Imunoanalytické metody RNDr. Alena Mikušková FN Brno – Dětská nemocnice, ODHB Imunochemické metody • Založeny na reakci antigenu Ag s protilátkou Ab – tj. na reakci antigenních determinant s vazebným místem protilátky Antigen (Ag) • Kompletní antigen = makromolekulární nosič (protein, polypeptid, polysacharid, nukleoprotein,…) + antigenní determinant (= epitop = určitá skupina atomů na povrchu molekuly antigenu) – navozuje specifickou imunitní odpověď (imunogen) – reaguje s produkty této odpovědi (protilátkami) Hapten = nekompletní antigen = nízkomolekulární látka, specificky reaguje s protilátkami, sama tvorbu protilátek nenavozuje Protilátky (Ab) • Glykoproteiny, elfo pohyblivost β – γ (imunoglobuliny – Ig) – produkty plazmatických buněk (ty se vyvíjejí z B-lymfocytů po stimulaci antigenem) Protilátky • Monoklonální – produkty jednoho klonu plazmatických buněk – připraveny hybridomovou technologií (fúze myelomových buněk s vyselektovaným klonem lymfocytů sleziny imunizovaných myší - výrazně specifické - vážou se jen na jeden epitop • Polyklonální – příprava imunizací zvířete – namířeny proti různým epitopům antigenu • Lehké řetězce – κ, λ • Těžké řetězce – γ, μ, α, ε, δ – určují třídu imunoglobulinu IgG, IgM, IgA, IgE, IgD • 2 vazebná místa pro antigen (kromě IgM = pentamer → 10) Aglutinační metody • Vyšetření antigenů Rh fenotypu a antigenu Kell na mikrodesce ABO Aglutinace (shlukování) - Reakce protilátky s korpuskulárním antigenem - vede ke vzniku aglutinátu „vločkové konzistence“ - korpuskulární antigen musí na svém povrchu nést vetší počet antigenních determinant. Imunochemické metody • Aglutinační metody – kvalitativní, semikvantitativní • shlukování mikroskopických částic s obsahem povrchových antigenů, např. krvinek, baktérií apod. pomocí protilátek • určování bakteriálních kmenů, průkaz protilátek proti patogenům • hematologie – určování krevních skupin a průkaz Ab proti krevním elementům Precipitační metody „Klasické“ metody - vznik nerozpustného precipitátu – imunodifúze, imunoelektroforéza • Jednoduchá + dvojitá radiální imunodifúze • Imunoelektroforéza „Raketky“ Dvourozměrná imunoelfo Již nepoužívané !!! Současné imunoelektroforetické techniky: Imunofixace • rozdělení vzorku na gelu – elektroforéza, izoelektrická fokuzace • následná aplikace antiséra ═ Ab proti konkrétním těžkým nebo lehkým řetězcům • Anti-IgG značené peroxidázou • vznik imunokomplexů • promytí gelu + barevná vizualizace oligoklonálních pásů • chromogen = substrát peroxidázy • Stanovení a typizace monoklonálních imunoglobulinů a jejich frakcí v séru / moči Současné imunoelektroforetické techniky Imunoblotting • elektroforetická separace proteinů na polyakrylamidovém gelu • elektroforetický přenos proteinu na nitrocelulozovou membránu – tzn. vytvoření přesné „repliky“ • antigeny na membráně lépe přístupné protilátkám • aplikace enzymem značené protilátky – vznik komplexu • vizualizace skvrn – po přidání substrátu enzymu vzniká zbarvení Imunoturbidimetrie • Imunoprecipitace založená na interakci antigen - protilátka – vytvoření suspenze imunoprecipitátu v kyvetě → zákal. • podmínka: přítomnost polyvalentního antigenu (reakce antigenu s více epitopy) • Imunoprecipitát = prostorová mřížka, kde se propojují epitopy (vazebná místa) antigenu s paratopy (vazebná místa) protilátek • imunoprecipitační křivka = vyjádření množství imunoprecipitátu na množství protilátky a antigenu • V oblasti nadbytku protilátky je množství komplexu Ag-Ab úměrné koncentraci Ag • v reakci nadbytek Ab – vzestupná část křivky • změření intenzity světla pohlceného zákalem – spektrofotometr • stanovení koncentrace antigenu ve vzorku Imunonefelometrie • měření intenzity světla rozptýleného zákalem – vychází z roztoku všemi směry – měření se pod úhlem odlišným od směru dopadajícího záření • obvykle 45° nebo 90° • nefelometr - zdrojem záření je obvykle laser • stanovení koncentrace antigenu stejně jako u imunoturbidimetrie Nefelometrie = citlivější ! Imunoturbidimetrie, imunonefelometrie – stanovení plazmatických proteinů – CRP – imunoglobuliny – specifické proteiny – koagulační faktory,… Moderní kvantitativní imunochemické metody • neprecipitační imunoanalýzy se značenými reaktanty (tzv. konjugáty) • rychlé, citlivé, často automatizované, detekční limit řádově mg/l – pg/l Značení v imunoanalýze: • radioizotop – radioimunoanalýza = Radio Immuno Assay - RIA • enzym – enzymoimunoanalýza – Enzyme Immuno Assay - EIA • fluorescenční látka – fluoroimunoanalýza – Fluoro Immuno Assay - FIA • chemiluminiscenční látka – luminoimunoanalýza – Luminiscence IA - LIA • atd. Uspořádání imunochemické reakce: • kompetitivní • nekompetitivní Imunochemická reakce v kompetitivním uspořádání • provedení – v nadbytku antigenu • smíchání séra s neznámým obsahem antigenu Ag se známým množstvím značeného antigenu Ag* (konjugát) • soutěžení Ag a Ag* o vazebná místa omezeného množství protilátek – navázání v tom poměru, v jakém byly v původní směsi • případné odstranění nenavázaných látek + detekční reakce - analyt – Ag ze vzorku - konjugát – Ag* - odezva nepřímo úměrná konc. Ag ve vzorku • vhodné pro stanovování malých molekul s jednou determinantou – hormony (steroidní, tyroidní), léky Imunochemická reakce v nekompetitivním uspořádání Stanovení antigenu: • První protilátka Ab v nadbytku (navázaná na pevnou fázi) • Přidání vzorku obsahujícího antigen Ag - 1. imunochemická reakce – odstranění nenavázaných složek séra promytím • Přidání druhé (značené)* protilátky Ab* – 2. imunochemická reakce (s další antigenní determinantou) → vznik sendvičového komplexu Ab-Ag-Ab* • Odstranění nenavázaných složek séra promytím • Detekční reakce - odezva přímo úměrná koncentraci Ag ve vzorku • Vhodné pro stanovení velkých antigenů s několika vazebnými místy pro Ab Imunochemická reakce v nekompetitivním uspořádání Stanovení protilátky • Na pevné fázi navázán antigen v nadbytku • Přidání vzorku – reakce Ab ze vzorku s imobilizovaným Ag – promytí – odstranění nenavázaných složek • Přidání 2. protilátky Ab* (značený anti-Ig) • Promytí a detekční reakce – odezva přímo úměrná koncentraci Ab ve vzorku …a další komplikovaná uspořádání Uspořádání imunochemické reakce • Dle nutnosti separace volného a vázaného konjugátu (značené Ag* nebo Ab*): odkud pochází signál – z volného nebo navázaného Ag* ?? • Heterogenní metody – Po vzniku imunokomplexu se vlastnosti signálu Ag* resp. Ab* nemění – Nutnost separace – např. komplex navázaný na pevnou fázi • jamka mikrotitrační destičky, paramagnetické částice,… • Homogenní metody – Využívají změny signálu Ag* resp. Ab* po vzniku imunokomplexu • bez nutnosti separace Radioimunoanalytické (izotopové) metody • Ag* nebo Ab* značené radionuklidem – γ-zářiče 125I, 57Co, … • měření aktivity γ-záření (scintilační detektor) • Heterogenní metody (nutnost separace komplexu) – imobilizace Ab na pevnou fázi (př. jamka mikrodestičky) • RIA – Radio Immuno Assay – Kompetitivní Ab-Ag, Ab-Ag* • IRMA – Immuno Radiometric Assay – Sendvičová Ab-Ag-Ab* • Použití: hormony, léčiva, (auto)protilátky,… • Citlivé x nestálé reagencie, nebezpečí práce s radioaktivním materiálem Enzymoimunoanalýza - EIA • Značení Ag nebo Ab = enzym – ALP, β-galaktosidáza, glukózaoxidáza, křenová peroxidáza,… • Indikační reakce – vznik barevného produktu po přidání substrátu enzymu  EMIT – Enzyme Multiplied Immunoassay Technique – Homogenní kompetitivní enzymová imunoanalýza • Ag a Ag* soutěží o vazebná místa na Ab • Při vzniku imunokomplexu je enzymová aktivita inhibována – Měří se barevný produkt enzymové reakce nezreagovaného konjugátu • Odpadá nutnost separace volného a vázaného konjugátu • Použití – stanovení nízkomolekulárních antigenů a haptenů – peptidové hormony – léčiva,… Enzymoimunoanalýza - EIA  ELISA – Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay • Heterogenní enzymová imunoanalýza – Ab nebo Ag navázány v jamce mikrotitrační destičky – nenavázané složky jsou po každém kroku vymyté • Technika existuje v řadě modifikací • Stanovení širokého spektra analytů – „zlatý standard“ měření jednotlivých proteinů  MEIA – Microparticle EIA • heterogenní enzymová IA – na mikročásticích • Imunokomplex značený enzymem (ALP) – ALP rozkládá fluorogenní substrát Fluoroimunoanalýza - FIA • Ag* nebo Ab* značeny fluoroforem (př. fluorescein) – Po dokončení imuno reakce je fluorofor excitován UV zářením, měří se fluorescence  FPIA – Fluorescence Polarization Immunoassay – homogenní kompetitivní IA • Rozlišení volného a vázaného Ag* je založeno na rozdílné rotaci molekul v roztoku – fluorofor excitován polarizovaným UV světlem – malá molekula volného Ag* rotuje rychle – sekundární záření je depolarizované - Stanovení malých Ag (haptenů) – léky, drogy DELFIA - Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay • Ab* nebo Ag* označeny fluoroforem – chelátem lanthanidu – europium, sammarium, terbium, dysprosium (přednostně Eu) • Po proběhlé imunochemické reakci je Eu vytrženo z komplexu a přeměněno na nový intenzivně fluoreskující chelát – dlouhotrvající fluorescence s velkým Stokesovým posunem – časově modulované měření fluorescence chelátu lanthanidů • omezení interference matrice • Citlivá metoda, heterogenní, kompetitivní i nekompetitivní FIA LIA Luminoimunoanalýza - LIA • Luminiscenční značka – chemiluminofor – emitované záření je výsledkem chemické reakce • Heterogenní analýzy – Pro separaci využívají magnetické částice • LIA - kompetitivní • ILMA – nekompetitivní (sendvič) CMIA (Chemiluminescent Microparticle IA) • Záchytové molekuly (Ab resp Ag) fixovány na povrchu paramagnetických částic • Značení Ag* resp. Ab* acridiniem – oxidace acridinia pomocí H2O2 v alkalickém prostředí – Velmi citlivé metody Luminoimunoanalýza - LIA • Elektrochemiluminiscence – technologie Elecsys (Roche) – Záchytová molekula (protilátka nebo antigen) biotinylována – značení Ag* nebo Ab* = rutenium(II) tris-bipyridylový komplex – kompetitivní nebo sendvičová imunoreakce – přidání mikročástic potažených streptavidinem • celý imunokomplex se váže na pevnou fázi interakcí biotinu se streptavidinem – zachycení mikročástic magnetickým polem na povrchu elektrody – přidání substrátu tripropylaminu (TPA) a přivedení napětí na elektrody • ruthéniový komplex uvolní na elektrodě elektron za vzniku Ru(bpy)3 3+ kationtu - elektrochemiluminiscenční emise Proužkové testy – rychlá imunochemická diagnostika • Imunoafinitní chromatografie • různá uspořádání a průběh imunochemické reakce drogy těhotenský test Multiplexové metody Imunosenzory - citlivý prvek biologického původu + elektronická jednotka → výstupní signál Měření – flow cytometrie Imunohistochemie • vazba protilátek s antigeny ve tkáni Děkuji Vám za pozornost… …sendvič ???