METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracovala Mgr. Navaříková vytvořilo CMBG FN Brno [USEMAP] - VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT – prenatální a postnatální vyšetření (periferní krev) - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (vznikajících v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí na člověka) – postnatální vyšetření (periferní krev) - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT (u onkologických onemocnění) (kostní dřeň, periferní krev, tkáň solidních tumorů) TYPY CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT [USEMAP] DETEKCE VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT vyšetření metodami klasické cytogenetiky + následně metodami molekulární cytogenetiky Standardní vyšetřovací postup pro postnatální stanovení karyotypu: Prenatálně také stanovujeme karyotyp v indikovaných případech, ale metodami první volby jsou v dnešní době metody molekulární diagnostiky. [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování / barvení chromosomů •pruhovací metody umožňují individuální diferenciaci jednotlivých chromosomů, (byly zavedeny v letech • 1968 -71) •do té doby bylo možné pouze obarvit chromosomy konvenčně a seřadit je do skupin podle velikosti a polohy centromery •ke klasifikaci chromosomů byl mezinárodně přijat jednotný systém, který vychází z identifikace lidských chromosomů pruhovacími a barvícími postupy • [USEMAP] •ISCN – An International System for Human Cytogenetic • Nomenclature – Mezinárodní cytogenetická • nomenklatura • METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování / barvení chromosomů - charakteristika normálního a patologického karyotypu - techniky pruhování a barvení chromosomů - pruhovací vzory chromosomů s G – pruhy - vzory zápisů chromosomových změn - další cytogenetické informace [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů G – pruhování •nejčastěji rutinně užívaná metoda •chromosomy jsou vystaveny účinkům trypsinu (proteolytický enzym), který natráví chromosomové proteiny na povrchu chromosomů •chromosomy obarvíme Giemsovým barvivem •výsledek – každý chromosom se specificky obarví (střídavé tmavé a světlé příčné proužky různé tloušťky, tmavé proužky jsou bohatší na adenin a thymin, světlé na cytozin a guanin) •získané pruhy jsou specifické pro každý chromosomový pár •lze snadno rozpoznat strukturní a numerické abnormality • [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G – pruhování chromosomů normální mužský karyotyp 46,XY norm mužský [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Q - pruhování chromosomů •první pruhovací technika popsaná • Casperssonem a kol. (u lidských chromosomů • v r. 1971) •barvení fluorochromem quinacrinem (alkylační a interkalační látka), je možné použít i jiné fluorochromy (Hoechst 33258, DAPI, DIPI) •díky barvení quinacrinem získáme charakteristický pruhovací vzor pro jednotlivé chromosomové páry, který je analogický ve srovnání s G-pruhováním. Střídají se pruhy s intenzivní fluorescencí (AT bohatší – na G-pruhování tmavé) a nízkou fluorescencí (GC bohatší – na G-pruhování světlé). •nevýhody – je třeba fluorescenční mikroskop a při delší expozici UV záření fluorescence slábne •Q-pruhování bylo postupem času nahrazeno G-pruhováním, které nabízí lepší rozlišení jednotlivých bandů, preparáty jsou stabilnější a analýza se provádí ve světelném mikroskopu Q pruhy [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY R - pruhování chromosomů •předpokládaný mechanismus působení - dochází k denaturaci DNA chromosomů v AT bohatých regionech působením vysoké teploty před obarvením Giemsovým barvivem •R = reverse (opačný), tzn. R – pruhy jsou opačné ke G - a Q – pruhům (kde jsou G – a Q – pruhy světlé, tam jsou R – pruhy tmavé a opačně) R v karyotypu [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY C – barvení (pruhování) chromosomů speciální barvící techniky •vizualizace konstitutivního •heterochromatinu •(oblasti centromer, •pericentromerické oblasti •některých chromosomů 1, 9, 16, •koncová část q ramen •chromosomu Y) • • - metoda založena • na denaturaci DNA působením • různých agens (HCl, Ba(OH)2) • a následné reasociaci v teplém pufru • C v karyotypu [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY C – barvení chromosomů speciální barvící techniky Na obrázku vlevo byly metodou C barvení potvrzeny 2 nálezy. Pericentrická inverze na chromosomu 9, která zahrnuje centromeru a heterochromatinovou oblast pod ní, došlo ke změně polohy centromery na chromosomu a heterochromatin se přemístil na krátká raménka chromosomu. Byla také potvrzena délka heterochromatinové oblasti na chromosomu Y, delší heterochromatin Yqh+. Na obrázku vpravo je naopak chromosom Y s krátkou heterochromatinovou oblastí Yqh-. [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů speciální barvící techniky •navázání zrn stříbra na aktivní oblast organizátoru jadérka (sekundární konstrikce akrocentrických chromosomů) •stříbro se vyloučí z AgNO3 • za vyšší teploty a v kyselém • prostředí •zjišťujeme, jestli jsou satelity • schopny aktivity (jestli na nich • není navázán chromatin, • který by aktivitě bránil a mohl • by být nebalancovaným • materiálem v karyotypu) •každý akrocentrický chromosom • nemusí být aktivní ve všech • buňkách •detekce satelitů v nestandardních • pozicích (translokace) • •NORs – nucleolus organizer regions • (organizátory jadérka) – úseky • akrocentrických chromosomů (sekundární konstrikce), které obsahují geny • pro rRNA a účastní se tvorby jadérek v interfázi nor2 [USEMAP] AKROCENTRICKÉ CHROMOSOMY V KARYOTYPU norm mužský [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů speciální barvící techniky •Přítomnost satelitů na chromosomu 4 C:\Documents and Settings\3750\Plocha\satelity 14.jpg C:\Documents and Settings\3750\Plocha\satelity 4 NOR.jpg NOR barvení G-pruhování chromosomů chr. 4 [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů speciální barvící techniky C:\Documents and Settings\3750\Plocha\20 nor.jpg Přítomnost satelitů na chromosomu 20 G-pruhování chromosomů NOR barvení chr. 20 [USEMAP] DETEKCE ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ZMĚN [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 1) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) (vliv mutagenních faktorů prostředí) konvenční barvení chromosomů – směsí barviv Giemsa - Romanowski stanovení % aberantních buněk – buněk s poškozeným chromosomem indikace k vyšetření – zejména práce v rizikovém prostředí vyšetření pouze konvenční metodou barvení chromosomů [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 1) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromatidové, chromosomové aberace sejmout000k sejmout000z V1 sejmout000i R sejmout000hh DIC sejmout000ggg zlom na 1 chromatidě zlom na 2 chromatidách (chromosomu) dicentrický chromosom chromatidová výměna kruhový chromosom (ring) DF tmavý [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 2) SCE – výměna sesterských chromatid (sister chromatid exchange) „Harlequinská technika“ vizualizace SCE • -testování působení klastogenů – faktorů, způsobujících zlomy a strukturní změny na chromosomech na mitózách získaných z lymfocytů periferní krve -test je určen k detekci reciprokých výměn zdánlivě homologních úseků sesterských chromatid -stanovení SCE je test mnohem citlivější na detekci působení mutagenních faktorů než klasické hodnocení chromosomových zlomů metodou konvenčního barvení chromosomů (viz. předchodí strany prezentace) -určitá část výměn je spontánní, počet výměn se zvyšuje v důsledku působení klastogenů -nemocní se syndromy chromosomové instability – AR dědičnost – výrazně zvýšený počet SCE je nalézán pouze u Bloomova syndromu (počet výměn na mitózu a buněčný cyklus je více než 100) [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 2) SCE – výměna sesterských chromatid (sister chromatid exchanges) „Harlequinská technika“ vizualizace SCE • •- BrdU = 5´bromo 2´deoxy uridin –analog nukleosidu thymidinu, je přidán do kultivačního média – kultivace 72 h – 2 cykly buněčného dělení -BrdU se inkorporuje do nově syntetizované DNA při replikaci místo thymidinu během S fáze buněčného cyklu (ke každému řetězci se dosyntetizovává nové vlákno) -vizualizace pomocí fluorescenčního barviva Hoechst a barviva Giemsa – chromatidy, jejichž součástí je původní vlákno DNA (s thymidinem bez BrdU) se barví tmavěji než chromatidy, které nesou obě vlákna DNA s BrdU -výměna zdánlivě homologních částí sesterských chromatid, k výměnám dochází během replikace -zvýšená frekvence výměn souvisí s vlivem mutagenních látek foto_SCE harlekýnský chromosom [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY 3) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (vznik v souvislosti s onkologickým onemocněním) G – pruhování chromosomů stanovení karyotypu maligních klonů + následné vyšetření metodami molekulární cytogenetiky mitoza [USEMAP] •Kontakt pro dotazy: Navarikova.Marta@fnbrno.cz