INSTRUMENTACE
RADIOIMUNOANALÝZY
Ing. Martina Podborská, Ph.D.
OKB FN Brno
Školní rok 2022/2023
Imunoanalytické metody
2
 stanovení bílkovin, antigenů, haptenů (hormonů,
léčiv, specifické IgE atd.)
 citlivější než imunoprecipitační metody
 vhodné pro koncentrace < 1 mg/l
 využívají značený indikátor (značenka = tracer)
– Ag nebo Ab
 značenkami mohou být:
 radioizotopy, fluoreskující látky, enzymy, substráty,
komplexy těžkých kovů, cheláty lanthanoidů
 podle typu značenky:
 izotopová imunoanalýza – RIA, IRMA
 enzymoimunoanalýza – EIA, IEMA
 fluoroimunoanalýza – FIA, IFMA
 luminoimunoanalýza – LIA, ILMA
 chemiluminiscence – ICMA, CLIA, ECL
3
 značenky umožňují detekovat volný n. na protilátku
vázaný Ag
 požadavky na značenku:
 snadná vazba na Ag nebo na Ab
 snadné měření + dobré rozlišení signálu a pozadí
 nesmí interferovat při reakci Ag a Ab
 levný a netoxický
 dle uspořádání imunoanalýzy rozlišujeme:
 KOMPETITIVNÍ: omezené množství Ab, značený je obvykle Ag
 NEKOMPETITVNÍ (imunometrická, sendvičová):Ab v nadbytku,
značená je obvykle Ab
 Heterogenní: vyžaduje separaci volné a vázané frakce Ag
 Homogenní: nevyžaduje separaci volné a vázané frakce Ag
Imunoanalytické metody
4
 nepřímá úměra mezi stanovovaným Ag a intenzitou
signálu:
Kompetitivní imunoanalýza
 1. stupňová:
 2. stupňová: 2-4 vyšší citlivost; nadbytek Ab v prvním kroku:
 vyžadují delší inkubaci
5
 přímá úměra mezi stanovovaným Ag a intenzitou
signálu
Nekompetitivní (sendvičová) imunoanalýza
Ag resp. Ab1-Ag-Ab2* – stanovovaný antigen/analyt;
minimálně 2 antigenní determinanty na Ag
Ab1 – většinou vázána na pevnou fázi
 mohou být 1 i 2 krokové
 2 krokové sendvičové metody poskytují nejvyšší specifitu
a senzitivitu
 citlivost metod souvisí s hranicí detekce značeného
ligandu
6
Kompetitivní
Rozdělení imunoanalytických metod
heterogenní: RIA, EIA (ELISA),
FIA, LIA
homogenní: EMIT, FPIA, CEDIA,
TRACE
Nekompetitivní
heterogenní: IRMA, IEMA, IFMA,
ILMA, CMIA, ECLIA (DELPHIA, MEIA)
homogenní:TRACE
7
 ZROD RIA:
 RosalynYalow
(1921*) and
Solomon Berson
popsali první RIA
v r. 1957
 Nobelova cena za
fyziologii a
lékařství v r. 1977
RADIOZOTOPOVÉ
IMUNOANALYTICKÉ METODY (RIA)
Radioizotopové indikátory
 Výhody:
 flexibilita
 citlivost
 velikost molekul
8
 Nevýhody:
 toxicita
 poločas rozpadu
 dodatečné náklady
 125I – gama zářič – poločas rozpadu 60 dní;
radiojód ve formě alkalických jodidů
 3H – beta zářič – poločas rozpadu 12,3 let;
když ze stérických důvodů nelze použít jód
(detekce beta zářice je obtížnější; dodává se
jako plyn (T2) nebo jako supertěžká voda (T2O)
9
 kompetitivní radioimunoanalýza:
 RIA – radioimunoanalýza (immunoassay)
 nekompetitivní (sendvičová) radioimunoanalýza:
 IRMA – imunoradiometrická analýza
 všechny izotopové metody jsou heterogenní
 měří se radioaktivní záření
 vysoce citlivá a specifická metoda
 RIA:
 Ab v tekutém stavu
 s Ab vázanou na pevné fázi
RADIOZOTOPOVÉ
IMUNOANALYTICKÉ METODY (RIA)
 kompetitivní heterogenní izotopová
imunoanalytická metoda
(aldosteron,androstendion,17-OH-
progesteron,TRAK)
 radioindikátorem je 125I = gamazářič
(poločas rozpadu 60 dní)
 g-counter se scintilačním
detektorem se studnovým
scintilačním krystalem NaI/Tl –
zářiče g (= přeměňuje energii IZ
absorbovanou v roztoku na záblesky
viditelného světla (scintilace), které
registruje fotonásobič)
 s každou sérií měření se zpracovává
kalibrační křivka
 radioindikátorem značený Ag
 Ab v limitovaném množství (navázáno
20-80% značeného)
10
RIA - Radioimmunoassay
 g-counter Berthold
11
g-counter Berthold LB2111
 slouží ke kvantitativnímu měření radioaktivity g-záření
(vyjádřeno v jednotkách cpm)
 je vybaven scintilačním detektorem, který je založen na
vzniku luminiscence při průchodu ionizujícího záření
vhodnou látkou (scintilátorem)
 pro detekci g-záření se jako scintilační jednotky používají
krystaly NaI/Tl
 při průchodu g-záření scintilačním krystalem dochází
k fotoefektu a ke Comptonově rozptylu; elektrony
uvolněné z atomových obalů excitují atomy krystalu,
přitom vzniká viditelné luminiscenční záření zvané
scintilace; pro přeměnu scintilací na elektrické impulsy se
používají fotonásobiče
 systém LB 2111 je vybaven 12 scintilačními jednotkami
RIA - Radioimmunoassay
 Ag a Ag* se odmyje, odsaje
 měří se radioaktivita imunokomplexu Ab-Ag*, která je
nepřímo úměrná koncentraci stanovovaného Ag
12
 citlivost metody je
dána afinitou použité
protilátky
 Kompetice:
13
 radioaktivitou
značený Ag*
soutěží s
neznačeným Ag
o limitované
množství
vazebných míst
na protilátce
RIA - Radioimmunoassay
14
 čím větší množství neznačeného antigenu je přítomno,
tím menší množství značeného antigenu se naváže na
protilátku a opačně
 nepřímá úměra: čím větší intenzita signálu, tím menší
koncentrace stanovovaného Ag
RIA - Radioimmunoassay
 Kompetice:
15
 Ab je navázána na pevnou fázi („imunosorbentu“ = tzn. že vnitřní stěna
zkumavek je potažena Ab)
1. Pipetace:
 do zkumavek potažených Ab postupně napipetujeme:
kalibrátory/kontroly/vzorky séra/plazmy + radiondikátor
 směs se promíchá
2. Inkubace: 1–3 h při 18-250C za stálého třepání (350 rpm)
3. Měření: obsah zkumavek se pečlivě odsaje (tím oddělíme volné
imunokomplexy a volné Ag; neodsajeme pouze zkumavku pro stanovení celkové
aktivity T) a změříme cpm pro vazebnou (B) a celkovou aktivitu (T) po dobu 1
min
 imunokomplexy a volné Ag se oddělí odmytím a odsátím
SCHÉMA POSTUPU RIA (komp.)
16
Stanovení androstendionu
 Výhody:
 vysoká citlivost
 robustnost
 malá spotřeba antiséra
 možnost automatizace
17
 Nevýhody:
 nebezpečí radioaktivního
záření
 krátká expirační doba
souprav
 nutno pracovat v sériích
 měřit v duplikátech
Je třeba dbát bezpečnostních předpisů pro
práci s radioizotopy!
RIA - Radioimmunoassay
125I v RIA laboratoři
 Poločas rozpadu: 60 dnů
 Typ přeměny: elektronový záchyt
 Typ a energie záření:
 g-záření (6%): 35 keV
 RTG záření: 27 a 31 keV
 sumační pík: 60 keV
 počet částic/100 přeměn: cca 150
18
125I v RIA laboratoři
 Sumační pík 125I
projevuje se často u radionuklidů rozpadajících se
elektronovým K-záchytem (doprovázeným emisí
charakteristického X-záření při přeskoku elektronů ze
slupky L na slupku K) s následnou emisí g
z excitované hladiny dceřinného jádra
zde dochází ke koincidenční detekci g a
charakteristického X-záření a vzniku sumačního píku
odpovídajícího energii Eg+EX
 typickým příkladem je radionuklid 125I, který se K-záchytem
rozpadá na 125Te, přičemž je vyzařováno g o energii 35keV a X o
energii 27keV
 při dostatečné detekční účinnosti (vzorky 125I se často měří ve
zkumavkách ve studnovém scintilačním detektoru) se pozoruje
výrazný sumační pík odpovídající energii 62keV
19
 Radiační charakteristiky I. pro 125I
Zprošťovací úrovně: 106 Bq; 103 kBq/kg
 Radiační charakteristiky II. pro 125I
Radiotoxicita:
20
125I v RIA laboratoři
125I v RIA laboratoři
 Uvolňovací úrovně a směrné hodnoty pro
radioaktivní kontaminaci materiálů a jejich povrchů
21
125I v RIA laboratoři
 Uvolňovací úrovně v praxi – pro monitoring
pracovního prostředí
22
125I v RIA laboratoři
 Pevný RA odpad z RIA
 zkumavky po analýze
 odhad: > 200 kBq/kg
 doba skladování před likvidací:
o minimálně 6 poločasů rozpadu
o 360 dní
23
 Kapalný RA odpad z RIA
 Limity pro uvolňování do ŽP:
o povrchová voda i kanalizace: 10-4 Sv/m3
 Objemová aktivita:
o povrchová voda: 6,67 Bq/l
o kanalizace: 667 Bq/l
o Ri z kitu: 3,6 – 60 MBq/l
 Konverzní faktor: hing = 1,5 . 10-8 Sv/Bq
125I v RIA laboratoři
 Radiační charakteristiky II.
 Konverzní faktory – pracovníci: 7,3 . 10-9 Sv/Bq
24
125I v RIA laboratoři
 Radiační charakteristiky II.
 Konverzní faktory – obyvatelstvo – INGESCE:
2 25
 Radiační charakteristiky II.
 Konverzní faktory – obyvatelstvo – INHALACE:
125I v RIA laboratoři
 Kategorizace prací a pracovišť I.
 Základní požadavky na standardní vybavení
pracoviště s otevřenými radionuklidovými zářiči
2 26
125I v RIA laboratoři
 Kategorizace prací a pracovišť II.
 Koeficienty vybavenosti pracovního místa
2 27
125I v RIA laboratoři
 Kategorizace prací a pracovišť III.
 Charakteristika materiálů a práce s nimi v závislosti
na fyzikální charakteristice zpracovávaných materiálů
a na náročnosti a potenciální rizikovosti prováděných
pracovních operací
2 28
125I v RIA laboratoři
 Kategorizace prací a pracovišť IV.
 Maximální aktivity zpracovávané na pracovním místě
29
Radiální imunodifúze
 je imunoprecipitační kvantitativní metoda stanovení
bílkovin
 principem metody je kruhová (radiální) difúze
antigenu do vrstvy gelu, který obsahuje příslušnou
protilátku
 stanovovaná bílkovina (má v reakci charakter
antigenu) difunduje z místa startu do gelu, kde
interaguje s protilátkou a vytváří kruhový precipitát
(sraženinu)
 plocha tohoto kruhu je přímo úměrná
koncentraci stanovované bílkoviny
30
Radiální imunodifúze
 Výhody:
 nenáročnost na vybavení laboratoře
 Nevýhody:
 relativně dlouhá doba inkubace (2-3 dny)
31
Děkuji za
pozornost.