Stanovení parametrů enzymové reakce pomocí kapičkové
mikrofluidiky s fluorogenním substrátem
Teorie:
Mikrofluidika
Mikrofluidní systémy přinášejí zajímavé možnosti pro analytickou chemii, biochemii i klinické
aplikace. Jejich výhodou je obecně nízká spotřeba látek a zároveň získání velkého množství dat.
Základem aparatury mohou být trubičky nebo mikrokanálky v různých materiálech, jejichž konkrétní
design a kombinace s detekčními a separačními technikami umožňuje široké spektrum aplikací.
Častým materiálem bývají „čipy“ vyrobené z PDMS (polydimethylsiloxan) pro svoje mechanické
vlastnosti, relativní inertnost a jednoduchost výroby.
Jako mikrofluidní metody lze namátkou zmínit průtokovou cytometrii (třídění a analýza vlastností
buněk), „microarrays“ (DNA nebo protilátkové próby na povrchu), digitální PCR, elektroforéza na
čipu, nebo kapičková mikrofluidika (převedení reakcí do jednotlivých kapek v oleji, sloužících jako
jednotlivé mikroreaktory).
Převedení laboratorních postupů do čipového formátu se nazývá „lab-on-a-chip“, tedy laboratoře na
čipu, kde je možné produkovat velké množství dat s malou spotřebou reagentů. S tím souvisí
automatizace, zpracování dat a obecně výzvy spojené s miniaturizací, jak technologie výroby, tak
chování kapalin v mikroměřítku.
Obr. 1 Schéma přístroje s fluorescenční detekcí použitého ve cvičení:
Roztoky jsou dávkovány pomocí přesných pump, kapky reakční směsi vznikají oddělováním pomocí proudu
oleje v pravoúhlé spojce (jedna z možností tvorby kapek). Při průchodu ostře zatočeným kanálkem se reakční
směs uvnitř kapek díky silám, působícím na kapky promíchá. Průběh reakce v čase lze pozorovat detekcí signálu
v různých místech inkubačního kanálku. Detekční část je zdroj excitačního světla, soubor filtrů, detektor
(fotonásobič) a software. Celá aparatura je umístěna na mikroskopu.
Obr. 2 Kapky reakční směsi oddělené olejem:
Velikost a vzdálenost kapek lze měnit změnou poměru průtoku vodné a olejové fáze. Vnitřní průměr trubičky:
254 µm.
Enzymová kinetika
Enzymy jsou v organismech nepostradatelné biomolekuly, katalyzující různorodé reakce ve spoustě
metabolických a signalizačních drah. Poznání jejich chování je důležité pro porozumění biologickým
procesům a aplikaci v biotechnologii stejně jako pro pochopení a léčbu některých onemocnění, na
kterých se podílejí. Enzymová kinetika obecně zkoumá katalytickou funkci enzymů vůči jejich
přirozeným nebo umělým substrátům, chování v různém prostředí (teplota, pH, iontová síla…) nebo
jejich inhibici například pro terapeutické účely.
Základní rovnicí popisující reakci katalyzovanou enzymem je rovnice Michaelise-Mentenové (1),
𝑣𝑣 =
𝑑𝑑(𝑃𝑃)
𝑑𝑑𝑑𝑑
=
𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 (𝑆𝑆)
𝐾𝐾𝑀𝑀+(𝑆𝑆)
(1)
kde rychlost enzymové reakce v (množství produktu vytvořeného za 1 s) je definovaná maximální
rychlostí reakce při plném nasycení substrátem Vmax , Michaelisovou konstantou KM a aktuální
koncentrací substrátu S.
Parametry Vmax a KM lze experimentálně získat stanovením rychlosti reakce při různých koncentracích
substrátu a následně nelineární regresí nebo linearizací.
Při linearizaci podle Lineweavera a Burka vynášíme jako osu y 1/v a jako osu x 1/(S). Výsledkem je
přímka (v ideálním případě), jejíž směrnice odpovídá KM / Vmax a úsek na ose y 1 / Vmax.
Obr. 3 Příklad výnosu reakční rychlosti proti koncentraci substrátu:
Vlevo: Křivka pro Km = 10 mol a Vmax = 100 mol/s; vpravo: stejná data, linearizovaná forma
Praktická část:
- Stanovení Km a Vmax ze závislosti rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu
Materiál a vybavení:
- Enzym β-galaktosidáza E.coli v inkubačním pufru, koncentrace 4 µg/ml
- 2 mM fluorogenní substrát Fluorescein Di-β-D-Galactopyranosid (FDG) v dimethylsulfoxidu
(DMSO)
- Inkubační pufr: 100 mM fosfátový pufr pH 7.3 obsahující 1 mM MgCl2 a 112 mM
2-merkaptoethanol
- 100 nM roztok fluoresceinu v inkubačním pufru
- Fluorinert FC-40 (olejová fáze)
- Instrumentace kapičkové mikrofluidiky (mikroskop Olympus, zdroj excitačního záření Coolled
pE-300, PMT detektor Hamamatsu, stříkačkové pumpy Nemesys, stríkačky Hamilton, trubičky
a spojky
- Nastavení detekčního systému: excitační vlnová délka: 450 nm; emisní filtr: 510 – 560 nm;
nastavená intenzita exc. záření na ovladači: 100; gain 5,5; zvětšení okuláru: 20 X; interval
záznamu: 0,004 s
Pracovní postup:
A: Postup analýz, sestavení aparatury
1. Sestavíme trubičky a spojky podle obrázku; stříkačky vyfoukáme stlačeným vzduchem a
plochy pístů a těsnění spojek očistíme lepicí páskou od prachu.
Obr. 4 Trubičky spojené pomocí spojek:
Zjednodušené zapojení bez míchacích kliček, smíchaná reakční směs je proudem olejové fáze „utrhována“ na
kapky, které jsou unášeny směrem k detektoru
2. Do stříkaček naplníme daný objem roztoků a Fluorinert FC-40 jako olejovou fázi, dbáme aby
ve stříkačkách ani trubičkách nezůstávaly bublinky vzduchu, ze stříkačky je případně opatrně
vyklepeme.
3. V ovládacím softwaru nastavíme odpovídající objemy roztoků ve stříkačkách, stříkačky
vložíme do pumpy a všechny spoje přiměřeně utáhneme rukou
4. Spustíme počáteční průtoky pro ustálení toku po dobu 1 minuty: 12 µl /min pro olej a celkově
12 µl /min pro reakční směs
5. Poté průtoky změníme v poměru 1:3 (reakční směs : olej) na:
Stříkačka č. Obsah stříkačky Dávkovací průtok
1 Substrát FDG v inkubačním pufru 3
2
3 Enzym β-galaktosidáza E.coli (4 µg/ml)
v inkubačním pufru
3
4 Olejová fáze: fluorinert FC-40 18
“Y” spojka pro smíchání
reakční směsi
“T” spojka pro spojení
reakční směsi a oleje – pro
tvorbu kapek
olej
enzym substrát
6. Po ustálení toku (cca 2 až 5 minut) spustíme záznam signálu po dobu 40 s (přibližně 50 kapek)
7. Odečteme intenzitu fluorescence vrcholů píků (záznam středu kapky)
B: Kalibrační závislost
1. Zásobní 100 nM fluorescein nařeďte pomocí ředící řady na koncentrace podle tabulky do
finálního objemu 500 µl. Používejte tmavé zkumavky aby se zabránilo znehodnocení
fluoresceinu světlem („photobleaching“)
Finální
koncentrace
fluoresceinu
(nM)
Objem 100 nM
roztoku
fluoresceinu (µl)
Přenášený
objem (µl)
Objem
inkubačního
pufru (µl)
100 500
50 250 250
20 200 300
10 250 250
5 250 250
1 100 400
0,2 100 400
2. Sestavte trubičky a spojky podle obrázku 4
3. Začínejte koncentrací 0,2 nM a postupujte k vyšším koncentracím
4. Roztok naplňte do stříkačky, a postupujte podle postupu popsaného v části A
5. Zaznamenejte 40 s odezvy kapiček pro jednotlivé kalibrační roztoky a záznam vyhodnoťte
6. Ze závislosti průměrné hodnoty intenzity fluorescence na koncentraci fluoresceinu zjistěte
vynesením do grafu kalibrační závislost.
Rovnice kalibrační závislosti y = 0,0007145 x + 0,005625 (signál
jako napětí ve V, koncentrace v nM)
C: Stanovení závislosti rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu
Příprava roztoků
1. Při ředění FDG použijte tmavé zkumavky a roztoky držte na ledu až do měření, aby se
zabránilo samovolné hydrolýze substrátu
2. Ze zásobního 2 mM FDG připravte 500 µl 200 µM roztoku naředěním inkubačním pufrem.
3. Podle tabulky připravte ředící řadou roztoky substrátu FDG. Roztoky včetně enzymu
nechávejte do doby měření chladit.
Koncentrace
FDG (µM)
Objem 200 µM
roztoku FDG (µl)
Přenášený
objem (µl)
Objem
inkubačního
pufru (µl)
200 600
120 360 240
80 400 200
40 300 300
20 300 300
10 300 300
! koncentrace substrátu i enzymu v reakční směsi bude poloviční (míchání 1:1)
4. Sestavte trubičky a spojky podle obrázku
5. Nechejte při laboratorní teplotě pomalu rozmrazit 4 µg/ml roztok enzymu a rozvortexujte ho
6. Začněte s nejnižší koncentrací FDG
7. Roztok substrátu i enzymu naplňte do dvou stříkaček a postupujte podle postupu popsaného
v části A
8. Zaznamenejte 40 s odezvy kapiček pro jednotlivé koncentrace substrátu ve 3 měricích
oknech, jejichž vzdálenost od smíchání enzymu se substrátem si zapište.
9. Pořiďte snímek kapek v reakční trubičce pomocí kamery integrované v mikroskopu, graficky
odečtěte vzdálenost mezi kapkami (trojčlenkou, kdy jako měřítko použijeme vnitřní průměr
trubičky: 0,254 mm); ze záznamu odečtěte časovou mezeru (jestliže víme že body záznamu
se odečítají po 0,004 s) mezi průchodem jednotlivých kapek a z těchto hodnot vypočtěte
reakční čas v daných vzdálenostech od místa smíchání reakční směsi
Vzdálenost
kapek (cm)
Čas mezi
kapkami (s)
Rychlost kapek
(cm/s)
0,0765 0,1416 0,5404
10. Do tabulky zapište reakční časy vypočítané pro jednotlivá měřicí okna, průměrné hodnoty
intenzity fluorescence naměřené pro jednotlivé koncentrace FDG (n=60) v jednotlivých
měřicích časech a pomocí směrnice přímky získané z kalibrační závislosti je přepočítejte na
koncentraci fluoresceinu
Reakční čas (s)
FDG
v reakční
směsi (µM)
30 cm 37 cm 44 cm 30 cm 37 cm 44 cm
55,52 68,47 81,42 55,52 68,47 81,42
Intenzita fluorescence Koncentrace fluoresceinu (nmol/l)
100 3,544 6,599 6,883 1989,342 2261,959 3368,117
60 0,777 1,027 1,060 6197,043 6398,292 7293,293
40 1,546 2,690 2,895 2598,148 2927,276 3304,201
20 0,501 0,993 0,963 1985,473 2140,912 2442,058
10 0,269 0,499 0,494 417,798 784,549 723,640
5 0,091 0,108 0,110 860,412 1071,762 1096,211
Linearizace dle Lineweavera-Burka; výpočet Km a Vlim
11. Koncentraci fluoresceinu (osa y) v závislosti na čase (osa x) pro jednotlivé koncentrace FDG
vyneste do grafu v Excelu a získané směrnice přímek (y=ax+b), odpovídající změně
koncentrace fluoresceinu za 1 s (její jednotky jsou nmol/l.s) zapište do tabulky níže;
vypočítejte rychlost reakce při jednotlivých koncentracích FDG vztaženou na 1 mg enzymu
(podíl směrnice v nmol/l.s a koncentrace enzymu (finální koncentrace po smíchání v mg/l) se
rovná reakční rychlosti v nmol/s.mg)
12. Následně vypočítejte 1/cFDG a 1/v0 které použijte jako hodnoty x a y resp. pro linearizaci podle
Lineweavera-Burka a získaný graf vložte pod tabulku (výsledkem by měla být lineární
závislost, na ose x hodnoty 1/cFDG a na ose y 1/v0 )
CFDG: konc. FDG
v reakční směsi
(µM)
Směrnice
(nmol/l.s)
V0: Rychlost
reakce
(nmol/s.mg)
1/cFDG 1/v0
100 55,235 27,6175 0,01 0,036209
60 42,326 21,163 0,166 0,047252
40 27,261 13,6305 0,025 0,073365
20 17,629 8,8145 0,05 0,113449
10 11,809 5,9045 0,1 0,169362
5 9,104 4,552 0,25 0,219684
Graf linearizace dle Lineweavera-Burka:
y = 53,235x - 1105,2
y = 42,326x + 3731,5
y = 27,261x + 1076,7 y = 17,629x + 982,44
y = 11,809x - 166,54
y = 9,1042x + 386,1
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
50 55 60 65 70 75 80 85
c(fluorescein)[nmol/l]
čas reakce [s]
100 60 40 20 10 5
y = 0,954x + 0,046
-0,1
-0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
-0,1 -0,05 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
1/rychlostreakce
1/koncentrace substátu
13. Hodnota směrnice přímky odpovídá Km/Vlim a úsek 1/Vlim . Vypočítejte Km a Vlim reakce a
hodnoty zapište do tabulky
Km 20,74 µM
Vlim 21,74 nmol/s.mg
Závěr:
Z uvedených dat byly vytvořeny křivky znázorňující změnu koncentrace vznikajícího
fluoresceinu za čas a stanovena rychlost reakce pro každou koncentraci výchozí látky (FDG).
Následně byly tyto rychlosti reakce uvedeny do grafu linearizace podle Lineweavera-Burka a
vypočtena limitní rychlost reakce 21,74 nmol/s.mg a také Km= 20,74 µM. Na grafu
linearizace je vidět, že poslední odlehlý bod je o něco níže, než by se čekalo a bylo by vhodné
jej do grafu nezahrnout, kdy směrnice přímky by byla značně vyšší.