Preanalýza, kalibrace, kontroly kvality v koagulační laboratoři RNDr. Jiřina Zavřelové OKH FN Brno Správnost laboratorních výsledků • Faktory • objektivní • subjektivní • Faktory • preanalytické • analytické • postanalytické Preanalytické faktory • Příprava pacienta • Odběr vzorku • Transport vzorku • Zpracování vzorku • Skladování vzorku Příprava pacienta • Odběr na lačno nebo po lehké snídani bez tuků • Dostatečný příjem tekutin • Uvedení času odběru • Uvedení léčby • Uvedení komplikace při odběru Odběr vzorku • Minimální zatažení paže • Do plastikových nebo silikonovaných skleněných zkumavek • První 2-3 ml nelze použít • Antikoagulační roztok pro nesrážlivou krev- citrát sodný v ředění 1:10 • Šetrné promíchání krve s citrátem (5-10x) Antikoagulancia • Citrát sodný • 0,109 mol/l (3,2 %) doporučeno • 1,129 mol/l (3,8 %) • CTAD zkumavky • brání aktivaci trombocytů • doporučeno pro testy PAI-1, heparin, PF4... Nedostatečné promíchání krve s citrátem • Nebezpečí aktivace a srážení vzorku • Koncentrování citrátu u hladiny • automaty pipetují těsně pod hladinou naředěnou plazmu s nadbytkem citrátu • špatné výsledky • ověření po stažení plazmy a promíchání Správný odběr vzorku Vyřadit vzorky • Sražené • S chybným objemem krve (rozdíl 10%) • Hemolytické, ikterické a chylózní • hemolytický a ikterický vzorek • ovlivňuje výrazně fotometrická stanovení • chylózní vzorek • ovlivňuje výrazně koagulační stanovení na optických koagulometrech a imunochemická stanovení vyhodnocovaná opticky Správný odběr vzorku Množství krve • Méně • prodloužení koagulačních časů • APTT citlivé od 90% objemu • PT citlivé od 80 % objemu • Více • zkrácení koagulačních časů?? Správný odběr vzorku • Hematokrit • < 30 % nebo >60 % upravit objem citrátu 100 - hematokrit ml citrátu = ------------------x ml plné krve 595 - hematokrit Transport vzorku • Čas (max 2 hod) • Teplota (18-25°C) • Mechanické vlivy (potrubní pošta) Zpracování vzorku • Odstranění krevních buněk centrifugací • Stažení plazmy • Většina testů do 1 - 4 hod po odběru • Výjimka EGT, EF (15 - 30 min), heparin, PAI-1, LA, vyšetření fcí trombocytů Vyšetřovaný materiál • Plazma * plazma bohatá na trombocyty • centrifugace 10 minut 150 - 250 g, sedimentace * plazma chudá na trombocyty • centrifugace 15 minut 2500 g * bezdestičková plazma • dvojnásobná centrifugace • Plná krev • Sérum Centrifugace • Výpočet otáček pro danou centrifugu •g = 1,118 xlO-5xrxN2 r = poloměr otáčení v cm, N = otáčky/min Příklad: r = 15 cm, 2500g 3860 otáček/min Skladování primárních vzorků • Laboratorní teplota 18 - 25 °C • PT 6 hodin • APTT 4 hodiny • APTT (léčba heparinem) 1 hodinu • Ostatní vyšetření: 4 hod • Vyšší teplota ne • Uložení v lednici (aktivace FF VII a XII) ne Zamrazování vzorků • Plazma chudá na destičky/bezdestičková • Objem > 500 |il • Zkumavka se zátkou • Správná velikost zkumavky • Zkumavka naplněná do 3/4 • Rychlé zamrazení (-70 °C, -196 °C) • Skladování zamrazených vzorků • krátkodobé -20 °C, dlouhodobé: - 70 °C Rozmrazování vzorků • Při 37 °C min. 5 minut • Dobře promíchat • Opakované zamrazení není možné Analytické faktory • Dodržování metodických postupů • Správné pracovní návyky • Správná funkce a kalibrace přístrojů • Výběr diagnostických setů a reagencií • Správná volba kalibračních a kontrolních materiálů • Správně provedená kalibrace a kontroly kvality Postanalytické faktory Rozmezí fyziologických hodnot Terapeutické rozmezí Vyjadřování výsledků Vyhodnocení výsledků Interpretace výsledků Kalibrační materiál •Komerční kalibrační plazmy •přesně udaná hladina vyšetřované složky •návaznost na mezinárodní referenční materiály •některé parametry návaznost na „pool" normální plazmu (APTT, PT,..) •Směsná normální plazma (PT, APTT) Kalibrace 1/ Vyšetření • různých ředění kalibrační plazmy s udanou hladinou parametru(100%, 50 %, 25 %....) • několika kalibračních materiálů s různou hladinou parametru • a vynesení naměřených hodnot (čas, A...) pro jednotlivé hladiny do grafu • závislost lin/lin, lin/log, log/log,nelineární(polynom) 2/ Vyšetření referenčního času (času normálu) pro výpočet R, INR 3/ Načtení kalibrace čárovým kódem u předkalibrovaných metod Ředění kalibrační plazmy • Automatické • naprogramováno • Manuální Typy ředění • Geometrickou řadou 100 % 100 % plazma (neředěná/ředěná) 50 % 1 díl 100% plazmy + 1 díl pufru 25% 1 díl 50% plazmy + 1 díl pufru 12,5% 1 díl 25% plazmy + 1 díl pufru 6,25 % 1 díl 12,5 % plazmy + 1 díl pufru • Jiný způsob 1:1 100 % plazma (neředěná/ředěná) 100% 1:2 ldíl 100% plazmy + 1 díl pufru 50 % 1:4 ldíl 100 % plazmy + 3 díly pufru 25 % 1:8 ldíl 100% plazmy+ 7 dílů pufru 12,5% 1:16 ldíl 100 % plazmy + 15 dílů pufru 6,25 % Kalibrační křivka Grafická závislost měřeného parametru na hladině vyšetřované složky • měřený parametr (osa y) • koagulační čas (s) • absorbance (A, AA/min)..... • hladina vyšetřované složky (osa x) • aktivita (%, IU/mĽ.) • koncentrace (g/l, |ug/mL.) Kalibrační křivka - požadavky minimálně tříbodová • závisí na typu vyšetření musí pokrýt rozsah normálních i patologických hodnot linearita kalibrační křivky (ideální r = 1,00) pokud naměřená hodnota mimo kalibrovanou oblast v oblasti s klinickým významem je nezbytné opakovat vyšetření s jiným ředěním (menším nebo větším) vyšetřované plazmy Odečtení výsledku • Automatické • Manuální • přímé odečtení # stejné ředění kalibrační i vyšetřované plazmy • odečtení + vynásobení dilučním faktorem • odlišné ředění kalibrační a vyšetřované plazmy Provedení kalibrace • při změně šarže setu • při změně šarže jednotlivých reagencií, v případě že nejsou součástí jednoho setu • po kalibraci musí následovat provedení kontrol kvality s deklarovaným rozmezím v normálním i patologickém rozsahu Kalibrace rutinních koagulačních vyšetření PT, APTX Fbg, AT, D-DI, aXa Kalibrační materiál • komerční kalibrační plazmy • směsná normální plazma (PT, aPTT) Provedení kalibrace • při změně šarže setu • při změně šarže jednotlivých reagencií, • v případě, že nejsou součástí jednoho setu Kalibrace speciálních koagulačních vyšetření Kalibrační materiál • komerční kalibrační plazmy Provedení kalibrace • s každou sérií vyšetření vzhledem k omezené stabilitě reagencií a vysoké citlivosti • za obzvláště citlivé metody vyžadující kalibraci s každou sérií jsou považována vyšetření FF VIII, IX, XI a XII, PC a PS Typy kontrol • Preciznost v čase (mezilehlá preciznost, reprodukovatelnost) • Kontroly s deklarovaným rozmezím • Porovnatelnost přístrojů/metod • Preciznost v sérii (opakovatelnost) • Pravdivost (správnost) Požadavky na kontrolní vzorky • Měření v jednom běhu současně se vzorky pacientů • Analyzované složky musí být dostatečně stabilní, složení co nejvíce podobné vyšetřovaným vzorkům •Zcela nezávislé na kalibračních materiálech, nesmí byt použity ke kalibraci analytických metod • Nutno použít více kontrolních vzorků s různou hladinou měřeného parametru, aby byl pokryt celý měřený rozsah • Odlišné hladiny nelze získat různým ředěním téhož kontrolního materiálu!!! Kontrolní materiál Firemní komerční materiál (lyofilizované) • referenční materiál (cílová hodnota, návaznost) • materiál s deklarovaným rozmezím hodnot • atestovaná kontrola • materiál bez deklarovaného rozmezí hodnot • neatestovaná kontrola V laboratoři připravený kontrolní materiál • šokově zmrazený nebo čerstvý Kontrolní materiály v rozmezí • fyziologických i patologických hodnot („normální" patologické) Preciznost • je těsnost shody mezi navzájem nezávislými výsledky opakovaných měření téhož vzorku • číselným vyjádřením = směrodatná odchylka(SD) od aritmet. průměru (x) S(x, - x)2 S(x, - x)2 SD= V---------------neboSD= V--------------- n-1 n Preciznost relativní směrodatná odchylka = variační koeficient (CV) SD x 100 CV = ----------- 10 x Stanovení preciznosti • Opakovaná analýza stejného kontrolního materiálu, který nemusí mít udaný obsah stanovovaných složek (neatestovaný kontrolní materiál) • zajištění dostatečného množství kontrolních vzorků • zajištění stability vyšetřovaných parametrů Stanovení preciznosti • Preciznost metody v sérii (opakovatelnost) • je to souhlas mezi výsledky opakované analýzy téhož kontrolního vzorku, analyzovaných opakovaně (např. lOx) stejnou metodou ve stejném čase • Preciznost metody v čase (reprodukovatelnost) • liší se od přesnosti v sérii tím, že se kontrolní vzorek analyzuje každý den v provozních podmínkách současně s ostatními vzorky Preciznost v čase/reprodukovatelnost • Rutinní koagulace (PT,APTT,Fbg,TT,AT,D-Di,aXa) • Kontrolní materiál • komerční (neatestovaný) • připravený laboratoří • Dvě hladiny (N a P) • Provádět minimálně l-2x denně • před zahájením denního provozu (a před pohotovostní službou), pro každý parametr a pro každý přístroj, který je v provozu • Speciální koagulace • jen u vyšetření prováděných s větší frekvencí Preciznost v čase - vyhodnocení • Statistické programy • koagulační automat • US • samostatné • výstup na Levey - Jenninsonovy grafy • Westgardova pravidla • není běžné Preciznost v čase - vyhodnocení • Nutno provádět průběžně • průměr, SD, CV (CV/SD doporučené nebo vlastní) • kontrolní rozmezí (průměr ± 2 SD) • varovné rozmezí maxim.(průměr ± 3 SD) Kontroly preciznosti pro AT - N 144,4 129,4 114,4 99,4 84,4 69,4 TJ □ □ □ □ □ nn---------------n-~-o-----------------------------n-o--o-n ---------------------------------------------------------Q---0——□—□ □ □ 54,4 -!—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—I 0123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Kontroly preciznosti AT - P ____□ D □ □ □ —U— —n-n—^----------- TJ 0 □ □ □ □ □ □ 0123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Preciznost v čase - vyhodnocení • Pokud výsledek mimo povolené meze • musí se najít příčina a celou sérii včetně kontrol zopakovat • Pokud výsledky na jedné straně od x nebo vykazují stoupající nebo klesající trend, velký rozdíl oproti předchozímu výsledku... • je nutno analytickou metodu opravit Preciznost v čase/reprodukovatelnost • Vedení protokolů O I v v v • prubezne • výsledky měření, kontrolní a varovné rozmezí, CV / SD autorizace, schválen • závěr (šarže kontroly, reagencie, kalibrace) • CV / SD, (počet překročení kontrolního rozmezí) • Primární dokumentace • tisk výsledků kontrol, grafů Kontroly s deklarovaným rozmezím Atestovaný komerční kontrolní materiál Použít minimálně dva nezávislé kontrolní vzorky • normálni • patologický Odchylky/rozmezí uvedené na kontrolních materiálech nesmí být překročeny Pokud k tomu dojde, je nutné hledat příčinu a a celý běh analýz včetně analýzy kontrolního vzorku zopakovat Kontroly s deklarovaným rozmezím • Rutinní koagulace • při změně šarže reagencie • po kalibraci • lx měsíčně minimálně • Speciální koagulace • po kalibraci • s každou sérií vyšetření Kontroly s deklarovaným rozmezím • Vyhodnocení • porovnání s deklarovanými hodnotami • Vedení protokolů • výsledky měření • deklarované rozmezí • autorizace • schválení Preciznost v sérii /opakovatelnost Nepatří mezi běžné kontroly v koagulaci Provádí se • při validaci přístroje • pro ověření správné funkce přístroje • při zavádění nových metod Počet měření 6-10 Vyhodnocení • průměr, CV/ SD ( doporučené) Porovnatelnost přístrojů • Rutinní koagulace (PT,APTT,Fbg, TT,AT,D-Di,aXa) • Vzorky pacientů čerstvé (N a P) • lx denně na všech přístrojích, které v provozu • Komerční atestované kontroly (N a P) • po kalibraci a při změně šarže reagencie • Speciální koagulace - běžně se neprovádí • Vyhodnocení • D% (procentuální odchylka výsledků měření analyzátorů vůči referenčnímu analyzátoru) • D% = (v - AV/AV) x 100 • v = výsledek měření analyzátoru • AV = vztažná hodnota referenčního analyzátoru Pravdivost • Je těsnost shody mezi průměrnou hodnotou výsledků více měření a uvedenou cílovou hodnotou referenčního kontrolního materiálu • min.6 měření za podmínek opakovatelnosti • Vyhodnocení • Bias% (odchylka aritmetického průměru série výsledků měření od cílové hodnoty kontroly • bias% = (x - AV/AV) x 100 • x = aritmetický průměr výsledků měření • AV = vztažná hodnota referenčního materiálu