Dusíkaté látky
nebílkovinné povahy
Ing. Martina Podborská, Ph.D.
OKB FN Brno
Zpracováno s pomocí přednášek RNDr. Petra Breineka
Školní rok 2015/2016
 hlavní exkreční orgán
 hlavní fce:
 tvorba a vylučování moče:
 vodorozpustné odpadní a
toxické látky
 produkty metabolismu
 regulační fce udržení
homeostázy
 ovlivňují metabolismus vody
a iontů, osmolalitu a
acidobazickou rovnováhu
organismu
 místem tvorby erytropoetinu
 tvorba aktivní formy vit. D
 k posouzení fce a chorob
ledvin mohou sloužit
následující biochemické
parametry
2 2
Ledviny
Hlavní dusíkaté látky nebílkovinné povahy
Analyt Zdroj Klinický význam
Močovina (urea) Amoniak
• Onemocnění ledvin
• Onemocnění jater
Kreatinin Kreatin • Onemocnění ledvin
Kyselina močová Purinové nukleotidy
• Zvýšený rozpad buněk
• Poruchy metabolismu
purinů
Amoniak Aminokyseliny
• Onemocnění jater
• Onemocnění ledvin
• Dědičné poruchy
urosyntetického cyklu
Aminokyseliny Bílkoviny
• Onemocnění jater
• Onemocnění ledvin
• Dědičné poruchy
metabolismu
aminokyselin 3
 nejčastěji se jedná o odpadní látky, vyjímku tvoří
aminokyseliny
 jako odpadní látky jsou z organismu vylučovány močí
 o jejich účinné exkreci rozhoduje především glomerulární
filtrace
 chorobné stavy, které vedou k jejímu poklesu působí
tzv. retenci těchto dusíkatých látek
 jejich hromadění v organismu vzestup jejich
koncentrace v plazmě vznik tzv. hyperazotémie
 zvláště hodnota močoviny a kreatininu se proto používá
k diagnostice a sledování průběhu ledvinových chorob
4
Hlavní dusíkaté látky nebílkovinné povahy
5
Jaké jsou doporučené metody?
Analyt Referenční metoda
Certifikovaný
referenční materiál
Močovina (urea)
ID-GC/MS
ID-LC/MS
• SRM 909b NIST
• NIST/SRM 912a
Kreatinin
ID-GC/MS
ID-LC/MS
• SRM-NIST 967
• SRM 909b NIST
• NIST/SRM 914a
Kyselina močová
ID-GC/MS
HPLC
• SRM 909b NIST
• NIST/SRM 913a
Cystatin C IFCC/IRMM metoda • ERM DA471/IFCC
6
Močovina (urea)
 je konečným produktem metabolismu bílkovin (aminokyselin) –
detoxikace NH3:
Proteiny
Aminokyseliny a-aminokyselina
Močovinový cyklus (játra) a-ketokyselina + NH3
Močovina (krev moč)
(ledviny)
oxidativní desaminace
Močovina (moč)
7
Močovina (urea)
 vzniká v játrech (cca 16g/d= 0,5-0,7 mol/d) v močovinovém cyklu
(metabolizováním 2,9 g bílkovin vzniká 1g močoviny)
 vylučuje se glomerulární filtrací močí (na rozdíl od kreatininu je
zpětně resorbována), malá část je metabolizována ve střevě
 v proximálním tubulu se zpětně resorbuje 40-50% profiltrované
močoviny, v distálním tubulu závisí resorpce na tom, zda je
vylučována koncentrovaná nebo zředěná moč (dehydratace
organismu se projevuje vzestupem močoviny)
 klinické využití:
 stanovení v séru - diagnostika ledvinových chorob a sledování jejich
průběhu
 stanovení v moči – odhad stupně katabolismu bílkovin u kriticky
nemocných pacientů, sledování dusíkové bilance
8
Močovina (urea)
 koncentrace v krvi závisí na:
 vylučování močoviny ledvinami v moči
 její tvorbě (zvýšený rozpad proteinů horečka, sepse,
hladovění)
 obsah proteinů v dietě
 referenční rozmezí:
 S-močovina: Muži: 2,0-8,3 mmol/l
Ženy: 2,0 – 6,7 mmol/l
 dU-močovina: 167- 583 mmol/24h
9
Močovina (urea)
 zvýšená koncentrace v séru může být také způsobena:
 zvýšeným příjmem bílkovin v potravě
 zvýšeným katabolismem bílkovin u závažně nemocných
pacientů
 zahuštěním vnitřního prostředí při dehydrataci
 snížením glomerulární filtrace při hypovolémii (extrarenální
urémie)
 snížená koncentrace v séru může být také způsobena:
 nízkým příjmem bílkovin v potravě (proteinová malnutrice)
 těžkou poruchou funkce jater - jaterní selhání (nedostatečná
tvorba močoviny)
 hyperhydratací; retencí vody (infuzní léčba, gravidita)
10
Močovina (urea) – metody stanovení
1. Referenční metody:
a) ID-GC/MS a ID-LC/MS
 standardní přidání značené močoviny (izotopová diluce) do
analyzovaného vzorku a následné stanovení kombinací
GC/LC-MS
b) HPLC
 vysokoúčinná kapalinová chromatografie
11
Močovina (urea) – metody stanovení
2. Doporučená rutinní metoda - enzymová:
 kinetický test s ureázou a glutamátdehydrogenázou (GMD):
H2N-CO-NH2 + 2 H2O 2 NH4
+ + CO3
2-
NH4
+ + 2-oxoglutarát + NADH L-glutamát + NAD+ + H2O
 rychlost poklesu koncentrace NADH je přímo úměrná koncentraci
močoviny ve vzorku a měří se fotometricky při 340 nm
ureáza
GLDH
12
Močovina (urea) – metody stanovení
3. Elektrochemické metody (biosenzory):
GEM 4000, IL
13
Kreatinin
 vzniká ve svalové tkáni jako konečný produkt přeměny svalového
kreatinu (dehydratace)
 kreatin vzniká v játrech, pankreatu a ledvinách, podílí se na tvorbě
energie potřebné ke kontrakci svalů
kreatin + ATP kreatinfosfát + ADP (CK)
kreatinfosfát kreatin kreatinin + H2O
14
Kreatinin
 klinické využití:
 stanovení v séru - diagnostika ledvinových chorob a sledování jejich
průběhu
 stanovení v moči – hodnota pro výpočet kreatininové clearance
 koncentrace v séru závisí na:
 na jeho vylučování glomerulární filtrací ledvinami
 na jeho syntéze ze svalového kreatinu (svalová hmota)
 referenční rozmezí:
 S-kreatinin: Muži: 60 – 100 mmol/l
Ženy: 50 – 90 mmol/l
 dU-kreatinin: 8,8 – 15,0 mmol/24h
15
Kreatinin – metody stanovení
1. Referenční metody:
a) ID-GC/MS a ID-LC/MS
 standardní přidání značeného kreatininu (izotopová diluce)
do analyzovaného vzorku a následné stanovení kombinací
GC/LC-MS
 Certifikovaný referenční materiál: SRM-NIST 967
16
Kreatinin – metody stanovení
2. Doporučené rutinní metody - enzymové stanovení:
2.1 Stanovení kreatinu vzniklého z kreatininu:
a) kreatinináza/kreatináza/SOX (sarkosinoxidáza)/POD (peroxidáza)
b) kreatinináza/CK (kreatinkináza)/PK (pyruvátkynáza)/LD
(laktátdehydrogenáza)
2.2 Stanovení amoniaku vzniklého z kreatininu:
 kreatininiminohydroláza/GlDH (glutamátdehydrogenáza)
17
Kreatinin – metody stanovení
2. Doporučené rutinní metody - enzymové stanovení:
2.1 a) Stanovení kreatinu vzniklého z kreatininu:
kreatinin + H2O kreatin (kretinináza)
kreatin + H2O sarkosin + močovina (kreatináza)
sarkosin + H2O + O2 glycin + formaldehyd + H2O2 (sarkosinoxidáza)
H2O2 + 4-aminoantipyrin + fenol chinonmonoiminové barvivo + H2O
(peroxidáza)
 absorbance vzniklého barviva je úměrná koncentraci kreatininu
v analyzovaném vzorku
 reakční uspořádání musí eliminovat endogenní kreatin přítomný
v analyzovaném vzorku
 rušící vliv kyseliny askorbové se odstraňuje přídavkem askorbátoxidázy
(AOX)
18
Kreatinin – metody stanovení
2. Doporučené rutinní metody - enzymové stanovení:
2.1 b) Stanovení kreatinu vzniklého z kreatininu:
kreatinin + H2O kreatin (kretinináza)
kreatin + ATP kreatinfosfát + ADP (kreatinkináza)
ADP + fosfoenolpyruvát pyruvát + ATP (pyruvátkináza)
pyruvát + NADH L-laktát + NAD+ (laktátdehydrogenáza)
 pokles absorbance při 340 nm způsobený úbytkem NADH je úměrný
koncentraci kreatininu v analyzovaném vzorku
19
Kreatinin – metody stanovení
2. Doporučené rutinní metody - enzymové stanovení:
2.2 Stanovení amoniaku vzniklého z kreatininu:
kreatinin + H2O 1-methylhydantoin + NH3
(kreatininiminohydroláza)
NH4
+ + 2-oxoglutarát + NAD(P)H glutamát + H2O + NAD(P)+
(glutamátdehydrogenáza)
 sleduje se spektrofotometricky pokles absorbance NAD(P)H při 340 nm
(optický test), který je úměrný koncentraci kreatininu v analyzovaném
vzorku
 výsledek musí být korigován na obsah přítomného amoniaku
v analyzovaném vzorku
20
Kreatinin – metody stanovení
3. Doporučené rutinní metody – používající Jaffého reakci:
kreatinin + kyselina pikrová komplex kreatinin-kyselina
pikrová
 rychlost tvorby barevného komplexu je přímo úměrná
koncentraci kreatininu v analyzovaném vzorku
 nespecifičnost měření
 reagují: proteiny, ketony, bilirubin, některé léky,…
alkalický
roztok
(NaOH); pH>7
(červenooranžový komplex)
21
Kreatinin – metody stanovení
3. Doporučené rutinní metody – používající Jaffého reakci:
Minimální požadavek pro používání:
 metrologická návaznost (SRM-NIST 967)
 návaznost na referenční metodu (ID-GC/MS)
 matematická korekce (odečet pseudokreatininových chromogenů)
 Jaffého metody v pediatrii jsou pro výpočet eGFR nevhodné
 pro stanovení kreatinu v moči lze považovat metody enzymatické
a Jaffého za rovnocenné
22
Kreatinin – metody stanovení
4. Jiné metody:
a) Elektrochemické metody (biosenzory)
b) HPLC
c) CE
POCT GEM 4000, IL
23
Kyselina močová (2,6,8-trioxypurin)
 u člověka je konečným produktem metabolismu purinů
 puriny jsou součástí nukleových kyselin (DNA), do krve se dostávají z
potravy nebo při rozpadu a obnově buněk těla
 je málo rozpustná a cirkuluje v krvi v hladinách blízkých hodnotě,
při které již není rozpustná (sodná sůl je rozpustnější (uráty))
 u lidí a primátů chybí enzym urikáza, která umožňuje
přeměnu kyseliny močové na lépe rozpustný allantoin
24
Kyselina močová (2,6,8-trioxypurin)
 je vylučována z 1/3 zažívacím traktem a ze 2/3 ledvinami;
není to jen látka odpadní, má význačný antioxidační účinek
 klinické využití: diagnostika hyperurikémie
 dna
 rizikový faktor u aterosklerózy
 léčba cytostatiky (leukémie, lymfomy)
 hyperurikémie jako součást retence dusíkatých látek při renální
insuficienci
25
Kyselina močová (2,6,8-trioxypurin)
 koncentrace v krvi závisí na:
 její produkci - potrava bohatá na maso
 zvýšená produkce např. při zvýšeném rozpadu buněk (leukémie
léčená cytostatiky)
 vylučování ledvinami močí
 referenční rozmezí:
 S-kyselina močová: Muži: 200 – 420 mmol/l
Ženy: 140 – 340 mmol/l
 dU-kyselina močová: 0,5 – 6,0 mmol/24h
26
Kyselina močová – metody stanovení
1. Referenční metody:
a) ID-GC-MS
 standardní přidání značené 1,3-15N kyseliny močové
(izotopová diluce) do analyzovaného vzorku a následné
stanovení GC-MS
 Certifikovaný referenční materiál: SRM 909b NIST, NIST/SRM
913a USA
b) HPLC
27
Kyselina močová – metody stanovení
2. Doporučená rutinní metoda – enzymové stanovení:
 používající enzymy urikázu a peroxidázu:
kyselina močová + O2 + 2H2O allantoin + CO2 + H2O2 (urikáza)
H2O2 + 4-aminoantipyrin + derivát fenolu H2O + chinonmonoiminové
barvivo (peroxidáza)
 barevný komplex je přímo úměrný koncentraci kyseliny močové a
stanovuje se spektrofotometricky v analyzovaném vzorku
28
Kyselina močová – metody stanovení
3. Jiné metody – enzymové stanovení:
 používající enzymy urikázu a katalázu:
kyselina močová + 2H2O + O2 allantoin + CO2 + H2O2 (urikáza)
H2O2 + methanol formaldehyd (kataláza)
formaldehyd + acetylaceton + NH4
+ dihydrolutidin + H2O
 vznik žlutého derivátu dihydrolutidinu - Hantschova
kondenzační reakce (stanovení absorbance při 405 nm)
29
Kyselina močová – metody stanovení
4. Jiné metody – enzymové stanovení:
 používající enzym urikázu /UV metoda:
kyselina močová + 2H2O + O2 allantoin + CO2 + H2O2 (urikáza)
 jedno z absorpčních maxim kyseliny močové je při 293 nm
(UV oblast)
 allantoin vzniklý oxidací kyseliny močové při této vlnové délce
neabsorbuje
 koncentraci kyseliny močové = úbytek absorbance
při 293 nm před a po přidání urikázy k analyzovanému vzorku
30
Kyselina močová – metody stanovení
5. Elektrochemické metody:
 přímá potenciometrie:
 měření úbytku O2 Clarkovou elektrodou po přidání urikázy k
reakční směsi obsahují analyzovaný vzorek
 enzymové elektrody (biosenzory)
31
Kyselina močová – metody stanovení
6. Chemické metody:
 založené na redukčních vlastnostech kyseliny močové:
 redukce kyseliny fosfowolframové v alkalickém prostředí za
vzniku molybdenové modři nebo redukci železitých nebo
měďnatých iontů na železnaté a měďné, které se stanovovují
specifickými činidly (deriváty fenantrolinu nebo kuproinu) za
vzniku barevných komplexů
 všechny tyto metody jsou nespecifické a pro kvantitativní
stanovení kyseliny močové se již nepoužívají
32
Amoniak (NH3)
 amonné kationty NH4
+
 vzniká při degradaci bílkovin (katabolismu aminokyselin;
oxidativní deaminace) ve všech tkáních, především v játrech
(také v ledvinách a svalech).
 nezanedbatelným zdrojem amoniaku je také rozklad bílkovin
bakteriálními enzymy ve střevě
 je toxický, v játrech je přeměňován na močovinu a glutamin
 v mozku a jiných tkáních, které nemají schopnost tvořit močovinu,
se amoniak detoxikuje transaminační reakcí s 2-oxoglutarátem, za
vzniku glutamátu
33
Amoniak (NH3)
 Dva hlavní zdroje amoniaku v organismu:
 dehydrogenační deaminace glutamátu v buňkách
většiny tkání
 bakteriální fermentace proteinů v tlustém střevě
amoniak difuzí přechází do portální krve portální
krev má relativně vysokou koncentraci NH3
odstraněn játry
34
Amoniak (NH3)
 Zvýšená koncentrace v plazmě:
 závažná onemocnění jater (př. selhání jater- akutní nebo
chronické těžké poškození jater)
 snížení průtoku krve játry
 při vrozených poruchách enzymů v močovinovém cyklu
 Reyeův syndrom (vzácné poškození krve, jater a mozku,
většina případů je vyvolána virovou infekcí)
 selhání ledvin
35
Amoniak (NH3)
 Preanalytická fáze:
 stanovení z plazmy (nesrážlivá krev)
 krev se musí po odběru ihned zchladit a zpracovat co nejdříve
(centrifugovat v chlazené centrifuze, do 20 min oddělit plazmu od
krevních elementů), neboť hrozí falešně zvýšené hodnoty
 Referenční rozmezí:
 P-amoniak: 18 – 72 mmol/l
Muži: 15 – 55 mmol/l
Ženy: 11 – 48 mmol/l
 Certifikovaný referenční materiál: není k dispozici
36
Amoniak (NH3) – metody stanovení
1. Referenční metoda: není k dispozici
2. Doporučená rutinní metoda:
2.1 Enzymové stanovení:
 používající enzym GMD (glutamátdehydrogenázu)/UV:
NH4
+ + 2-oxoglutarát + NAD(P)H glutamát + H2O + NAD(P)+
(glutamátdehydrogenáza)
 spektrofotometricky se stanoví pokles absorbance, která je
úměrná množství přeměněného NADH na NAD+ při 340 nm
 pokles absorbance je přímo úměrný koncentraci amoniaku
37
Amoniak (NH3) – metody stanovení
2. Doporučená rutinní metoda:
2.2 Elektrochemické metody (biosenzory):
 přímá potenciometrie
 konduktometrie
 měří se změna potenciálu nebo vodivosti reakční směsi, která je závislá
na množství uvolněných amonných iontů v reakci
3. Jiné metody:
3.1 Chemické metody:
 amoniak reaguje s Nesslerovým činidlem (alkalický roztok jodidortuťnatanu) za
tvorby oranžového zabarvení
 amoniak reaguje s fenolem a chlornanem za vzniku modře zbarveného indofenolu
(Berthelotova reakce)
 metody se již v klinické biochemii nepoužívají
3.2 Mikro-difúzní metoda
38
Aminokyseliny
 Význam stanovení:
 diagnostika dědičných poruch
metabolismu AK (screening)
 monitorování výživy u
nemocných v těžkém stavu
39
Aminokyseliny – metody stanovení
1. Referenční metoda: neuvádí se
2. Chromatografické metody:
 Ionexová chromatografie
 HPLC
 GC po převedení aminokyselin na těkavé deriváty
 TLC používaná jako semikvantitativní metoda
 pro analýzu většího spektra aminokyselin se používají automatické
analyzátory aminokyselin
3. Elektroforetické metody
4. Jednoduché chemické reakce
5. Imunoanalytické metody (viz. stanovení homocysteinu)
6. Techniky DNA
40
Homocystein
 neesenciální sirná aminokyselina
 není součástí tělesných bílkovin
 vzniká v organismu při přeměně methioninu (Met) na cystein(Cys) jako
degradační produkt S-adenosylmethioninu (donor
merhylenové skupiny)
Převzato z: http://www.cardiovitamin.com/en/physicians/
 nezávislý rizikový faktor:
 kardiovaskulární onemocnění
 periferní vaskulární onemocnění
(arteriální i žilní trombóza)
 cerebrovaskulární onemocnění
 opakované ztráty plodu
Rizikový faktor je přibližně
stejný jako u hyperlipidémie a
kouření.
41
Homocystein
 Referenční rozmezí:
 P-homocystein: 5 – 15 mmol/l
 Certifikovaný referenční materiál: NIST SRM 1955
 Metody stanovení:
1. HPLC
2. Imunochemické metody
3. Enzymové metody
4. GC-MS
42
Homocystein – metody stanovení
1. HPLC (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie)
 deproteinace
 redukce
 deprivatizace
 analýza
 detekce (fluorometrická)
43
Homocystein – metody stanovení
2. Imunochemické metody
 redukce oxidovaných forem (např.1,4-dithio-D,L-threitol)
 enzymatická přeměna homocysteinu
na S-adenosylhomocystein
 kompetitivní imunochemická reakce se specifickou
monoklonální protilátkou
 detekce
 Další metody: ELISA,imunoturbidimetrie, chemiluminiscence,…
44
Homocystein – metody stanovení
3.1 Enzymová metoda („cyklická“):
Hcy + L-serin cystathionin (CBS - cystathion β-syntáza)
cystathionin pyruvát + amoniak + Hcy (BBL - cystathion βsyntáza
)
pyruvát + NADH L-laktát + NAD+ (LD - laktátdehydrogenáza)
 spektrofotometrické stanovení - pokles absorbance při 340 nm
45
Homocystein – metody stanovení
3.2 Enzymová metoda („cyklická“) – Roche:
 nejdříve je oxidovaná forma Hcy redukována na volný Hcy
Hcy + SAM SAH + Met
HMTasa (homocystein-S-methyltransferáza)
SAH Hcy + Adenosin
SAHasa (SAH hydroláza)
Adenosin Inosin + NH3
ADA (adenosindeamináza)
NH3 + NADH + 2-oxoglutarát glutamát + NAD+ + H2O
GIDH
 spektrofotometrické stanovení - pokles absorbance při 340 nm
SAM (S-adenosylmethionin), SAH (S-adenosyl-homocystein), Hcy (Homocystein),
Met (Methionin), GlDH (Glutamátdehydrogenáza)