinou je rychlost chemické reakce • •RYCHLOST ENZYMATICKÉ REAKCE •úbytek koncentrace substrátu [S] v čase (t) •příbytek koncentrace produktu [P] v čase (t) • Kinetika enzymové reakce •závislost rychlosti reakce (v) na koncentraci substrátu [S] lze navíc vyjádřit kinetickou rovnicí (k=konstanta) • • • •index „na první“ udává řád reakce, tzn. jak je rychlost reakce (v) závislá na koncentraci substrátu [S] • •pokud index=1, pak v přímo úměrně stoupá s [S] •Pokud index=0, pak v=konst. protože je nezávislá na [S] • • • Kinetika enzymové reakce •z toho vyplívá, že pokud máme kinetickou rovnici v = k.[S]1, tzn. v = k.[S], bude graf závislosti vypadat takto: • •pokud necháme reakci běžet bez přídavku substrátu/odebrání produktu, dostáváme tyto závislostní grafy s tzv kinetickými křivkami: • Kinetika enzymové reakce •[S] substrát (koncentrace) [E] enzym (koncentrace) [P] produkt (koncentrace) kinetika I. řádu čím více substrátu, tím vyšší rychlost reakce (nárůst konc. produktu) rychlost reakce závislá na konc. enzymu i substrátu Kinetika enzymové reakce •při velkém nadbytku substrátu, kdy není jeho úbytek rozhodující vypadá kinetická rovnice takto v = k.[S]0, tzn. v = k • •rychlost nárůstu produktu není limitovaná přísunem substrátu, ale např. koncentrací enzymu, čehož lze laboratorně využít k analýze enzymů • Kinetika enzymové reakce •[S] substrát (koncentrace) [E] enzym (koncentrace) [P] produkt (koncentrace) kinetika 0. řádu množství substrátu je pro rychlost reakce irelevantní, je limitována jen množstvím enyzmu Počáteční rychlost v0 •rychlost změřená na začátku reakce, je nejvyšší hodnota rychlosti reakce (není ovlivněna úbytkem [S] jeho vratnou přeměnou [P]) •je však závislá na vstupní koncentraci [S] dle rovnice Michaelise a Mentenové (saturační křivka) • maximální rychlost při dané [E] koncentrace [S] při které běží reakce polovinou Vmax Kinetika enzymové reakce - stav na začátku reakce (v0) •[S] substrát (koncentrace) [E] enzym (koncentrace) [P] produkt (koncentrace) Kinetika enzymové reakce - stav na začátku reakce – polovina max. rychlosti (Km) •[S] substrát (koncentrace) [E] enzym (koncentrace) [P] produkt (koncentrace) Kinetika enzymové reakce - stav na začátku reakce – polovina max. rychlosti (Km) •[S] substrát (koncentrace) [E] enzym (koncentrace) [P] produkt (koncentrace) Co lze zjistit z rovnice MM? •máme-li reakční směs s koncentrací [S] mnohem menší, než je M. konstanta Km, pak reakce probíhá kinetikou 1. řádu • • •máme-li reakční směs s koncentrací [S] mnohem větší, než je M. konstanta Km, pak reakce probíhá kinetikou 0. řádu • Co lze zjistit z rovnice MM? •máme-li reakční směs s koncentrací [S] mnohem menší, než je M. konstanta Km, pak reakce probíhá kinetikou 1. řádu • máme-li reakční směs s koncentrací [S] mnohem větší, než je M. konstanta Km, pak reakce probíhá kinetikou 0. řádu • Michaelisova konstanta a afinita enzymu •Michaelisova konstanta Km je hodnota koncentrace konkrétního substrátu [S] při níž reakce katalyzovaná konkrétním enzymem běží ½ rychlosti vmax • •různé substráty mohou mít (při stejné koncentraci) s jedním enzymem různou hodnotu Km • •stejně tak jeden substrát může mít (při stejné koncentraci) s mnoha enzymy různou hodnotu Km • • •Příkladem je utilizace glukózy v organismu: •Při nízké koncentraci je aktivována primárně •hexokinasa (↓Km pro glukosu). Při vyšších •koncentracích již její aktivitaneroste, ale aktivuje •se nízkoafinitní glukokinasa (↑Km pro glukosu). http://www.elu.sgul.ac.uk/rehash/guest/scorm/294/package/content/powerpoint_cho/MCBHD18-19b/img036. GIF Afinita enzymu (v0) •[S] substrát (koncentrace) [E] enzym (koncentrace) [P] produkt (koncentrace) http://www.elu.sgul.ac.uk/rehash/guest/scorm/294/package/content/powerpoint_cho/MCBHD18-19b/img036. GIF Kinetika reakce z pohledu konc. [E] •průběh reakce ovlivňuje i koncentrace enzymu [E] •počáteční rychlost reakce v0 je přímo úměrná koncentraci enzymu [E] •Michaelisova k. Km se s koncentrací enzymu [E] nemění •čím nižší je [E] tím nižší rychlostí vmax může reakce běžet Rozdíl mezi kinetickou a saturační křivkou •KINETICKÁ KŘIVKA •je vlastně časový záznam jedné konkrétní enzymatické reakce, kdy v různých časech měříme koncentraci substrátu nebo produktu ve formě odezvy (absorbance, fluorescence, turbidita…) •SATURAČNÍ KŘIVKA •saturační křivku lze získat naopak z mnoha stejných reakcí s konstantní koncentrací enzymu s různými koncentracemi substrátu, kde v0 bude počáteční směrnicí v grafu v0 Shrnutí důležitých faktů •pro hodnocení průběhu enzymatické reakce jsou důležité koncentrace základních komponent [E], [S], [P] •rychlost reakce je přírůstek koncentrace (mol/l) [P] nebo úbytek [S] v čase t (s) (výsledná jednotka: mol/l.s) a tuto závislost charakterizuje kinetická křivka •závislost počáteční rychlosti reakce v0 (včetně maximální rychlosti vmax rce.) na koncentraci substrátu určuje saturační křivka, která vychází z rovnice Michaelise a Mentenové •konstanta Km má vztah k afinitě mezi enzymy a substráty, a to nepřímo úměrně • •kinetika 1. řádu znamená, že rychlost reakce je přímo úměrná koncentraci substrátu [S] •kinetika 0. řádu znamená, že rychlost reakce je nezávislá na koncentraci substrátu [S] • Regulace enzymové aktivity •regulace množství molekul enzymu –exprese genů, transkripce, translace – •regulace biologické aktivity enzymu •izoenzymy •aktivace enzymů (např. pepsinogen->pepsin, •fibrinogen->fibrin, angiotensinogen->angiotensin) •kovalentní modifikace (kinasy) •allosterie – enzym má kromě aktivního místa další místo pro vazbu „alosterického modifikátoru“ (inhibitor/aktivátor), ten po navázání změní kvarterní strukturu a aktivita je inhibována/aktivována • •dostupnost a koncentrace substrátu a/nebo kofaktoru, teplota, pH • Inhibitory enzymů •látky, snižující aktivitu enzymů • •INHIBICE IREVERZIBILNÍ (NEVRATNÁ) •Trvalé poškození enzymu, který již není schopen plně vykonávat svou funkci. Inhibitor se pevně váže do aktivního místa kovalentní vazbou a tím zabrání navázání substrátu. • •PŘÍKLADY: organofosfáty, kyanidy, těžké kovy l Inhibitory enzymů •INHIBICE REVERZIBILNÍ (VRATNÁ) •Vazba inhibitoru není kovalentní (trvalá). Může se vázat do aktivního místa nebo mimo něj. • •I) INHIBICE KOMPETITIVNÍ •Inhibitor se váže na enzym v aktivním místě, o které soutěží se substrátem. • •V přítomnosti kompetitivního inhibitoru •roste Km substátu pro enzym. •Vmax zůstane stejná (ale s vyšší [S]) INHIBITOR Kompetitivní inhibice - roste hodnota (Km), substrát koncentrací může „přebít“ inhibitor •[S] substrát (koncentrace) [E] enzym (koncentrace) [P] produkt (koncentrace) Inhibitory enzymů •INHIBICE REVERZIBILNÍ (VRATNÁ) •Vazba inhibitoru není kovalentní (trvalá). Může se vázat do aktivního místa nebo mimo něj. • •II) INHIBICE NEKOMPETITIVNÍ •Inhibitor se váže mimo aktivní místo enzymu. Váže se rovnoměrně na samotný enzym a na komplex enzym-substrát. • •V přítomnosti nekompetitivního inhibitoru probíhá reakce tak, jakoby enzymu bylo méně. •Km substátu pro enzym zůstává stejná. •Vmax se snižuje (ale s vyšší [S]) INHIBITOR Nekompetitivní inhibice - stejná hodnota (Km), snížení koncentrace aktivního enzymu snižuje vmax •[S] substrát (koncentrace) [E] enzym (koncentrace) [P] produkt (koncentrace) snížení afinity snížení afinity Inhibitory enzymů v lékařství •LÉČIVA •aspirin, ibuprofen (neselektivní inhibitory cyklooxygenasy) •nimesulid (Aulin, selektivní inhibitor cyklooxygenasy II) •statiny (Lescol, inhibitor HMG-CoA-reduktasy) • •antibiotika •penicilin (inhibice transpeptidasy – synteza buň. Stěny) •tetracykliny, makrolidy, chloramfenikol (proteosyntéza bakterií) •fluorované chinolony (bakteriální gyrasy) Enzymy v diagnostice Jak zjistíme množství enzymu v biologickém materiálu a jak lze diagnosticky enzymy využít. Jak enzymy stanovujeme? •stanovení se může jevit obtížné kvůli velmi nízkým koncentracím enzymů •jedná se o bílkoviny, kterých je v biologickém materiálu velké množství •běžnými chemickými způsoby je neodlišíme, není zde dostatečná specifita Kvantitativní analýza zahrnuje v zásadě dvě hlavní možnosti •katalytická koncentrace (μkat/l) •stanovujeme produkt enzymatické reakce •takto se stanovuje většina klinicky významných enzymů • •jednotka je podle kinetické křivky mol/l.s, kde mol/s=kat •hmotnostní koncentrace (μg/l) •stanovujeme enzym jako bílkovinu •imunochemická analýza •podstatně méně používaná •zejména má využití u tumorových markerů (PSA, NSE…) Jednotky při stanovení katalytické koncentrace •katalytická aktivita enzymu •jednotkou je mol/s tedy katal •jeden katal odpovídá aktivitě enzymu, při které se v reakci přemění jeden mol substrátu na produkt za jednu sekundu • •mezinárodní jednotka (IU) odpovídá 1 μmol/min •1 IU = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat = 0,0166 μkat = 16,6 nkat • •katalytická koncentrace enzymu •je aktivita vztažená na objem biologické tekutiny •jednotky: μkat/l, nkat/l • Jak postupujeme při stanovení enzymu? •zajistíme optimální podmínky reakce: teplota, pH, dostatek kofaktoru •měří se ∆[S] nebo ∆[P] v určitém časovém intervalu a to nejlépe průběžně nebo alespoň v určitých časových úsecích •stanovujeme enzym tudíž reakci nesmí limitovat nedostatečná koncentrace substrátu, proto by se měla pohybovat řádově ve stonásobku Km •tímto zajistíme konstantní rychlost po celou dobu reakce • Jak postupujeme při stanovení enzymu? •KINETICKÁ METODA STANOVENÍ •používá se u reakcí, kde lze průběžně měřit [S] nebo [P] např. po deseti sekundách •sestrojíme kinetickou křivku •touto metodou získáme v0 (kat) • • •METODA KONSTANTNÍHO ČASU (dvoubodová) •alternativa, pokud nejsme schopni průběžně měřit [S] či [P] •změříme [P], start, stop, změříme [P] = rozdíl •získáme pouze průměrnou rychlost v (kat) Stanovení enzymů v praxi •Pokud je Km<<< [S], pak: •…a z toho vyplývá, že přírůstek koncentrace produktu (reakční rychlost) v reakci bude závislý jen na koncentraci enzymu, a to přímo úměrně •V1 > V2 > V3 [E]1 > [E]2 > [E]3 • •V1 •V2 •V3 Warburgův optický UV test •test, využitelný ke stanovení aktivity NAD(P)-dependentních dehydrogenas nebo spřažených reakcí (reakcí se účastní NAD+ nebo NADP+) •test vychází z předpokladu •přeměny NAD(P)+ → NAD(P)H + H+ •při vlnové délce 340 nm mají •NAD(P)H a NAD(P)+ různou •absorbtivitu, takže spolu •neinterferují •při enzymatické reakci tedy •měříme úbytek/nárůst NAD(P)H • • • uv test.bmp Vybrané klinicky významné enzymy •AST, ALT, ALP a izoenzymy • •GGT, AMS, CK a izoenzymy, CK-Mbmass • •LD a izoenzymy, LPS, cholinesterasa ASPARTÁT AMINOTRANSFERASA (AST) •třída: transaminasa • • • • • •lokalizace: cytoplazmatický enzym (30%), mitochondriální enzym (70%) •tkáňová distribuce: hlavně játra, myokard, ledviny a kosterní svaly http://www.aaltoscientific.com/purifiedhumanproteins/images/aspartate-transaminase.jpg ASPARTÁT AMINOTRANSFERASA •princip stanovení (příklad): Warburgův test při použití spřažené reakce katalyzované malátdehydrogenasou (MDH) • •AST •2-oxoglutarát + L-aspartát → L-glutamát + oxalacetát • •MDH •oxalacetát + NADH+H+ → L-malát + NAD+ • • • • •reagencie: R1 (pufr 7,8, L-aspartát, NADH, MDH, konzervans) • R2 (2-oxoglutarát) měříme úbytek absorbance při 340 nm ASPARTÁT AMINOTRANSFERASA 1)známé množství vzorku smícháno se známým množstvím R1 2)změří se blank 3)přidá se startovací reagencie R2, zahájí se měření startu reakce 4)měří se úbytek absorbance NADH na základě Warburgova testu 5)odečtení hodnot změny absorbance v čase a vyhodnocení z kalibrace ASPARTÁT AMINOTRANSFERASA •klin. význam: • marker poškození tkáně (enzym se při poškození vylévá z buňek a jeho aktivita je měřitelná v séru) • infarkt myokardu • hepatopatie – infekční a toxické hepatitidy • poškození kosterního svalu – úrazy, DMD • poměr AST/ALT: do 0,7 (méně závažné poškození tkáně), nad 0,7 závažnější ASPARTÁT AMINOTRANSFERASA •fyziol. hodnoty: <0,58 μkat/l (37 °C) • •biol. materiál: sérum/plazma • •preanalytická fáze a interference: hemolýza, dodržet čas od odběru (může se lišit mezilaboratorně) http://img.webmd.com/dtmcms/live/webmd/consumer_assets/site_images/articles/health_tools/anemia_ove rview_slideshow/photolibrary_rm_photo_of_blood_samples.jpg ALANIN AMINOTRANSFERASA (ALT) •třída: transaminasa • • • • • •lokalizace: cytoplazmatický enzym •tkáňová distribuce: játra, ledviny, srdce, kosterní sval, pankreas, plíce http://www.aaltoscientific.com/purifiedhumanproteins/images/alanine-aminotransferase.jpg ALANIN AMINOTRANSFERASA •princip stanovení (příklad): Warburgův test při použití spřažené reakce katalyzované laktátdehydrogenasou (LDH) • •ALT •2-oxoglutarát + L-alanin → L-glutamát + pyruvát • •LDH •pyruvát + NADH+H+ → laktát + NAD+ • • • • •reagencie: R1 (pufr, L-alanin, NADH, LDH, konzervans) • R2 (2-oxoglutarát) měříme úbytek absorbance při 340 nm ALANIN AMINOTRANSFERASA •klin. význam: • marker poškození tkáně • hepatopatie – spíše virové hepatitidy (↑EBV) a chronická onemocnění jater • poškození kosterního svalu – úrazy, záněty ALANIN AMINOTRANSFERASA •fyziol. hodnoty: • M <0,75 μkat/l • Ž <0,58 μkat/l •biol. materiál: sérum/plazma • •preanalytická fáze a interference: hemolýza, dodržet čas od odběru (může se lišit mezilaboratorně) ALKALICKÁ FOSFATÁZA (ALP) •třída: hydrolasa •reakce: v alkalickém prostředí katalyzuje hydrolýzu organických monoesterů kys. fosforečné • •princip stanovení: fotometrická detekce p-nitrofenolu, který za katalýzy ALP vzniká z p-nitrofenylfosfátu • •lokalizace: epiteliální buněčná membrána •tkáňová distribuce: 3 hlavní izoenzymy • placentární • střevní • tkáňové (kostní/jaterní/ledvinná) ALKALICKÁ FOSFATÁZA •klin. význam: • zvýšená aktivita při • JÁTRA: cholestáza (obstrukce žlučových cest), nádory, • KOSTI: osteoblasty (reparace kostní tkáně), zlomeniny a metastázy v kostech, Pagetova choroba, osteomalacie, růst u dětí • • OSTATNÍ: hyperparathyreóza, selhání ledvin • •preanalytická fáze a interference: hemolýza, věk pacienta (u dětí fyziologicky vyšší) • γ-GLUTAMYL TRANSFERASA (GGT) •třída: transferasa •reakce: katalyzuje přenos glutamátového zbytku, γ-glutamylový cyklus zabezpečuje transport aminokyselin a peptidů přes buněčnou membránu • •princip stanovení: přenos glutamátové skupiny ze substrátu na glycylglycin, substrát se mění na barevný 5-amino-2-nitrobenzoát • •lokalizace: membrána •tkáňová distribuce: játra, žlučové cesty, ledvinné tubuly γ-GLUTAMYL TRANSFERASA •klin. význam: • játerní onemocnění • poruchy cytoplazmatické membrány hepatocytů, výrazně se zvyšuje u alkoholických hepatopatií, cirrhózy, steatózy a maligních nádorů jater a pankreatu α-amylasa (AMS) •třída: hydrolasa •reakce: hydrolyzuje α-1,4-glykosidovou vazbu škrobu a glykogenu • •princip stanovení: p-nitrofenylované polysacharidy jsou štěpeny na p-nitrofenol a glukosu, p-nitrofenol stanovíme fotometricky • •lokalizace: sliny, pankreatická šťáva •tkáňová distribuce: slinné žlázy, pankreas (izoenzymy) α-amylasa (AMS) •klin. význam: • zvýšená aktivita při • SLINNÉ ŽLÁZY: záněty, nádory • PANKREAS: záněty, nádor • • OSTATNÍ: poškození jater, ledvinová nedostatečnost • •materiál: sérum, plazma, moč •preanalytická fáze a interference: hemolýza, věk pacienta (u dětí fyziologicky vyšší) • lipasa (LPS) •třída: hydrolasa •reakce: katalyzuje hydrolýzu TG v tenkém střevě na 1. a 3. uhlíku v přítomnosti • žluči a Ca2+ • • • •lokalizace: pankreatická šťáva, lipoproteiny, tuková tkáň •tkáňová distribuce: pankreas, endotel cév, tuková tkáň http://4.bp.blogspot.com/-bwRGXH-ZUfw/UI690_mMklI/AAAAAAAAQf0/W2JuO65e9O0/s1600/TGbreakdown1%5B1%5D .gif lipasa (LPS) •princip stanovení: substrát lipasy s navázaným chromogenem (metylresorufin) je štěpen na chromogen a detekuje se intenzita červeného záření (fotometricky) • •klin. význam: •detekce a vyloučení akutní pankreatitidy •obstrukce pankreatického traktu •relaps chronické pankreatitidy • • LAKTÁT DEHYDROGENASA (LDH) •třída: oxidoreduktasa • • • • • •lokalizace: cytoplazma •tkáňová distribuce: všechny tkáně, celkem 5 izoenzymů s různými podjednotkami – srdce (H) kosterní sval (M) • • • http://oregonstate.edu/instruct/bb450/fall14/stryer7/3/unnumbered_03_p67.jpg LAKTÁT DEHYDROGENASA •princip stanovení (příklad): Warburgův test při stanovení LDH (global), srdeční izoenzym HBDH (LDH1) má schopnost štěpit α-ketobutyrát •LDH(global) •pyruvát + NADH+H+ → laktát + NAD+ • •HBDH (LDH izoenzym 1, 4H) •α-ketobutyrát + NADH+H+ → α-hydroxybutyrát + NAD+ • • •fyziol. hodnoty: <4,2 μkat/l (37 °C) •preanalytická fáze a interference: hemolýza • LAKTÁT DEHYDROGENASA •klin. význam: • marker hypoxie a poškození tkáně • infarkt myokardu (význam izoenzymu HBDH!) • nádorová onemocnění • jaterní onemocnění • hemolytická anémie • leukemie (i jako prognostický marker) KREATINKINASA (CK) •třída: transferasa •katalyzuje tvorbu fosfokreatinu, čímž konzervuje energii (zpětná reakce tvoří ATP substrátovou fosforylací) a naopak • • • • •lokalizace: cytoplazma •tkáňová distribuce: izoenzymy - kosterní svalstvo (CK-MM), mozek (CK-BB), srdce (CK-MB) • u zdravých osob v séru 95% CK-MM a 5% CK-MB, CK-BB 0% • • • http://www.aaltoscientific.com/purifiedhumanproteins/images/creatine-kinase-mb.jpg KREATINKINASA (CK) •klin. význam: • poškození srdce infarkt myokardu: po 4-8 hodinách se zvyšuje aktivita CK-MB (nekróza a vylití z buněk), normální hodnoty 3- 5 dní po IM, musí se stanovit imunochemicky (CK-Mbmass), protože její aktivitu překrývá plazmatická CK-MM http://pfyziollfup.upol.cz/castwiki2/wp-content/uploads/2011/10/Markery.jpg KREATINKINASA (CK) •klin. význam: • poškození kosterních svalů: úrazy a záněty, svalové dystrofie (obrovské hodnoty CK-MM, doprovázené elevací transaminas) • • onemocnění CNS: aktivita CK-BB se zvyšuje úměrně poškození mozkové tkáně • •princip metody (celková CK): Warburgův optický test • při nadbytku kreatinfosfátu a ADP se tvoří kreatin a ATP, ATP se využije v navazující hexokinasové reakci (vznik glukosy), glukosa je potom přeměněna na fosfoglukonát za vzniku NADPH (měří se nárůst) • CHOLINESTERASA (CE) •třída: hydrolasa •hydrolýza esterů cholinu •inaktivace acetylcholinu v •nervosvalové ploténce a •cholinergních synapsích a tím •zastavení regulace přenosu •vzruchu • •lokalizace: cytoplazma, cholinergní nervy •tkáňová distribuce: izoenzymy acetylcholinesterasa (erytrocyty, cholinergní nervy), pseudocholinesterasa (syntéza v játrech) • • http://www.sott.net/image/s4/97769/full/acetylcholine_dec_galantamine_.jpg CHOLINESTERASA •klin. význam: • intoxikace organofosfáty (stanovení aktivity AchE v erytrocytech) • familiární idiopatická acholinesetazémie • dědičný defekt syntézy enzymu • způsobuje problémy při anestézii (podání sukcinylcholinu, který se potom nemůže odbourávat) • vysoké riziko až zástavy dechu • • onemocnění jater, proteinová malnutrice • •princip stanovení: substrátem je butyrylthiocholin, ten se mění v reakci CHE na thiocholin, který tvoří komplex s hexakyanoželeznatanem (barevný produkt) • • STANOVENÍ IZOENZYMŮ •laktát dehydrogenasa – LDH1-5 •kreatinkinasa – CK-MM, CK-MB, CK-BB •alkalická fosfatasa – střevní, placentární tkáňová (jaterní, kostní, ledvinná) • •METODY •imunoanalýza (specifické mAb proti konkretnímu izoenzymu, stanovíme tím hmotnostní koncentraci) •elektroforéza (separace na základě různé pohyblivosti v elektrickém poli a různé Mr) •specifický substrát (v případě HBDH) • • KVALITATIVNÍ ANALÝZA ENZYMŮ •enzym = bílkovina •bílkoviny jsou kódovány v DNA •fenotyp enzymu (aktivita) je zakotvena na úrovni genu tohoto enzymu (genotyp) • •využití: screening vrozených metabolických poruch, genotypizace enzymů metabolismu léčiv (cytostatika – TPMT, DPD) a jiné… •metody: PCR • • Děkuji za pozornost.