Klinická biochemie II - MST P23 11. prosince 2023 Osnova •Krátké seznámení s metodami – prezentace teorie •Cvičení (2 skupiny) •Protokol • •A) Termoforéza v mikroměřítku (Microscale Thermophoresis – MST) •B) Kapičková mikrofluidika (Dropplet Microfluidiucs – DM) • • • • 2 Termoforéza v mikroměřítku (Microscale Thermophoresis – MST) Bržezická Taťána a přístroj Monolith X 3 Monolith X •duální technologie •Spektrální posun + MST • • Monolith X Monolith Technologie Spektrální posun a MST MST Měření Kd Přibližně 10 minut Dynamický rozsah nM to mM pM to mM Detekovatelný rozsah molekul 101–107 Da Potřebný objem vzorku 10 μl Počet kapilár pro „run“ Až 24 Teplotní kontrola 20-40 °C +/- 0.5 °C Fluorescenční detekce 1 / RED 1 / pico RED nebo 2 / pico RED & LabelFree (UV) nebo 2 / pico RED & BLUE Rozměry přístroje 36 cm šířka x 40 cm výška x 58 cm délka Váha 27 kg 4 Princip metody MST •fyzikální jev TRIC (1) + termoforéza (2) + teď navíc spektrální posun (dále) •TRIC - teplotně závislé změny intenzity fluoroforu •teplotní gradient vzorku (IR laser – 1480nm) vyvolá pohyb molekul, který je závislý na třech parametrech molekuly: velikosti, náboji a hydratačním obalu •fluorescenční detekce - optický systém •nativní fluorescence proteinů/ značené fluorofory •vazebné parametry jsou určeny ze změn termoforetických vlastností vzorku se vzrůstající koncentrací vazebného partnera (konc. proteinu konstantní) •precizní a velmi citlivá metoda, analýza v malých objemech (μl) • (1) (2) 5 Pohyb molekul při termoforéze v 1 kapiláře 6 7 Záznam TRIC Příklad měření •scan kapilár se zvedající se koncentrací ligandu (koncentrace proteinu konstantní) •Kd je automaticky derivováno z MST grafů •F1 následně děleno F0 –> Fnorm 8 Spektrální posun •vazba ligandu způsobuje spektrální posun • - modrý posun, červený posun •Ligandy, které se vážou blízko fluoroforu, mohou přímo ovlivňovat chemické prostředí fluoroforu (1). •Ligandy, které se vážou ve vzdálené poloze od fluoroforu, mohou vést ke konformačním změnám (2). •měření 2 vlnových délek – 650 nm a 670 nm • (1) (2) 9 Afinitní interakce •Síla interakce •terminologie: target - ligand •Disociační konstanta Kd •pM – nM – silná afinita nebo těsná vazba •µM – mM – slabá interakce •Plazmatické proteiny – léčiva (slabé) 10 11 Podle tzv. ˮ teorie volné frakce ˮ je pouze volné léčivo schopno transportu (přemístění) z krevního řečiště skrz membrány do cílových tkání a orgánů, kde působí farmakologických efektem. Cyklus léčiva v organismu je zjednodušeně ilustrován na obrázku výše. Vazba léčiv na plazmatické proteiny patří mezi faktory ovlivňující celkový farmakologický profil léčiva. Výhody •rychlé a flexibilní nastavení testů •měření v roztoku bez imobilizace •integrovaná kontrola kvality - umožňuje detekci agregačních a srážecích procesů během měření •termoforéza molekul závisí kromě jejich velikosti také na náboji a hydratačním obalu (více informací) •malá spotřeba vzorku •variabilita pufru, dokonce i komplikované směsi (krevní plasma či buněčný lyzát) • 12 Adobe Systems Zápatí prezentace 13 Kapičková mikrofluidika – aplikace v enzymologii Sedlák Michal Adobe Systems Zápatí prezentace 14 Teorie ̶Mikrofluidika ̶Enzymová kinetika ̶Dnes ve cvičení Adobe Systems 15 ̶Miniaturizace laboratorních postupů ̶Nižší spotřeba látek, velké množství dat ̶ Mikrofluidika - příklady Obsah obrázku text, diagram, snímek obrazovky, design Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku text, snímek obrazovky, diagram, design Popis byl vytvořen automaticky Li, Y., Mahjoubfar, A., Chen, C.L. et al. Deep Cytometry: Deep learning with Real-time Inference in Cell Sorting and Flow Cytometry. Sci Rep 9, 11088 (2019). https://doi.org/10.1038/s41598-019-47193-6 Lamartine, J. The benefits of DNA microarrays in fundamental and applied bio-medicine. Materials Science and Engineering: C, Volume 26, Issues 2–3, 2006, https://doi.org/10.1016/j.msec.2005.10.068. Obsah obrázku diagram, řada/pruh, text, Písmo Popis byl vytvořen automaticky Průtoková cytometrie Elektroforéza na čipu Guardia M, Armenta S., Downsizing the Methods. Comprehensive Analytical Chemistry, Elsevier, Volume 57, 2011 Kim J, Jensen EC, Stockton AM, Mathies RA. Universal microfluidic automaton for autonomous sample processing: application to the Mars Organic Analyzer. Anal Chem. 2013 Aug 20;85(16):7682-8. doi: 10.1021/ac303767m. Epub 2013 Jul 29. PMID: 23675832. Obsah obrázku text, kruh Popis byl vytvořen automaticky DNA čipy Adobe Systems 16 Kapičková mikrofluidika Obsah obrázku text, snímek obrazovky, Obdélník, Písmo Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku text, diagram, snímek obrazovky, Písmo Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku řada/pruh, snímek obrazovky, design Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku diagram, symbol, skica, Dětské kresby Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku diagram, design Popis byl vytvořen automaticky Tvorba kapek Spojování Třídění Zachycení na čipu Dělení S. N. Lai, X. Ouyang, and B. Zheng, in Detection Methods in Precision Medicine, ed. M. (. Yang and M. Thompson, The Royal Society of Chemistry, 2020, pp. 253-278. Adobe Systems ̶Biokatalyzátory, metabolismus, signalizace ̶Rovnice Michaelise-Mentenové ̶ ̶ ̶ Zápatí prezentace 17 Obsah obrázku text, řada/pruh, Vykreslený graf, číslo Popis byl vytvořen automaticky Enzymy v … rychlost reakce P … koncentrace produktu t … čas Vmax … limitní rychlost S … koncentrace substrátu Km … michaelisova konstanta ̶ ̶ ̶ Linearizace (y = ax + b) a = Km / Vmax b = 1 / Vmax ̶ ̶ ̶ Adobe Systems Zápatí prezentace 18 Inibitory enzymů jako léčiva Př.: Aspirin snížení aktivity cílového enzymu terapeutický efekt k. acetylsalicylová k. salicylová enzym cyklooxygenáza Fitzgerald DJ, FitzGerald GA (2013): Historical lessons in translational medicine. Cyclooxygenase inhibition and P2Y12 antagonism. Circ Res 112:174-194. Adobe Systems Zápatí prezentace 19 Inhibice aktivity enzymu Obsah obrázku text, snímek obrazovky, diagram, řada/pruh Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku text, řada/pruh, diagram, snímek obrazovky Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku text, diagram, řada/pruh, snímek obrazovky Popis byl vytvořen automaticky Kompetitivní Akompetitivní Směsná a nekompetitivní https://www.sciencesnail.com/science/category/enzymology Adobe Systems Zápatí prezentace 20 Obsah cvičení “Y” spojka pro smíchání reakční směsi “T” spojka pro spojení reakční směsi a oleje – pro tvorbu kapek olej enzym substrát Obsah obrázku snímek obrazovky, text, diagram, design Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku snímek obrazovky, černobílá, černobílý Popis byl vytvořen automaticky Adobe Systems Zápatí prezentace 21 Obsah cvičení Obsah obrázku text, řada/pruh, Vykreslený graf, číslo Popis byl vytvořen automaticky ̶β-galaktosidáza E.coli ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶Odštěpení fluoresceinu z umělého substrátu β-gal. Obsah obrázku diagram, text, řada/pruh, skica Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku diagram, snímek obrazovky, design, vzor Popis byl vytvořen automaticky Fluorescein •Excitace: 498 nm •Emise: 517 nm https://cs.wikipedia.org/wiki/Fluorescein Adobe Systems Zápatí prezentace 22 Děkuji za pozornost ̶