Imunitní systém Marcela Vlková Imunitní systém • Funkční charakteristika: homeostáza, sebeudržování na úrovni molekulární výstavby organismu schopnost rozpoznání a eliminace cizorodých a škodlivých látek z organismu • Integrální součást organismu propojení s metabolismem, endokrinním a nervovým systémem Imunitní systém – složka celotělového informačního systému • Schopen přijímat podněty prostřednictvím receptorů • Podněty kvalitativně a kvantitativně vyhodnocuje • Na podněty reaguje efektorovou aktivitou • Shodné rysy s hormonální a nervovou soustavou • Vzájemně se funkčně i strukturně provazují • Mají schopnost odpovídat na všechny druhy přicházejících podnětů IMUNITNÍ SYSTÉM JAKO SOUČÁST ORGANISMU nervový systém metabolismus endokrinní systém IMUNITNÍ SYSTÉM genom mikrobiom epigenetické vlivy Úloha imunitního systému • Reaguje s cizorodými/nebezpečnými substancemi z vnějšího prostředí (zejména antimikrobiální ochrana). • Účastní se odstraňování starých a poškozených buněk vlastního těla. • Napadá nádorové a viry infikované buňky vlastního těla. Přenos informací v imunitním systému • Prostřednictvím membránových interakcí: • Blízký kontakt buňka- buňka • Membránové receptory na buňkách IS reagují s odpovídajícími ligandy na jiných buňkách IS nebo jiných buňkách - přenos aktivačního signálu • Vzdálený kontakt: buňka – biologicky aktivní látka • Kontakt je opět veden přes buněčný receptor – přenos aktivačního signálu Poruchy imunitního systému HYPO- FUNKCE DYS- FUNKCE NÁDORY IMUNITNÍHO SYSTÉMU IMMUNO- DEFICIENCE ALERGIE AUTOIMMUNITA HYPER- FUNKCE Kombinace faktorů podmiňujících vznik autoimunitních chorob GENETIKA IMUNITA HORMONY PROSTŘEDÍ VÝŽIVA Imunitní systém - základní pojmy Antigen • Látka, kterou rozezná imunitní systém a která vyvolává imunitní reakci • Základní složení: • nosičská část molekuly • Antigenní determinanty – epitopy, tvořené 5-7 aminokyselinami Vztah antigenu a epitopu Imnunogennost • Schopnost vyvolat imunitní reakci – musí: – Být cizorodé – Mít dostatečnou molekulovou hmotnost (> 6 kDa) – Mít komplexní strukturu • Produkty imunitní reakce ( protilátky, Tlymfocyty) mají schopnost s Ag specificky reagovat Chemické složení antigenů • Proteiny – obvykle výborné imunogeny. • Polysacharidy- jsou dobrými imunogeny zejména jako součást glykoproteinů. • Nukleové kyseliny- špatná imunogenicita, vázána zejména na komplexy nukleových kyselin a proteinů. • Tuky – velmi zřídka se uplatňují jako imunogeny. Nejznámější jsou sfingolipidy. Zkřížená reaktivita antigenů • Při imunitní reakci může někdy dojít k reakci s jinou látkou, než tou, která reakci původně způsobila. • Je to dáno imunologickou podobností obou látek, ale nemusí se jednat o podobnost chemickou • Zkřížená reaktivita se uplatňuje zejména v patogenezi imunitních chorob Zkřížená reaktivita antigenů Vysoká afinita Nízká afinita Ab1 Ag2 Ab1 Ag1 Imunitní systém • Funkční charakteristika: homeostáza, sebeudržování na úrovni molekulární výstavby organismu schopnost rozpoznání a eliminace cizorodých a škodlivých látek z organismu • Morfologická charakteristika: lymfoidní, lymforetikulární systém • Integrální součást organismu propojení s metabolismem, endokrinním a nervovým systémem Základ imunitního systému • Lymfatická tkáň a lymfatické orgány • Buňky imunitního systému Složky imunitního sytému • Periferní oblasti imunitního systému je možno rozdělit do několika funkčních oblastí jejichž imunitní odpověď má určité odlišné charakteristiky. • Základní složky imunitního systému: – Kostní dřeň, tymus – Lymfatické uzliny a slezina – Imunitní systém sliznic – Kožní imunitní systém – Lymfatický cévní systém Lymfatické orgány • Primární: kostní dřeň, thymus – Vznik, diferenciace a zrání imunokompetentních buněk • Sekundární lymfatické orgány: slezina, lymfatické uzliny, MALT – místo, kde probíhají specifické imunitní reakce IMUNITA • Vrozená (přirozená, nespecifická, innate immunity) u všech mnohobuněčných organismů • Adaptivní (získaná, specifická, adaptive immunity) až od obratlovců …………………………………………………………………………………………. Adaptivní = vzniklý adaptací Vrozená imunita Fyzikální bariéry Kůže Sliznice Respirační trakt Močový trakt Vrozená imunita Chemické bariéry pH (kůže 5,5, žaludek 1-3, vagina 4,5) mikrobicidní substance – antimikrobiální peptidy (lysozym, defensiny, cathelicidiny…) Vrozená imunita Biologické bariéry Mikroorganismy fyziologické mikroflóry (komensální mikroorganismy) Nespecifická imunitní odpověď Pokud Ag pronikne přes fyzikální, chemickou a mikrobiální bariéru – dochází k rozvoji nespecifické imunitní odpovědi • Nespecifická imunitní odpověď se rozvíjí v řádu minut v po vazbě Ag na tzv. pattern recognition receptory - PRR • PRR jsou přítomny na buňkách přirozené imunity, ale můžou být i humorální PAMP „ Pathogen Associated Molecular Pattern“ • Patogenem asociované molekulové vzory • Vysoce konzervované struktury přítomny na rozsáhlých skupinách mikroorganismů, jsou esenciální pro jejich životní funkce • Nevyskytují se na hostiteli • Peptidoglykany, kyselina lipoteichová, lipopolysacharid bakteriální manany, glukany, • Bakteriální sekvence DNA tvořené cytosinem a quaninem (CpG) a dvoušroubovicovou DNA DAMP „Damage Associated Molecular Patterns“ • Vznikají při poškození infekcí, zánětem, chemickými toxiny, trauma, snížené krevní zásobování • Nesouvisí s buňkami v apoptóze PAMPs and DAMPs © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com PRR- Pattern Recognition Receptors • Váží PAMP a DAMP • Exprese PRR není klonální – receptory přítomné na stejném typu buněk mají stejnou identitu • Připraveny okamžitě reagovat - rychlá odpověď • Schopny diskriminace mezi patogenními a nepatogenními mikroorganismy • Při vazbě patogenu nevzniká imunologická paměť PRP buněk přirozené imunity PRP fungují jako – Receptory pro fagocytózu, kde stimulují pohlcení Ag – Chemotaktické receptory zajišťující postup fagocytujících buněk do místa zánětu – STimulancia - stimulují produkci efektorových molekul a cytokinů, které pomáhají rozvoji přirozené imunitní odpovědi a následně i adaptivní imunitní odpovědi Vrozená imunita Humorální složky Mikrobicidní faktory (lysozym, defensiny, kathelicidiny a další) Histamin, eikosanoidy Komplementový systém Pentraxiny (CRP, SAP, PTX3) Kollektiny (MBL, SP-A, SP-B), Fikoliny Cytokiny (Interferony a,b, g, TNFa, IL-1, IL-6, chemokiny) Molekuly buněčných interakcí Cytokiny Interleukiny (IL-1 – IL-35), IFN, TNF, TGF, CSF Chemokiny (C, CC, CXC,CX3C) Adhezivní molekuly:integriny, selektiny, adresiny Cytokiny • Hlavní regulátory imunitního systému, působící na krátkou vzdálenost prostřednictvím vazby na specifické receptory na povrchu buněk • Jsou produkovány buňkami imunitního systému, mají krátký biologický poločas • Účinek – autokrinní, parakrinní, endokrinní Schéma typů působení cytokinů na druhé buňky Autokrinní Receptor Parakrinní Endokrinní Signál Sekrece cytokinu Céva, krevní oběh Cytokiny • Hlavním producentem je určitá skupina buněk x mohou však být produkovány různými buňkami • Vytvářejí funkční cytokinovou síť • Jeden cytokin má často stimulační i tlumivý efekt • Působí na více oblastí, vlastností – tzv. pleiotropní efekt Funkce cytokinů • Stimulační: – Stimulace T- lymfocytů: IL-2 – Stimulace B-lymfocytů, produkce protilátek: IL-4, IL-5, IL-10, IL-21 – Stimulace makrofágů: IFN-g – Stimulace granulocytů: IL-8, chemokiny – Proliferace progenitorových buněk • Prozánětlivé cytokiny: IL-1, IL-6, IL-18, TNF-a • Regulační: IL-10, IL-13, TGF-b Interferony • Typ I: IFN a, IFN b : jsou produkovány některými buňkami infikovanými viry (hlavně fibroblasty, makrofágy). V cílové buňce inhibují virovou replikaci. • Typ II „Imunní“: IFN g: produkován aktivovanými TH1 buňkami, způsobuje aktivaci makrofágů. Mechanismus účinku interferonu (IFN) Virus Viral nucleic acid New viruses Antiviral proteins bloc viral reproduction Interferon molecules produced Interferon binding simulates cell to turn o genes for antiviral protei Host cell 1 • Infected by virus • Makes interferon • Is kiled by virus Host cell 2 • Entered by interferon from cell 1; • Interferon induces changes that protect it Cytokiny • Uplatňují se v patogenezi: – atopických chorob (IL-4, IL-13 – stimulace tvorby IgE) – Zánětlivé choroby (TNF-a) – Imunodeficity (defekt produkce IFNg, IL-12) • Ale lze je využít i terapeuticky – protinádorová léčba (IL-2, IFN-a) – Léčba sklerózy multiplex (IFN-b) – Léčba některých imunodeficitů (IFN-g) • Soustava asi 30 sérových a membránových proteinů, některé z nich jsou latentní enzymy • Po zakotvení některých složek na povrchu buňky dochází ke štěpení navázaných složek a získání enzymatické aktivity - konvertázy • Kaskádovitě štěpí další složky a posouvají reakci k vtvoření membranolytického komplexu • Odštěpené části složek, které nemají enzymatickou aktivitu, slouží především k opsonizaci • Hlavní složky 9 sérových proteinů C1-C9 • C3 ústřední složka, C3b vazba na mikrobiální povrch, • Terminální produkt komplementové kaskády C5b, C6, C7, C8 a C9 (MAC membrane attack complex) Komplementový systému  klasická - spouštěna vazbou C1q na Fc úsek molekuly IgG nebo IgM, nebo C-reaktivní protein  alternativní - spouštěna bakteriálními produkty nebo jako následek spontánní hydrolýzy C3 složky komplementu regulačními faktory I a H  lektinová - na C1q a na protilátce nezávislá, spouštěna vazbou MBL-mannan • Různorodost aktivačních drah je výsledkem evolučního procesu • Zajištění obranného potenciálu komplementového sytému na přítomnost biologicky rozmanitých mikroorganismů Aktivace aneb cesty komplementového systému Aktivace komplementového systému membranolytický komplex © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Aktivace komplementového systému • Do úrovně složky C5b probíhá cestou enzymatické kaskády • Od aktivované složky C5b dochází k neenzymatickému sestavení komplexu napadajícího membránu - MAC = Membrane Attact Complex • Výsledkem je lýza buňky Membranolytický komplex Komplementový systém - funkce • Proteolytickým štěpením dochází k aktivaci komplementové kaskády – vznik molekul s různými biologickými účinky: • Označení nebezpečných vzorů mikroorganismů - opsonizace (C3b, C4b) • Chemotaxe (C3a, C5a, komplex C567) • Tvorba anafylatoxinů (C3a, C4a, C5a • Osmotická lýza (komplex C5b-C9) Aktivace komplementového systému © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Funkce C1-INH © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Deficience komplementového systému • C1-C4 : častý vývoj systémových imunokoplexových chorob (SLE-like), náchylnost k pyogenním infekcím. • C3-C9: zejména náchylnost k pyogenním infekcím. U deficitu C9 jsou typické opakované meningokové meningitidy. • C1 INH: hereditární angioedém. Hereditární angioedém • Způsoben deficitem C1 INH,dominantně dědičný • Při traumatech, stomatologických výkonech, infekcích, menstruaci dochází k nekontrolované aktivaci komplementového systému • Vazoaktivní peptidy způsobují zvýšenou vaskulární permeabilitu se vznikem edémem; terčem terapie může být bradykinin • Klinické příznaky- nesvědivé kožní otoky, dechové obtíže, průjmy, křeče v břiše Imunochemické vyšetření jednotlivých složek komplementového systému • C3 (0,7 – 1,5 g/L) • C4 (0,1 – 0,4 g/L) • C1-INH (210-390 mg/L); + funkční test • C1q (100-250 mg/L), C2 (10 – 30 mg/L), C5 (80 – 170 mg/L) • MBL (0,3 – 3,5 mg/L) Lektin vázající manózu (MBL) • Po vazbě na manózové zbytky na povrchu baktérií aktivuje C2 a C4. • Asi u 25% populace lze prokázat heterozygótní deficit. • Deficit MBP je asociován s vyšší frekvencí banálních infekcí a komplikací při cytostatické léčbě. Vrozená imunita Celulární složky Epitelové a endotelové buňky, erytrocyty, destičky Mastocyty, eosinofily, basofily NK buňky (natural killer cells) Profesionální fagocyty (neutrofilní leukocyty – „mikrofágy“, mononukleární fagocyty – „makrofágy“) Dendritické buňky (buňky presentující antigeny) Neutralizace chemokinů, odstraňování komplexů Ag-Ab, zpomalení pohybu leukocytů v kapilárách zvyšují adhezi na endotel, krevní skupiny, Rh- faktor Obsahují denzní tělíska (ADP, serotonin, histamin) a alfa granule (cytokinů, chemokinů, růst.faktorů) - modulace zánětové odpovědi Krátce žijící buňky, v cytoplazmě četná granula obsahující histamin, proteoglykany, interleukiny (IL-4, IL-13) – časná fáze zánětové reakce, Váží IgE – degranulace - rozvoj zánětu Krátce žijící buňky 10-20h – v periferní krvi, delší životnost v tkáních sliznice dýchacího, trávicího a močopohlavního ústrojí; Receptory pro Ig, chemokiny, cytokiny složky komplementu… v cytoplazmě četná granula obsahující kationické proteiny (ECP), cytokiny (IL-3,IL-5, TNF-alfa…) chemokiny, úloha v časné fázi zánětu Celulární složky vrozené imunity Mastocyty Lokalizovány perivaskulárně a v blízkosti neuronů Dlouhožijící buňky Jsou aktivovány IgE a antigeny, imunokomplexy, cytokiny, anafylatoxiny, hormony, neurotransmitery Sekretují řadu vasodilatačních a prozánětlivých mediátorů – preformovaných (histamin, kininy, proteasy) i nově syntetizovaných (leukotrieny, prostaglandiny, NO, cytokiny –zejm. TNFa) Důsledek – akumulace buněk přirozené imunity (neutrofily, eosinofily, monocyty-makrofágy a lymfocyty Účast v reparačních procesech Jsou jednou z nejvýznamnějších součástí vrozených obranných imunitních mechanismů. 1. jsou morfologicky podobné lymfocytům ,nefagocytují, nemají adherenční schopnosti specializují se na zabíjení abnormálních vlastních buněk organismu nápadných nízkou expresí MHC molekul (např. infikovaných viry, intracelulárními bakteriemi, nádorové buňky) cytotoxické nástroje NK buněk – perforin a granzym – podobně jako u CD8+ cytotoxických buněk jejich cytotoxická aktivita je jednak přirozená, jednak může být zprostředkována protilátkami vázanými na FcR III (CD16), ADCC ovlivňují vrozenou i adaptivní imunitu svými cytokiny, především IFNg a TNFa NK (Natural Killer) buňky Funkce NK buněk © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Buňky NK Aktivace NK-buněk je regulována souhrou signálů, které vycházejí z aktivačních a inhibičních receptorů. • Inhibiční receptory (KIR) se váží na molekuly MHC I, které jsou přítomny na většině zdravých buněk. • Aktivační receptory (KAR) poznávají heterogenní skupinu ligandů, které se objeví na buňkách v důsledku stresu, maligní konverse, virové infekce. Řada genů, které ovlivňují funkci NK, jsou shluknuty na chromosomu 12 („natural killer gene complex – NKC“) c Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) Fc receptor Virus-infected Cell NK Cell perforin granzyne IgG Fab Fc Epitope PROFESIONÁLNÍ FAGOCYTY Polymorfonukleární leukocyty (neutrofilní granulocyty) „mikrofágy“ (I. Mečnikov, 1845-1916) Mononukleární fagocyty (v krvi i ve tkáních) „makrofágy“ (I. Mečnikov) • Neutrofilní granulocyty a eosinofilní granulocyty • Monocyty a makrofágy • Fyziologická funkce: » 1. pohlcení - ingesce » 2. nitrobuněčné zabití - cidie » 3. odstranění - eliminace • Antimikrobiální systémy: » 1. závislý na kyslíku » 2. nezávislý na kyslíku Fagocytóza Adherence fagocytované čáetice k membráně fagocytující buňky Tvorba psudopodií, které postupně obalují fagocytovanou částici Tvorba fagosomu Splynutím fagosomu a lysozomu vzniká fagolysosom Uvnitř fagolysosomu dochází k usmrcení a degradaci fagocytovaného materiálu Nedegradovatelný materiál je uvolněn z buňky Lysosom Fagocytóza Zabíjecí mechanismy fagocytujících buněk 1. závislý na kyslíku Reaktivní metabolity kyslíku (H2O2, HOCl-, hydroxylový radikál, superoxidový aniont, singletový kyslík(O2) Reaktivní dusíkové metabolity (NO, NO2) Hydrolázy: proteázy, lipázy, DNAsy, RNAsy 2. nezávislý na kyslíku Nízké pH Lysozym Lactoferin Defenziny – antimikrobiální polypeptidy Indikace k vyšetření fagocytárních schopností granulocytů • Především opakované hluboké abscesy, hnisavé lymfadenitidy, případně i první epizoda abscesu v neobvyklé lokalizaci (jaterní absces). Obtíže jsou vrozené, tj. objevují se obvykle od časného věku. • Výskyt solitárních, granulomů v časném věku. • Poruchy odhojování pupečníku spojené s poruchou hojení ran a výraznou leukocytózou (LAD syndrom). Možnosti vyšetření fagocytárních funkcí Chemotaxe: vyšetření chemotaxe pod agarózou Ingesce: ingresce metakrylávých partikulí Tvorba reaktivních metabolitů kyslíku: NBT test (nitro-blue-tetrazolium test), chemiluminiscence, redukce tetrarhodamidu – cytometrické stanovení Vyšetření exprese b2-integrinů Komplexní vyšetření: mikrobicidie • Příčinou syndromu je porucha syntézy CD18, nevytváří se komplex CD11/CD18 – integriny nutné k přechodu cév do místa zánětu. • Opožděné odhojování pupečníku s omfalitidou. • Abscesy s malou tvorbou hnisu. • Často postižena periproktální oblast, objevují se gingivitidy, lymfadenitidy, kožní infekce. • Porucha hojení ran. • V krvi výrazná leukocytóza i mimo akutní infekci. Deficit leukocytárních integrinů (LAD-I) Chronická granulomatózní choroba • Opakované abscesy nejčastěji postihující játra, periproktální oblast, plíce, objevují se hnisavé lymfadenitidy, osteomyelitidy. • Granulomy mohou působit útlak, například žlučovodů. • Většinou poměrně časný nástup obtíží, první příznaky se však vzácně mohou objevit i v dospělosti. • Příčinou je porucha tvorby reaktivních metabolitů kyslíku. Chronic Granulomatous Disease (X-linked) Cesta leukocytů do místa zánětu © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Zánět • fylogeneticky stará a monotónní obranná reakce • efektorový mechanismus nejen vrozené , ale i adaptivní imunity • rozvoj zánětu: – rozpoznání nebezpečného podnětu – vyhodnocení charakterů podnětu a rizika – vylití granul, transkripce genů, .. • každý zánět má imunopatologickou složku Zánětkomplexní obranná reakce systému vrozené imunity • na infekci bakteriální, virovou, parazitární, • na poškození tkání fyzikálními a chemickými faktory • na efektorové stadium adaptivní imunitní reakce Směřuje k odstranění škodliviny a k obnově poškozených struktur a funkcí Zánět • rychlá odpověď organismu na poškození tkání, (neimunologický podnět) • nebo infekci (imunologický podnět) • vede k lokalizaci onemocnění • Eliminace případné infekce • zahojení • Reakce organismu může být místní nebo celková – závisí na rozsahu poškození a délce trvání Dva druhy zánětu • Akutní zánět – fyziologický proces: – Odezní bez důsledků, dochází ke zhojení poškozené tkáně • Chronický zánět – patologická reakce – Patologický, dochází k destrukci tkáně, nahrazování vazivem a vede k trvalému poškození Průběh zánětlivé reakce • Fagocyty a tkáňové žírné buňky – uvolnění obsahu granulí do okolí • Látky uvolněné z poškozených buněk – • Důsledek - zvýšení peremaibility cév – tzn. prostup plazmatické tekutiny do extravaskulárního prostoru a vzniká otok Klasické známky zánětu • Bolest • Zarudnutí • Otok • Horečka Zánět - průběh • Zvýšení adhezivity endotelií expresí adhezivních molekul – zachycení fagocytů a lymfocytů – jejich průnik do tkáně • Altivace koagulačního, fibrinolytického, komplementového a kininového sytému • Ovlivnění místních nervových zakončení (bolest) • Změny regulace teploty (některé mediátory působí jako pyrogeny) Vliv prozánětlivých cytokinů • Uplatňuje se zejména IL-1, IL-6 a TNF-a. • Ovlivěním hypotalamického centra termoregulace se zvyšuje tělesná teplota – Aktivátor metabolických pochodů v buňkách IS: indukce exprese heat shock protein (HSP) (pomoc při skládání nativních nově syntetizovaných proteinů do správných konformací) • Aktivace osy hypothalamus – hypofýza nadledinky – mobilizace tkáňového metabolismu • Cytokiny se dostávájí do oběhu – stimulace sérových proteinů tzv. “proteinů akutní fáze”. • Klesá sérová hladina Fe a Zn. • Objevuje se únavnost, ospalost, nechutenství. Hlavní události v místě zánětu • Hlavní roli hrají složky nespecifické imunity – Vznik vasoaktivních a chemotaktických látek, často produktů aktivace komplementového systému. – Zvýšený přítok krve do místa zánětu. – Příliv zánětotvorných buněk, zejména granulocytů a makrofágů. – Zvýšená cévní permeabilita vede k přechodu bílkovin do extravaskulárních prostorů. Iniciace zánětlivé odpovědi people.eku.edu/ritchisong/301notes4b.html Laboratorní známky zánětu • leukocytóza, • zvýšená FW • zvýšené hladiny reaktantů akutní fáze • snížené hladiny železa a zinku v plazmě Proteiny akutní fáze • Jejich hladina se zvyšuje v dob akutního zánětu • Jsou produkovány hlavně játry pod vlivem IL-1, IL-6, TNF-a • Nejznámější a diagnosticky nejčastěji využívaný: C-reaktivní protein (CRP) • Další: součásti komplementového systému, alfa-1-antitrypsin, sérový amyloid A, fibrinogen… Proteiny akutní fáze Opsonizace – CRP – C-reaktivní protein – SAP – sérový amyloid – Složky komplementu C3, C4 CRP a SAP váží nukleoproteiny vzniklé při rozpadu tkání a napomáhají jejich odstraňování fagocytózou Zvýšená syntéza: sérových transportních proteinů: ceruloplazmin, feritin Antimikrobiláních proteinů – hepcidin Snižuje se tvorba albuminu, prealbuminu, transferinu Mediátory zánětlivé odpovědi • IL-1, IL-6, TNF-a - celkové zánětlivé příznaky • IL-1, TNF-a, IL-18 - lokální aktivace buněk imunitního systému • IL-8, leukotrieny, prostagladiny, C5a- chemotaxe. • Histamin, serotonin, metabolity kys. arachidonové vazodilace, ovlivnění permeability. Monitorování akutního zánětlivého procesu Tělesná teplota Sedimentace erytrocytů (FW) Počet leukocytů v krvi Změny spektra sérových bílkovin v elektroforéze (pokles albuminu, vzestup a1 a a2 globulinů) Sledování hladin proteinů “akutní fáze” Prezentace Ag • Antigeny jsou molekuly, které vyvolají imunitní odpověď. • Antigeny jsou většinou proteiny či glykoproteiny, nebo polysacharidy. • Antigeny pocházející z vnějšího prostředí se do organismu dostanou přes gastrointestinální trakt, respirační trakt, kůži nebo arteficiálně např. injekčně. • Antigeny vnitřní se nacházejí přímo v buňkách, může se jednat např. o proteiny kódované virovými geny nebo proteiny kódované mutovanými geny v nádorově změněných buňkách. Antigen prezentující buňky • Konstitutivní: – Dendritické buňky – Monocyty, makrofágy – B-lymfocyty • Inducibilní: – Vaskulární endotelové buňky – Epitelové a mezenchymální buňky Dendritické buňky • Jsou mostem mezi přirozenou a adaptivní imunitou • Presentace antigenů T lymfocytům – adaptivní imunitní reakce • Zdroj kostimulačních signálů • Podpora vrozené imunity (interakce s NK, NK-T, T-lymfocyty γδ) APC © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Adaptivní imunita: charakteristické rysy Specifičnost: Přirozená imunita: Jsou rozeznávány struktury, které jsou stejné u řady cizorodých agens (PAMP) Adaptivní imunitní systém naproti tomu poznává a odlišuje různé epitopy antigenů (T-, B-) Adaptivní imunita: specifičnost Všechny fáze adaptivní imunitní reakce (poznání antigenu, aktivace lymfocytu, efektorové mechanismy) jsou zaměřeny na konkrétní antigenní determinantu (epitop) Lymfocyt má genetickou informaci pro jeden „antigenní receptor“ zajišťující tvorbu tisíce identických kopií tohoto receptoru. Adaptivní imunita: charakteristické rysy Rozsah repertoáru: Adaptivní imunitní systém je schopen odlišit (TCR, BCR lymfocytů) více než 107-8 epitopů antigenů. • Schopnost poznat různé antigeny je takřka • neomezená. Odhaduje se, že adaptivní imunitní systém dokáže odlišit cca 1012 -15 epitopů. • Příčiny diverzity: • Somatické rekombinace (somatické přeskupování genů). • Mutační mechanismy. Vrozená imunita: charakteristické rysy Autoreaktivita: Adaptivní imunita se vytvořila k poznávání „cizích “, mikroorganismů, ale také vlastních molekul. Paměť: Vytvoření imunologické paměti je pro adaptivní imunitu příznačné – primární a sekundární reakce, „booster“. Adaptivní imunita: charakteristické rysy Receptory: U adaptivní imunity receptory lymfocytů T a B vznikají somatickým přeskupováním genů. Lymfocyty T a B jsou základními operačními jednotkami adaptivní imunity • T-lymfocyty jsou zaměřeny na intracelulární antigeny • T-lymfocyty ovlivňují další buňky především působením cytokinů • B-lymfocyty na extracelulární antigeny • B-lymfocyty produkují imunoglobuliny Vývoj lymfocytů v thymu Kostimulační signály nutné pro aktivaci T lymfocytu © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Vazba CD40 – CD40L © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Th1, Th2 a Th17 lymfocyty © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Cytotoxické T-lymfocyty • Jsou CD8+ • Rozeznávají cizorodý antigen prezentovaný na HLA-I antigenech. • Cytotoxicky působí perforin, dále různé mechanismy indikující apoptózu cílové buňky (granzymy, FasL, lymfotoxin). • Jsou i důležitými producenty cytokinů (Tc1 a Tc2 buňky) Diferenciace efektorových cytotoxických T lymfocytů © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Mechanismy „zabíjení“ cytotoxických T lymfocytů © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com B lymfocyty • základními buňkami specifické humorální imunity • primární funkce - produkce protilátek – imunoglobulinů (Ig) • Ig- zaměřeny proti mikroorganismům nebo jejich toxinům působících v tělních tekutinách či dutinách tj. mimo buňky BCR receptor • Skládá se ze dvou identických těžkých řetězců a dvou identických lehkých řetězců • Na každém řetězci jsou variabilní a konstantní oblasti © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Protilátky • Ig existují ve dvou formách: – membránově vázané na povrchu B-lymfocytu , kde fungují jako receptor pro antigen – sekretované , které jsou v cirkulaci, tkáních, mukóze – jsou sekretovány plazmatickými buňkami, které vznikají z B-lymfocytu po jeho aktivaci a další diferenciaci – Vážou se na Ag a aktivují efektorové mechanismy vedoucí k eliminaci Ag B-lymfocytární subpopulace © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Izotypový přesmyk a funkce jednotlivých Ig © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Folikulární Th lymfocyt Efektorové funkce protilátek © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Adaptivní imunita: paměť Zvýšení imunitní reakce po opakovaném setkání s původním antigenem. Klonální selekce – klonální expanze Diferenciace: terminální efektorové buňky dlouze žijící paměťové buňky Imunitní reakce primární sekundární (anamnestická,“booster“) Imunitní protilátková odpověď © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com Protilátky – imunoglobuliny (Ig) • Peptidoglykany • Tvar molekuly Y • Dva těžké a dva lehké řetězce spojené disulfidickými můstky • Variabilní část – vazba Ag • Konstantní část - určuje příslušnost Ig do třídy: - existuje 5 tříd Ig: IgA, IgG, IgD, IgE a IgM Vazba Ag a protilátky • Nevazebné interakce – Vodíkové můstky – Iontové interakce – van der Waalsovy síly – Dipol-dipol • Interakce mezi antigenem a protilátkou závisí na pH, iontové síle a přítomnosti dalších látek např. detergentů, chelatotropních činidel … Imunochemické metody • Podstatou je interakce Ag a protilátky (Ig) in vitro za tvorby imunokomplexů • Možnost stanovit přítomnost a koncentraci jak protilátek tak antigenů • Reakce je vysoce specifická, tj. vysoce citlivá • Může vznikat precipitát, aglutinát či imunokomplex • Pro provedení těchto reakcí potřebujeme předem připravené protilátky – tzv. antiséra Rozdělení imunologických laboratorních metod serologické (humorální) - detekce antigenů a protilátek, tvorba protilátek proti infekčnímu agens buněčné - počty a funkce jednotlivých typů leukocytů Adaptivní imunita: autotolerance Lymfocyty, které by poznávaly „vlastní“ antigeny jsou buď odstraněny nebo inaktivovány. Imunologická tolerance centrální. Imunologická tolerance periferní. Prolomení tolerance – autoimunizace. IMUNOLOGICKÁ TOLERANCE CENTRÁLNÍ – T lymfocyty • thymus – negativní selekce – B lymfocyty • kostní dřeň – negativní selekce PERIFERNÍ (T- i B-) Anergie k úplné aktivaci lymfocytů chybí druhé, kostimulační signály Suprese reaktivita lymfocytů je tlumena tzv. Treg Destrukce nebo inaktivace lymfocytů s BCR nebo TCR, které poznávají a váží epitopy vlastních antigenů Lymfocyty T i B primárně neodlišují vlastní a cizí   thymus kostní dřeň lymfocyty namířené proti vlastním antigenům jsou odstraněny při „negativní selekci“ apoptózou  centrální tolerance lymfocyty namířené proti vlastním antigenům proniknuvší do periferie jsou utlumeny (anergie, suprese)  periferní tolerance prolomení tolerance   nevhodné geny nevhodné prostředí determinující specifickou zevní i vnitřní reaktivitu na autoantigeny i obecnou vnímavost k autoimunitním reakcím  AUTOIMUNITNÍ CHOROBA Downloaded from: StudentConsult (on 18 July 2006 11:40 AM) © 2005 Elsevier Imunopatologické reakce humorální - s účastí IgE protilátek • Atopie – reakce typu 1 nebo též přecitlivělost časného typu • K reakci dochází velmi rychle po setkání s Ag (minuty) • Spojen s tvorbou IgE proti některým antigenům alergenům z vnějšího prostředí: – složky pylových zrnek – antigeny roztočů z domácího prachu – potravinové antigeny – zvířecí srst – Většina alergenů proteiny nebo glykoproteiny s enzymatickou aktivitou ALERGICKÁ PŘECITLIVĚLOST neboli přecitlivělost prvního typu Zprostředkovaná IgE -atopická • atopie je individuální nebo rodinný sklon k tvorbě protilátek IgE již na malá množství alergenů, obvykle proteinů • typické projevy – senná rýma, bronchiálního astma rhinokonjunktivitida • syndromu alergického ekzému/dermatitida neatopická • hmyzí jed, helmintózy, léky,… Type-I hypersensitivity • Při prvním setkání s alergenem je daný alergen rozeznám imunitním systémem jako Ag, dojde k aktivaci IS a tvorbě IgE protilátek a alergeny se naváží svým Fc koncem na Fc epsilon receptory žírných buněk. • Při dalším setkání s alergenem dojde k vazbě alergenu na navázané IgE na žírných buňkách, to způsobí pohyb Fc epsilon receptorů na membráně, jejich konformační změnu, což všechno v důsledku vede k aktivaci žírné buňky, tj. vyplavení mediátorů připravených v žírné buňce, které ovlivní okolní tkáně a buňky. Diagnostika atopické přecitlivělosti • Anamnéza • Celkový a specifický IgE • Eosinofilie • Specifické IgE • Test aktivace bazofilů • Eosinofilní kationický protein v séru • Kožní testy • Provokační a eliminační testy • Vyšetřování NO ve vydechovaném vzduchu Nejčastější alergeny • Inhalační: – Pyly – traviny, stromy, plevele – Roztoči domácího prachu – Zvířecí alergeny – Plísně • Potravinové – Mléko – Vejce – Ořechy – Mořské plody • Léky – Penicilinová antibiotika, lokální anestetika • Injekční – Jed blanokřídlého hmyzu ALERGENY-taxonomie první tři písmena=rod další písmeno=druh arabské číslo=identifikační pořadí Phl p 1-13 Phleum pratense (bojínek, timotejka) Bet v 1-7 Betula verrucosa (bříza) Asp f 1-34 Aspergillus fumigatus Der f 1-22 Dermatophagoides pteronyssimus - (roztoči) Fel d 1-7 Felis domesticus Api m 1-10 Apis mellifera (Celer) Ara h 1 Arachis hypogaea (burský ořech) Alergeny vyvolávající pozdní typ přecitlivělosti • Reaktivní chemikálie obsažené v lécích, kosmetických výrobcích, nátěrových hmotách, soli některých kovů silice rostlin • Vznik kontaktní alergie – diferenciace do Th1 lymfocytů Alergeny mohou způsobovat různou reakci • Většina alergenů proteiny nebo glykoproteiny s enzymatickou aktivitou • Komplexní organické sloučeniny – protilátková odpověď • Anorganické látky (kovy) – buněčná odpověď Autoimunitní choroby Autoimunitní choroby • onemocnění, při kterém autoprotilátky nebo autoreaktivní T-lymfocyty vedou k poškození vlastních buněk nebo tkání • postihují 5-7% populace, především ženy Autoimunitní choroby Systémové Orgánově specifické Řada onemocnění má intermediární charakter s postižením několika orgánů. Serologická diagnostika autoimunitních chorob • Vnitřní stimulace imunitního systému • V jejím důsledku vznikají autoprotilátky • Jsou zaměřeny proti tělu vlastním tkáním • Způsobují zánětlivou reakci • Protilátky jsou zaměřeny proti: – orgánům – tkáním – trombocytům Patogenetické mechanismy autoimunity Pět fází: • Fáze predispozice • Iniciace lokální imunologické reaktivity • Nekontrolovaná produkce autoreaktivních T- a B-lymfocytů spojená s vytvořením autoprotilátek • Efektorová fáze • Udržování choroby Prevalence autoimunitních chorob (Mackay IR, BMJ 2000; 321: 93-96) Choroby štítné žlázy: > 3% dospělých žen Revmatoidní artritida: 1% celkové populace, převaha žen Primární Sjögrenův syndrom: 0,6-3% dospělých žen Systémový lupus erytematosus: 0,12% celkové populace, převaha žen Roztroušená skleróza: 0,1% celkové populace, převaha žen Diabetes I. typu: 0,1% dětí Primární biliární cirhóza: 0,05-0,1% žen středního a staršího věku Myasthenia gravis: 0,01% celkové populace, převaha žen Klasifikace autoimunitních chorob • Systémová: Lupus Erythematodus, Sklerodermie, Revmatoidní artritida • Orgánově specifické: Hashimotova choroba, Perniciózní anémie, Addisonova choroba • Přechodný typ: Myastenia Gravis, Idiopatická leukémie, Juvenilní Diabetes Diagnostika AIO obecně Klinika Nález autoprotilátek Histologický nález Laboratorní diagnostika autoimunitních chorob • ELISA • NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE (IF) • IMMUNOBLOTING (IB) Serologické metody 1. Klasické serologické metody - Aglutinace (přímá / nepřímá) - Precipitace (v kapalině, v gelu) 2. Imunochemické metody s následnou detekcí - Imunofluorescence (přímá / nepřímá) - Imunoanalýza (EIA-ELISA, RIA, FIA, LIA) - Imunoblot, imunodot 3. Metody založené na efektorovém účinku protilátek (využívané v klinické mikrobiologii) - Komplement fixační reakce - Inhibiční a neutralizační testy Imunofluorescence • Luminiscence Jev, při kterém látka emituje záření po absorpci excitačního záření (Fotoluminiscence) nebo při chemické reakci (Chemiluminiscence) Fluorescence emise záření krátce po excitaci (10-8 až 10-5 s) Fotoluminiscence Fosforescence emise záření trvá delší dobu (10-2 s až dny) Zdroj: www.chemiaasvetlo.sk/teoria /chemiluminiscencia/ Zdroj: www.infobiologia.net/2017/01/bioluminiscencia-animales-bacterias.html Základní princip Inkubace → promytí Inkubace → Promytí → Krycí sklíčko Konjugát • Protilátka s navázaným fluorescenčním barvivem (fluorochromem) • Nejčastěji používaný fluorochrom je FITC (fluoresceinizothiokyanát) excitační/emisní vlnová délka 495/520 nm (zelené světlo) • Konjugát je určen na specificky vazbu pro určitou třídu imunoglobulinů (IgG/IgA) – výběrem konjugátu stanovíme protilátky jen této třídy • Pro některé autoimunitní onemocnění má klinický význam výskyt autoprotilátek v izotypové třídě IgA (např. celiakie) Imunofluorescence Antigenní substráty používané při nepřímé IF  Buňky HEp2 (Human Epithelial) – detekce ANA - odvozené z linie HeLa (karcinom děložního čípku) - rychle se dělící buňky, v mitóze pozorovatelná chromatinová destička – důležitý znak pro odlišení jednotlivých typů ANA  Neutrofilní granulocyty – detekce ANCA  Crithidia luciliae – prvok, detekce protilátek proti dsDNA  Opičí jícen – detekce EMA  LKS (liver, kidney, stomach) – detekce AMA, ASMA, GPC, RET, ... - kombinace 3 krysích tkání: játra, ledviny, žaludek ANA (Anti Nuclear Antibodies) • Velká skupina protilátek • Váží se na různé antigeny v jádře (DNA, RNA, centromery, ...) • Výskyt při různých autoimunitních onemocněních (systémový lupus erytematodes, Sjögrenův syndrom, revmatoidní artritida, ...) Fluorescenční obraz v mikroskopu může vypadat stejně nebo podobně u různých protilátek – pokud vidíme určitý obraz, nevíme ještě, o jakou autoprotilátku se jedná (na jaký antigen se váže), k jejímu bližšímu určení mohou pomoci jiné metody (ELISA, ImunoBlot) Antinukleární autoprotilátky (ANA) • Reagují a molekulovými terči přítomnými v jaderném aparátu buňky • Výskyt u systémových nemocí • Infekce EBV, CMV • Výskyt roste asymptoticky s věkem • Většinou imunofluorescenční stanovení na Hep-2 buňkách – buněčná linie odvozená od lidského karcinomu • Vyšetření IF 142 Schéma Hep-2 buňky 143 Typ: Homogenní antigen : histony - bazické proteiny asociované s DNA polynukleotidy - dsDNA, ssDNA Ku - DNA vazebný protein klinické asociace : SLE, léky indukovaný lupus, RA 144 negativní obraz 145 HOMOGENNÍ Polynukleotity - dsDNA, ssDNA Histony - H1,H2A,H2B, H3,H2A-H2B komplex Laboratorní diagnostika autoprotilátek Fluorescenční obraz na Hep-2 Laboratorní diagnostika autoimunitních chorob • ELISA • NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE • IMMUNOBLOTING Autoprotilátky - RF • Revmatoidní faktory – rozpoznávají epitopy na Fc části molekuly IgG • Imunopatologická zánětlivá reaktivita v kloubech • Vytváření komplexů s autologními IgG, vazba na Fc fragment na makrofázích, tvorba prozánětlivých cytokinů – zánět • Podobné stafylokokovému proteinu A Antifosfolipidové protilátky • Vznikají při infekčním poškození vlastních tkání – odhalují se fosfolipidové struktury, které by byly normálně nedostupné – charakter autoAg • Protilátky vznikají proti: – Kardiolypinu – Fosfatidylserinu – Etanolaminu – Kys fosfatidové – β2 glykoprotienu Prevalence protilátek proti štítné žláze Onemocnění TSH T3 T4 Anti-TPO Anti-TG Anti – TSH-R Hashimotova thyreoiditida ↑ (↓) ↓ 60-90% 30-40% 0% Graves- Basedowova choroba ↓ ↑ ↑ 60-70% 10-20% 80-100% Normální populace - - - 5-15% 4-8% 0% Stanovení autoprotilátek: ELISA – metody Imunitní reakce na nádorové buňky • Akutní zánět DAMP nádoru – prozánětlivé cytokiny, ROI, RNI destrukce nádorových buněk, útlum angiogenese a metastatické schopnosti • Buňky NK • Buňky NKT • T-lymfocyty g/d, a/b • Lymfocyty B Stimulace imunitní odpovědi u nádorů vede k • Zničení klonů nádorových buněk • Odstranění nádoru X • Nádorové buňky vznikají z vlastních buněk • Malá exprese Ag • Slabá imunogennost • Silná imunitní odpověď vzniká pouze u onkogenních virů Imunitní systém a maligní nádor Imunologická úprava nádoru (cancer immunoediting): Stadium imunitního dozoru (immunological surveillance) – eliminace maligně transformovaných buněk. Vytvoření rovnováhy mezi imunitním systémem a nádorem, selekce rezistentních mutantů – populace nádorových buněk konstantní, pod úrovní klinické detekovatelnosti Imunitní systém není schopen buňky eliminovat, může trvat až 10 let( melanom, nádor prsu) Únik maligních buněk před imunitními reakcemi – klinicky detekovatelné Klonálně expandující nádorové buňky jsou geneticky značně nestabilní a snadno u nich dochází k chromsomálním aberacím Cancer immunoedition Dunn GV, Bruce AT, Ikeda H, Old LJ, Schreiber RD: Nature Immunology 2002; 3:991-998 Buněčná imunita proti nádorům • Ag nádorových buněk zachyceny APC • Prezentace Ag na komplexech MHC-II. třídy • Komplex MHC II.třídy a peptid – rozpoznán CD4+ T-lymfocyty • Aktivované T-lymfocyty – produkce cytokinů, které jsou 2.signálem pro konečnou diferenciaci cytotoxických CD8+ T-lymfocytů NK - buňky • NK buňky (natural killers, přirození zabíječi) • In vitro : lýza buněk napadených viry i nádorových b. • Cíl: – Buňky, které neexprimují MHC I.třídy – buňky, které jsou obaleny IgG protilátkami • Aktivitu NK buněk zvyšují IL-2 a IL-12 Poruchy imunity • Rozpoznávání vlastního od cizího – při poruše autotolerance = autoimunitní onemocnění • Rozpoznávání pozměněných buněk – při poruše imunitního dohledu = nádorová onemocnění • Rozpoznávání škodlivého a neškodného – při poruše obranyschoposti = atopie, alergie, imunosuprese, imunodeficience Zvýšená vnímavost k infekčním agens Náchylnost k maligním procesům Autoimunitní projevy Dysregulace imunitního systému IMUNODEFICIENCE PRIMÁRNÍ (VROZENÉ) SEKUNDÁRNÍ (ZÍSKANÉ) Varovné známky primárních imunodeficiencí -Otitis media osmkrát a častěji za rok -Pneumonie alespoň dvakrát do roka -Opakující se infekce hluboko v tkáních nebo na neobvyklých místech (svaly, játra) -Infekce vyvolané oportunními mikroby -Abnormální reakce na živé vakcíny -Neúspěch cílené antibiotikoterapie -Rodinná anamnéza Klinická manifestace imunodeficiencí • Častý výskyt závažných infekčních komplikací: pneumonie (nejméně 2x ročně), otitis media (až 8x ročně) sinusitidy, meningitidy, abscesy hluboko v tkáních nebo na neobvyklých místech – svaly, játra. • Infekce mohou být způsobeny atypickými agens (oportunními patogeny). • Infekce špatně odpovídají na konvenční léčbu antibiotiky. • Zvýšená frekvence banálních infekcí. • Abnormální reakce na živé vakcíny • Častěji než v běžné populaci se objevují některá nádorová onemocnění. • Rodinná anamnéza Vyšetřované parametry v imunologické laboratoři • Hladiny imunoglobulinů • Hladiny C3, C4 složek komplementu v séru • Aktivace komplementu klasickou a alternativní cestou • Zastoupení lymfocytárních subpopulací • Proliferační schopnosti, produkce cytokinů • Burst test • Myeloperoxidáza