Klinická biochemie II - MST P23 Klinická biochemie II - MST P23 11. prosince 202311. prosince 2023 OsnovaOsnova • Krátké seznámení s metodami – prezentace teorie• Krátké seznámení s metodami – prezentace teorie • Cvičení (2 skupiny) • Protokol• Protokol A) Termoforéza v mikroměřítku (Microscale Thermophoresis – MST)A) Termoforéza v mikroměřítku (Microscale Thermophoresis – MST) B) Kapičková mikrofluidika (Dropplet Microfluidiucs – DM) 2 TermoforézaTermoforéza vv mikroměřítkumikroměřítku ((MicroscaleMicroscale ThermophoresisThermophoresis –– MST)MST)((MicroscaleMicroscale ThermophoresisThermophoresis –– MST)MST) Bržezická TaťánaBržezická Taťána a přístroja přístroj MonolithMonolith XXa přístroja přístroj MonolithMonolith XX 3 Monolith XMonolith X • duální technologie Monolith X Monolith • duální technologie • Spektrální posun + MST Technologie Spektrální posun a MST MST Měření Kd Přibližně 10 minut Dynamický rozsah nM to mM pM to mMDynamický rozsah nM to mM pM to mM Detekovatelný rozsah molekul 101–107 Da Potřebný objem vzorku 10 μl Počet kapilár pro „run“ Až 24Počet kapilár pro „run“ Až 24 Teplotní kontrola 20-40 °C +/- 0.5 °C Fluorescenční detekce 1 / RED 1 / pico RED nebo 2 / pico RED & LabelFree (UV) Fluorescenční detekce 1 / RED LabelFree (UV) nebo 2 / pico RED & BLUE Rozměry přístroje 36 cm šířka x 40 cm výška x 58 cm délka Váha 27 kgVáha 27 kg 4 Princip metody MSTPrincip metody MST • fyzikální jev TRIC (1) + termoforéza (2) + teď navíc spektrální posun (dále)• fyzikální jev TRIC (1) + termoforéza (2) + teď navíc spektrální posun (dále) • TRIC - teplotně závislé změny intenzity fluoroforu • teplotní gradient vzorku (IR laser – 1480nm) vyvolá pohyb molekul, který• teplotní gradient vzorku (IR laser – 1480nm) vyvolá pohyb molekul, který je závislý na třech parametrech molekuly: velikosti, náboji a hydratačním obalu • fluorescenční detekce - optický systém (1) • fluorescenční detekce - optický systém nativní fluorescence proteinů/ značené fluorofory • vazebné parametry jsou určeny ze změn termoforetických vlastností (2) • vazebné parametry jsou určeny ze změn termoforetických vlastností vzorku se vzrůstající koncentrací vazebného partnera (konc. proteinu konstantní) • precizní a velmi citlivá metoda, analýza v malých objemech (μl) (2) • precizní a velmi citlivá metoda, analýza v malých objemech (μl) 5 Pohyb molekul při termoforéze v 1Pohyb molekul při termoforéze v 1 kapiláře 6 Záznam TRICZáznam TRIC 7 Příklad měřeníPříklad měření • scan kapilár se zvedající se koncentrací ligandu (koncentrace proteinu konstantní) • Kd je automaticky derivováno z MST grafů • F1 následně děleno F0 –> Fnorm 8 Spektrální posun (1) Spektrální posun • vazba ligandu způsobuje spektrální posun - modrý posun, červený posun (1) - modrý posun, červený posun • Ligandy, které se vážou blízko fluoroforu, mohou přímo ovlivňovat chemické prostředí fluoroforu (1). • Ligandy, které se vážou ve vzdálené poloze od fluoroforu, (2) • Ligandy, které se vážou ve vzdálené poloze od fluoroforu, mohou vést ke konformačním změnám (2). • měření 2 vlnových délek – 650 nm a 670 nm 9 Afinitní interakceAfinitní interakce • Síla interakce• Síla interakce • terminologie: target - ligand • Disociační konstanta K• Disociační konstanta Kd • pM – nM – silná afinita nebo těsná vazba • µM – mM – slabá interakce• µM – mM – slabá interakce • Plazmatické proteiny – léčiva (slabé) 10 Podle tzv. ˮ teorie volné frakce ˮ je pouze volné léčivo schopno transportu (přemístění) z krevního řečiště skrz membrány do cílových tkání a orgánů, kde působí farmakologických efektem. Cyklus léčiva v organismu je zjednodušeně ilustrován na obrázku výše. Vazba léčiv na plazmatické proteiny patří mezi faktory ovlivňující celkový 11 zjednodušeně ilustrován na obrázku výše. Vazba léčiv na plazmatické proteiny patří mezi faktory ovlivňující celkový farmakologický profil léčiva. VýhodyVýhody • rychlé a flexibilní nastavení testů• rychlé a flexibilní nastavení testů • měření v roztoku bez imobilizace • integrovaná kontrola kvality - umožňuje detekci agregačních a srážecích procesů během měření • termoforéza molekul závisí kromě jejich velikosti také na náboji a hydratačním obalu (více informací)• termoforéza molekul závisí kromě jejich velikosti také na náboji a hydratačním obalu (více informací) • malá spotřeba vzorku • variabilita pufru, dokonce i komplikované směsi (krevní plasma či buněčný lyzát)• variabilita pufru, dokonce i komplikované směsi (krevní plasma či buněčný lyzát) 12 Kapičková mikrofluidika – aplikace vKapičková mikrofluidika – aplikace v enzymologiienzymologii Sedlák Michal Zápatí prezentace13 TeorieTeorie ̶ Mikrofluidika ̶ Enzymová kinetika ̶ ̶ ̶ Enzymová kinetika ̶ Dnes ve cvičení Zápatí prezentace14 ̶ ̶ Mikrofluidika - příklady Elektroforéza na čipu ̶ Miniaturizace laboratorních postupů ̶ Nižší spotřeba látek, velké množství dat Průtoková cytometrie DNA čipy Li, Y., Mahjoubfar, A., Chen, C.L. et al. Deep Cytometry: Deep learning with Real-time Guardia M, Armenta S., Downsizing the Methods. Comprehensive Analytical Chemistry, Elsevier, Volume 57, 2011 Kim J, Jensen EC, Stockton AM, Mathies RA. Universal microfluidic automaton for autonomous sample processing: application to the Mars Organic Analyzer. Anal Chem. 2013 Aug 20;85(16):7682-8. doi: 10.1021/ac303767m. Epub 2013 Jul 29. PMID: 23675832. 15 Li, Y., Mahjoubfar, A., Chen, C.L. et al. Deep Cytometry: Deep learning with Real-time Inference in Cell Sorting and Flow Cytometry. Sci Rep 9, 11088 (2019). https://doi.org/10.1038/s41598-019-47193-6 Lamartine, J. The benefits of DNA microarrays in fundamental and applied bio-medicine. Materials Science and Engineering: C, Volume 26, Issues 2–3, 2006, https://doi.org/10.1016/j.msec.2005.10.068. Kapičková mikrofluidika Tvorba kapek Spojování Třídění Zachycení na čipu Dělení 16 S. N. Lai, X. Ouyang, and B. Zheng, in Detection Methods in Precision Medicine, ed. M. (. Yang and M. Thompson, The Royal Society of Chemistry, 2020, pp. 253-278. ̶ ̶ Enzymy ̶ Biokatalyzátory, metabolismus, signalizace ̶ Rovnice Michaelise-Mentenové v … rychlost reakce P … koncentrace produktu t … čas Vmax … limitní rychlost Linearizace (y = ax + b) S … koncentrace substrátu Km … michaelisova konstanta Linearizace (y = ax + b) a = Km / Vmax b = 1 / Vmax Zápatí prezentace17 Inibitory enzymů jako léčiva Př.: Aspirinsnížení aktivity cílového enzymu enzym cyklooxygenáza Př.: Aspirinsnížení aktivity cílového enzymu terapeutický efekt enzym cyklooxygenáza k. acetylsalicylová k. salicylová Zápatí prezentace18 Fitzgerald DJ, FitzGerald GA (2013): Historical lessons in translational medicine. Cyclooxygenase inhibition and P2Y12 antagonism. Circ Res 112:174-194. Inhibice aktivity enzymu Kompetitivní Akompetitivní Směsná a nekompetitivní Zápatí prezentace19 https://www.sciencesnail.com/science/category/enzymology Obsah cvičení “T” spojka pro spojení reakční směsi a oleje – pro tvorbu kapek olej “Y” spojka pro smíchání reakční směsi enzym substrátenzym substrát Zápatí prezentace20 Obsah cvičení ̶̶ β-galaktosidáza E.coli ̶ Odštěpení fluoresceinu z umělého substrátu β-gal.̶ Odštěpení fluoresceinu z umělého substrátu β-gal. Fluorescein • Excitace: 498 nm • Emise: 517 nm Zápatí prezentace21 https://cs.wikipedia.org/wiki/Fluorescein Děkuji za pozornostDěkuji za pozornost Zápatí prezentace22